呂俊峰 董文宇 李琦 陳書民 陶慶樹 曹兵 田野

摘 要：沙門氏菌是一種寄生在人和動物小腸內(nèi)的革蘭氏陰性直桿菌，可引起急性或慢性人獸共患傳染病。本試驗通過對山東地區(qū)7個地級市共69個養(yǎng)雞場進(jìn)行隨機采樣，利用PCR擴增沙門氏菌目的基因和血清凝集試驗的方法對沙門氏菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，從山東省各地級市養(yǎng)雞場采集的2050份樣品中共檢測出沙門氏菌陽性樣品18份，分離菌鑒定均為雞白痢沙門氏菌，并對陽性菌株進(jìn)行培養(yǎng)純化，利用K-B紙片法檢測沙門氏菌對氨芐西林、西諾沙星、磺胺異噁唑等11種藥物的敏感性。本研究可供山東地區(qū)養(yǎng)殖場參考，對沙門氏菌的防控和治療具有重大意義。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌；PCR；血清學(xué)檢測；藥敏試驗

沙門氏菌是一種寄生在人和動物小腸內(nèi)的革蘭氏陰性腸直桿菌，血清型超過2 500種，無芽孢和莢膜，兼性厭氧，其生長對培養(yǎng)基要求不高，普通營養(yǎng)型瓊脂培養(yǎng)基就可以生長[1]，菌落為圓形淡黃色的小菌落，表面稍微隆起、濕潤、光滑半透明、邊緣生長整齊，易于識別；多數(shù)單個存在，少數(shù)呈兩個或多個黏連在一起。在SS瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，菌落呈現(xiàn)無色透明的形態(tài)，若和硫化氫接觸則呈現(xiàn)為中心黑色的菌落[2]。沙門氏菌感染嚴(yán)重危害著畜禽養(yǎng)殖業(yè)和人類的公共衛(wèi)生安全。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和陽性菌株

樣品來源于山東省臨沂、濟寧等七個地級市的69個家禽養(yǎng)殖場，采集肝、脾、腎等臟器和雞血液，陽性菌株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所禽病研究室分離保存，并標(biāo)記備用。

1.2 試劑耗材

RNA提取試劑盒，購自杭州Axygen科技有限公司；PCR試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；雞白痢染色平板凝集試驗抗原，購自北京擎科生物科技有限公司；抗生素藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 取待檢雞的肝、脾、腎等內(nèi)臟器官，無菌采取各臟器5～10 g。將所取組織器官放入勻漿杯內(nèi)按一定比例加入PBS緩沖液（pH 7.2）研磨。待勻漿杯內(nèi)的組織器官完全打碎和PBS混勻后，將勻漿杯內(nèi)的液體倒入1.5 mL離心管，8 000 rpm離心5 min取上清300 μL。放入-80℃冰箱內(nèi)反復(fù)凍融2次備用。

1.3.2 細(xì)菌的分離 將接種環(huán)在酒精燈上燒至變紅，待冷卻后插入肝臟旋動幾周，在TSA血清培養(yǎng)基上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取單一菌落在TSA培養(yǎng)基上劃線進(jìn)行純化培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。

1.3.3 細(xì)菌的鑒定

1.3.3.1 革蘭氏染色鑒定 用接種環(huán)挑取經(jīng)過純化培養(yǎng)的單一菌落，涂抹到滴加有5 μL生理鹽水的載玻片上，混勻后涂抹均勻，滴加結(jié)晶紫染色液染色2 min，沖洗干凈；碘液染色1 min，沖洗干凈；95%酒精脫色30 s，沖洗干凈；番紅復(fù)染2 min，沖洗干凈；然后用吸水紙將多余的水分吸干，干燥10 min，在油鏡下觀察。

1.3.3.2 PCR擴增 將分離純化培養(yǎng)的菌株用10 μL的槍頭挑取單菌落，稀釋于裝有10 μL ddH20的離心管中混合均勻，離心后的上清作為模板進(jìn)行PCR擴增，向離心管中加入雞白痢沙門氏菌鑒別PCR引物（表1）。

上述引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照設(shè)計好的雞白痢沙門氏菌25 μL反應(yīng)體系加入各組分（表2）。

將配備好體系的待鑒定樣品按照設(shè)計好的雞白痢沙門氏菌PCR反應(yīng)體系對目的基因進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)條件見表3。

