朱日，陳笑宇，李冬冬，趙詩(shī)聰，吳香婷，劉英鏈，楊錦竹※，金向群※

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林省正和藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，吉林 通化 134001）

元和正胃片由通化正和藥業(yè)有限公司研制生產(chǎn)，收錄于局頒藥品標(biāo)準(zhǔn)[標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：WS-10993（ZD-0993）-2002]。處方由龍膽、大黃、甘草、木香、丁香等7 味中藥和碳酸氫鈉組成。工藝為木香300 g、丁香20 g、薄荷25 g 用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油6 h，蒸餾后水溶液及揮發(fā)油備用；藥渣加水煎煮2 h，濾過，濾液備用；大黃300 g、龍膽300 g、延胡索200 g、甘草200 g 加水煎煮2 次，每次2 h 時(shí)，分次濾過，合并濾液，與上述蒸餾后的水溶液及水煎液合并，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.30~1.35（60~70 ℃）的稠膏，干燥，粉碎成細(xì)粉，加入碳酸氫鈉粉末600 g，混勻，上述揮發(fā)油用少量乙醇溶解，均勻噴入，混勻，壓片，制成1 000 片，即得。本品為棕褐色片劑，氣香、味咸、微苦。主要用于治療胃痛、胃脹反酸、飲食積滯、消化性潰瘍等。處方中的龍膽有降胃氣、清胃熱、補(bǔ)胃汁的功效[1]，能促進(jìn)膽汁及胃液的分泌[2]；大黃作為瀉下藥的代表，常用于胃火熾盛、腸道積滯、便秘等癥狀[3]；甘草中有效成分具有抗胃癌作用[4]，甘草水提物能夠恢復(fù)細(xì)胞周期，促進(jìn)腸隱窩細(xì)胞增殖，有效修復(fù)消化道潰瘍[5]，同時(shí)具有治療脾胃虛弱、咳嗽痰多的作用[6]；木香促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)、停止腹瀉、利膽和抗?jié)兊茸饔肹7]；丁香促進(jìn)消化系統(tǒng)功能等[8]，均為該方中起主要藥理作用的組分?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)包括大黃素、大黃酚、丁香酚和延胡索的鑒別以及碳酸氫鈉、大黃素和大黃酚含量的測(cè)定，但未對(duì)甘草或其有效成分進(jìn)行鑒別或測(cè)定。本研究建立元和正胃片中甘草的TLC 鑒別和甘草苷、甘草酸含量測(cè)定的方法，為元和正胃片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

S3000 型高效液相色譜儀（華譜科技有限公司）；InertSustainSwift-C1（84.6 mm 250 mm，5m）色譜柱（島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司）；KQ-250DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司）；TDL-40B離心機(jī)（華譜科技有限公司）；SZ-9B 自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；BT 25s 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試劑與材料

元和正胃片（0.75 g/片，批號(hào)210804、211102、211206，吉林省正和藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供）；甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)110731-201619，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甘草苷對(duì)照品（批號(hào)111610-201106，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甘草對(duì)照藥材（批號(hào)120904-201620，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；Gf254 硅膠板（批號(hào)20210118，青島海洋化工有限公司）；乙腈、磷酸為色譜純；水為雙蒸水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草的TLC鑒別

取元和正胃片10 片，研磨成粉末，取粉末約6 g，加入70%乙醇溶液30 mL，超聲處理（功率250 W）30 min，離心，取上清液，通過微孔濾膜過濾，作為供試品。按處方用量制備甘草陰性樣品，同法制得陰性樣品溶液。取甘草對(duì)照藥材0.5 g，同法配制對(duì)照藥材溶液。取甘草酸銨對(duì)照品，加70% 乙醇制成每1 mL 含0.5 mg（含甘草酸0.489 9 mg）的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各5L，點(diǎn)于同一硅膠Gf254 板上，以正丁醇水 乙酸（6:3:1）的上層溶液作為展開劑[9]，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，結(jié)果見圖1。供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾。

圖1 TLC 圖譜Fig.1 TLC chromatogram

圖2 HPLC 圖譜Fig.2 HPLC chromatograms

2.2 甘草苷、甘草酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：InertSustainSwift-C18 柱（4.6 mm 250 mm，5m），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫（0~30 min，15 %A；30~33 min，15%~32%A；33~65 min，32%A；65~80 min，32%~38%A；80~90 min，38%~90%A）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10L。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取甘草苷、甘草酸銨（甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量0.979 7）對(duì)照品，加70%乙醇制成濃度分別為0.024、0.102 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取元和正胃片研磨成粉末，取約4 g，加入70%乙醇溶液30 mL，稱重，超聲振動(dòng)（功率250 W）30 min，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方稱取其余藥材和碳酸氫鈉，提取、制粒得到甘草陰性樣品。按“2.2.3”方法進(jìn)行處理，得到陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性考察 將“2.2”各溶液用微孔濾膜過濾，注入HPLC 儀器中進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1。由圖譜可知，甘草苷、甘草酸與其他峰分離良好，陰性樣品對(duì)目標(biāo)成分的測(cè)定無干擾。