擴增后的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，出現(xiàn)條帶的PCR產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司測序。

1.3.3.3 細(xì)菌血清學(xué)鑒定 玻片凝集試驗：取潔凈玻片一張，分為3格并標(biāo)號，無菌環(huán)境下將雞白痢染色抗原震蕩均勻，吸取30 μL雞白痢染色抗原垂直滴加至各個格子上。在第1個格子滴加雞白痢標(biāo)準(zhǔn)陽性血清30 μL，第2個格子滴加陰性血清30 μL，第3個格子滴加待鑒定樣品30 μL，吸取待鑒定雞血液50 μL滴加在抗原液滴上，將待鑒定雞的血液與抗原混勻并攤開直徑約2 cm左右的薄層，輕輕晃動玻片，2 min后觀測結(jié)果并記錄。判定標(biāo)準(zhǔn)為：雞白痢沙門氏菌染色抗原和血清混合后2 min內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀沉淀為陽性，圓滑的水滴狀或均勻分布無沉淀為陰性。

高通量血清學(xué)鑒定沙門氏菌：吸取研磨離心后的病料祥本30 μL于雞白痢血凝抑制平板上，吸取雞白痢多價染色平板凝集試驗抗原30 μL滴在樣本液滴上，2 min后觀察結(jié)果。若呈現(xiàn)出藍(lán)色的顆粒狀沉淀則為陽性；若仍為均勻的水滴狀或乳狀無沉淀則為陰性。陽性樣本應(yīng)進(jìn)行復(fù)測，以排除病料組織小碎渣或假陽性的干擾。

1.3.4 細(xì)菌的耐藥性檢測

1.3.4.1 細(xì)菌的培養(yǎng) 用10 μL槍頭挑取分離純化培養(yǎng)的單一菌落放在LB液體培養(yǎng)基中，混合均勻，將培養(yǎng)基放入振蕩培養(yǎng)箱中，在37℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)12 h備用。

1.3.4.2 涂板和藥敏片的貼置 吸取培養(yǎng)后的LB液體培養(yǎng)基200 μL，放入LB固體培養(yǎng)基上涂抹均勻，用無菌鑷子夾取藥敏片貼在培養(yǎng)備用的培養(yǎng)基上，每個藥敏片間距≥15 mm，輕輕按壓防止脫落，每個平板貼4～5片。藥敏片貼置情況如表4所示。貼好后在恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h。將達(dá)到時間的培養(yǎng)基放在深色背景下，用游標(biāo)卡尺測量各種藥敏片抑菌圈的直徑，并同美國FDA認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)（表5）進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離和鑒定

在普通營養(yǎng)瓊脂上肉眼觀察沙門氏菌菌落的形態(tài)：菌落的表面光滑，邊緣整齊，表面有稍微的隆起，顏色半透明。如圖1所示。

上述分離菌經(jīng)過革蘭氏染色、顯微鏡下觀察，視野中呈現(xiàn)出單一、形態(tài)均勻、兩端平滑鈍圓的短桿狀粉紅色小桿菌，初步判斷為沙門氏菌。如圖2所示。

用10 μL槍頭挑取疑似沙門氏菌的樣本，利用PCR擴增目的基因，通過瓊脂糖漿電泳成像系統(tǒng)觀察到目的條帶大小約為200 bp（圖3）。本試驗通過PCR擴增鑒定的2 050份樣本中，共檢測并分離出18株雞白痢沙門氏菌菌株。

2.2 測序結(jié)果

將分離的18株沙門氏菌進(jìn)行測序，結(jié)果見圖4。

從檢測報告分析結(jié)果可以看出，測序檢測片段覆蓋率為94%，樣本同源性100%符合雞白痢沙門氏菌基因序列。

2.3 血清學(xué)鑒定結(jié)果

試驗對2 050份樣本進(jìn)行高通量的血清學(xué)試驗，檢測結(jié)果有18份陽性血清，陽性占比為0.87%，血清型全為雞白痢沙門氏菌。高通量血清學(xué)鑒定結(jié)果示例具體情況如圖5雞白痢沙門氏菌血清學(xué)試驗所示。

2.4 樣品檢測結(jié)果

從山東省臨沂市、泰安市、日照市、濟寧市等7個地級市的69個養(yǎng)殖場共采集的2 050份樣本中共分離出18株雞白痢沙門氏菌。陽性數(shù)和陽性率結(jié)果如表6所示。

2.5 沙門氏菌藥物敏感性試驗結(jié)果

選取1株感染率最高的沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗。通過測量不同種藥物抑菌圈的直徑大小來判定沙門氏菌對藥物的敏感程度。將測出的抑菌圈大小和美國FDA臨床微生物實驗室2017年發(fā)布的耐藥性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對，判定結(jié)果如表7所示。

3 討論與結(jié)論

沙門氏菌是一種寄生在人和動物小腸內(nèi)的革蘭氏陰性腸直桿菌，在自然界隨處可見，是引起人獸共患傳染病的重要細(xì)菌。沙門氏菌感染在臨床上多表現(xiàn)為敗血癥、腸炎、腹瀉等，以生殖系統(tǒng)感染為主，公雞表現(xiàn)為睪丸炎，母雞表現(xiàn)為卵泡變形、輸卵管堵塞伴發(fā)炎癥等，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量減少、產(chǎn)蛋率降低、蛋受精率降低、孵化率和健康育雛率下降[3]，嚴(yán)重時可引起公雞睪丸極度萎縮，母雞卵巢破裂，導(dǎo)致死亡[4]。雞白痢沙門氏菌病可進(jìn)行水平傳播和垂直傳播。目前在我國，雞白痢沙門氏菌病仍然對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展有著巨大的危害。

本研究對山東地區(qū)7個地級市（濟南、德州、日照、臨沂、泰安、濟寧、東營）共69個大小家禽養(yǎng)殖場的2 050份樣品進(jìn)行分離鑒定，得到18株雞源性沙門氏菌，分離率為0.87%，分離出的18株雞源性沙門氏菌經(jīng)鑒定為雞白痢沙門氏菌。

用K-B紙片法對分離出的沙門氏菌進(jìn)行11種藥物敏感性試驗，結(jié)果顯示沙門氏菌對這11種藥物有不同程度的敏感性，對阿米卡星、頭孢噻污、頭孢他啶、氟苯尼考、茶啶酸為低敏感度，對強力霉素、左氟沙星、慶大霉素、多粘菌素、磺胺異噁唑、氨芐西林為高敏感度。趙建梅等[5]和李雪等[6]對沙門氏菌耐藥性的結(jié)果研究分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)沙門氏菌對藥物的敏感程度存在差異，且沙門氏菌對不同藥物均存在一定的耐藥性。因此，加強對畜禽養(yǎng)殖過程中抗生素使用的管控，在對沙門氏菌的治療中建議采用氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類藥物進(jìn)行治療。

參考文獻(xiàn)：

[1] 查華. 華東地區(qū)雞白痢沙門氏菌的分離鑒定、分子流行病學(xué)及致病性研究[D].揚州：揚州大學(xué)，2013.

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[3] 吉尚雷，劉欣，劉立英，等.肉雞源沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2021（06）：72-74.

[4] 謝寶年.雞白痢的危害與防控措施[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2011（09）：2-3..

[5] 趙建梅，李月華，張青青. 2008～2017年我國部分地區(qū)禽源沙門氏菌流行狀況及耐藥分析[J].中國動物檢疫，2019，36（08）：27-35.

[6] 李雪，孫堅，廖曉萍.山東地區(qū)禽源沙門氏菌的耐藥基因流行性調(diào)查及分析[J].中國家禽，2015，37（18）：63-65.

Abstract：? ?Salmonella is a Gram-negative Enterobacter parasitic in the small intestine of humans and animals， which can cause acute or chronic zoonotic infectious diseases. In this experiment， chickens from 69 farms in 7 prefecture-level cities in Shandong were randomly sampled，and Salmonella was identified by PCR amplification of 16S rRNA gene and serum agglutination test. The results showed that 18 salmonella positive samples were isolated from 2 050 samples collected from farms in various prefecture-level cities in Shandong Province. All of them were identified as Salmonella pullorum.The purpose of this experiment is to observe the electrophoresis image of agar syrup by PCR test， and to culture and purify the positive strains.The sensitivity of Salmonella to 11 drugs such as ampicillin， cinoxacin and sulfaisoxazole is detected by K-B paper method. This study can be used as a reference for large and small farms in Shandong，and it is of great significance for the prevention， control and treatment of salmonella.

Keywords： Salmonella；PCR；Serological detection；Drug sensitivity test