2.2.6 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”混合對(duì)照品溶液，用70%乙醇逐級(jí)稀釋，得到甘草苷濃度為0.024 mg/mL、0.018 mg/mL、0.012 mg/mL、0.009 mg/mL、0.006 mg/mL、0.003mg/mL（對(duì)應(yīng)甘草酸銨濃度為0.102mg/mL、0.0765 mg/mL、0.051 mg/mL、0.038 25 mg/mL、0.025 5 mg/mL、0.012 75 mg/mL）的系列混合對(duì)照品溶液。依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，甘草苷、甘草酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到甘草苷的回歸方程為y=24 576x+11.782，R2=0.999 6，線性范圍為0.003~0.024 mg/mL；甘草酸的回歸方程為y=4651.9x+23.476，R2= 0.999 7，線性范圍為0.012 49~0.099 93 mg/mL。甘草苷和甘草酸在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定6次，甘草苷、甘草酸峰面積的RSD值分別為0.67%、0.43%，表明精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液置于室溫，在0、2、4、8、12、24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，甘草苷、甘草酸峰面積的RSD 值分別為1.26%、0.48%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取批號(hào)211102 樣品，平行制備6份供試品，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得RSD 值分別為1.45%、1.06%（n=6），說明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 平行稱取批號(hào)為211102 的樣品6 份，每份約2 g，計(jì)算甘草苷、甘草酸的含量。再分別加入約等量的對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備測(cè)定，記錄各樣品中甘草苷、甘草酸的峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。甘草苷的平均回收率為99.01%，RSD =1.53%；甘草酸的平均回收率為99.26%，RSD=0.93%。RSD 均小于2%，表明該方法回收率良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of recovery test

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取不同批次元和正胃片3 份（批號(hào)分別為210804、211102、211206），按“2.2.3”方法處理后測(cè)定，計(jì)算甘草苷、甘草酸含量。3 批次樣品中甘草苷的含量依次為0.054 2 mg/片、0.053 5 mg/片、0.055 4 mg/片，RSD 為1.77%；甘草酸的含量依次為0.293 1 mg/片、0.297 mg/片、0.288 9 mg/片，RSD 為1.38%。表明不同批次的元和正胃片中甘草苷、甘草酸含量基本一致，均一性良好。根據(jù)上述結(jié)果，將標(biāo)準(zhǔn)定為測(cè)定值的80%，暫定元和正胃片中甘草苷的含量標(biāo)準(zhǔn)為≥0.04 mg/片，甘草酸的含量標(biāo)準(zhǔn)為≥0.24 mg/片。

3 討論

本研究建立了元和正胃片中甘草的TLC 鑒別和甘草苷、甘草酸含量測(cè)定的方法，可以更好地控制其質(zhì)量。在甘草的TLC 鑒別中，采用Gf 254 硅膠板，并以正丁醇-水-乙酸的上層溶液為展開劑，在該條件下，樣品只需超聲離心即可，無需藥典中多次萃取與洗滌步驟，方便高效，且圖譜斑點(diǎn)清晰，可為含甘草制劑的薄層鑒別提供參考。

甘草酸有一對(duì)異構(gòu)體，即18 -和18 -甘草酸[10-12]，含量測(cè)定時(shí)一般以甘草酸銨作為對(duì)照品，根據(jù)分子質(zhì)量（甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量0.979 7）換算甘草酸含量[13-15]。本研究也選用甘草酸銨對(duì)照品，選擇2020版藥典方法中的237 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在試驗(yàn)過程中，比較了乙腈-0.1%磷酸和乙腈-0.05%磷酸兩個(gè)酸性流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)二者效果基本無差別，為減小對(duì)色譜柱的損傷，最終選用乙腈-0.05%磷酸作為流動(dòng)相。元和正胃片處方中藥材較多，成分復(fù)雜，雜質(zhì)干擾較大，采用藥典的梯度無法將甘草苷和甘草酸的峰與其他成分分離。通過調(diào)整流動(dòng)相的比例，延長(zhǎng)出峰時(shí)間，并進(jìn)行梯度洗脫，使甘草苷和甘草酸的峰落在基線上，且分離度良好。對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，滿足含量測(cè)定的要求，可用于元和正胃片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。