李雙花,周 俊,游 平,黃愛軍,易 龍

(贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/國家臍橙工程技術(shù)研究中心,江西贛州,341000)

柑桔衰退病是由柑桔衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)引起的對柑桔產(chǎn)業(yè)具有毀滅性危害的一種病毒病害,嚴(yán)重影響柑桔產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。柑桔衰退病已在美洲、亞洲、非洲、歐洲、太平洋及地中海地區(qū)等區(qū)域的50多個國家或地區(qū)發(fā)生,保守估計全世界柑桔產(chǎn)業(yè)因衰退病爆發(fā)和流行造成的損失已達數(shù)億美元,并且徹底改變了柑桔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向[1]。CTV是長線形病毒科(Closteroviridae)長線形病毒屬(Closterovirus)中的一員,是世界上已知的、最大的植物病毒,其基因組長約19.3 kb,擁有12個開放閱讀框,5’端和3’端各有1個非編碼區(qū),編碼至少19種蛋白質(zhì)[1-3]。CTV主要通過染病的接穗嫁接和苗木調(diào)運擴散,其不能經(jīng)種子傳播。在自然條件下,CTV可以通過介體蚜蟲以半持久性方式進行傳播,其中褐色桔蚜的傳播效率最高[4]。根據(jù)CTV在不同寄主上引起不同的癥狀,將其分為苗黃型(Seeding yellow,SY)、速衰型(Quick decline,QD)和莖陷點型(Stem pitting,SP)[1,5]。CTV存在復(fù)雜的株系分化,已報道的CTV基因型有11種:T3、VT、T36、RB、T68、T30、HA16-5、A18、S1、L1、M1[6-11]。不同柑桔寄主對不同基因型CTV侵染的敏感度存在較大差異,酸橙、甜橙和柚等柑桔種類對T3、VT、T36、T68較為敏感[6-8],而枳及其雜交種對大部分基因型具有抗性[12]。同時,CTV不同基因型的致病性存在一定差異,VT、T3、T68基因型可誘發(fā)莖陷點癥狀,T36基因型主要引起酸橙砧木的速衰型衰退病,S1和T30基因型一般不引起癥狀[5,6],但隨著RB基因型突破了枳的抗性[13],并在枳上鑒定到L1和M1兩種新基因型[11],表明CTV種群仍處于擴張期,這對于抗性品種培育和防治策略研制帶來了新的挑戰(zhàn)。

最近,本課題組從來自湖南江永的一份道縣野桔上得到一株CTV分離物,根據(jù)序列多樣性和遺傳演化分析,推定其歸屬一種新的基因型,將其命名為JY(Genbank登錄號為ON094625)。為了明確JY基因型在我國的發(fā)生情況及其遺傳多樣性,對在湖南江永、湖南道縣、湖南宜章(莽山)和江西崇義地區(qū)采集的野生柑桔樣品,以及福建、浙江、廣東、廣西、湖北、重慶、四川、江西和湖南采集的栽培柑桔樣品進行RT-PCR檢測,分析ORF1b、p33、p25、p23基因序列的多樣性,測定JY基因型種群內(nèi)和種群間的遺傳分化系數(shù)(Fst),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。本研究結(jié)果將有助于明確JY基因型的遺傳特性和進一步探索CTV基因型的多樣性,為探明CTV的遺傳演化提供幫助。

1 材料與方法

1.1 柑桔材料及試劑

在湖南的江永(東經(jīng)111.34082°、北緯25.27233°)、宜章(莽山,東經(jīng)112.59467°、北緯24. 56694°)、道縣(東經(jīng)111.60195°、北緯25.52766°)及江西的崇義(東經(jīng)114.30835°、北緯25.68186°)分別采集道縣野桔(Citrusdaoxianensis)、莽山野桔(C.mangshanensis)和崇義野桔(C.reticulata)樣品共358份,各樣品采集地的生長環(huán)境見圖1。另外,從福建、浙江、廣東、廣西、湖北、重慶、四川、江西和湖南(JY-2采集地附近栽培果園)等柑桔主產(chǎn)區(qū)采集的1 439份栽培柑桔樣品。

圖1 野生柑桔樣品生長環(huán)境示例

RNAiso Plus總RNA提取試劑、TaqDNA polymerase、10×TaqBuffer、T載體和DH5α感受態(tài)細胞購自購自大連寶生物公司(TaKaRa)。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自普洛麥格(Promega)公司。dNTPs、DNA Marker、DNase/RNase Free ddH2O和DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)CTV JY-2分離物(Genbank登錄號為ON 094625)全長序列設(shè)計JY基因型的檢測引物及ORF1b、p33、p25、p23基因序列擴增引物(表1),引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 柑桔衰退病毒JY基因型檢測所用引物的信息

1.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取柑桔葉片葉柄及中脈約0.1 g,利用RNAiso Plus(TaKaRa)提取總RNA,具體操作方法參照試劑盒說明書。利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific,USA)檢測總RNA濃度和純度,RNA樣品保存于-80 ℃冰箱。以1 μL總RNA為模板,以隨機六聚體(6N)為引物,按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶推薦方法進行體系配制,在 37 ℃條件下反應(yīng)60 min合成cDNA,20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增及克隆測序

PCR反應(yīng)體系(25 μL):10 ×TaqBuffer(含Mg2+)4.5 μL,dNTPs 2.0 μL,上、下游引物(F/R)各0.5 μL,cDNA 1 μL,TaqDNA polymerase 0.4 μL,ddH2O 16.1 μL。PCR擴增程序為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,退火溫度30 s,72 ℃ 60 s/kb,35個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

參照DNA凝膠回收試劑盒方法,將擴增到的預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物回收。將回收的目的片段連接到pMD-19 T載體中,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落進行培養(yǎng),通過PCR擴增篩選陽性單克隆4～6個,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 遺傳多樣性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

用MAFFT[14]軟件進行序列比對,通過Lasergene[15]序列分析軟件包中的MegAlign進行序列同源性分析。運用Dnasp[16]計算核苷酸多樣性、核苷酸分散度、種群間的遺傳分化系數(shù)(Fst)[17]和進行Tajima’s D檢驗,分析種群內(nèi)及種群間的核苷酸差異。以GenAIEx[18]軟件對CTV種群進行分子變異分析及主成分分析。應(yīng)用MEGA 7.0[19]軟件構(gòu)建單個基因序列的ML系統(tǒng)發(fā)育樹,參數(shù)設(shè)置為1 000 bootstrap重復(fù)。另外將比對好的各基因序列由Seqkit[20]軟件進行拼接后,用MEGA軟件構(gòu)建4個基因序列的聯(lián)合ML樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTV及JY基因型發(fā)生情況

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),各地栽培柑桔樣品CTV陽性檢出率:福建50.6%,浙江33.3%,廣東100%,廣西48.6%,湖北100%,重慶50.5%,四川59.3%,江西34.1%,湖南47.1%。各地野生柑桔樣品CTV陽性檢出率:崇義51.1%,道縣22.4%,莽山43.1%,江永32.6%(見表2)。對所有的CTV陽性樣品進行JY基因型檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅江永的道縣野桔樣品中檢測出JY基因型(見圖2)。以上結(jié)果說明CTV在我國栽培柑桔產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,且野生柑桔也感染了CTV,但JY基因型僅分布于少數(shù)地區(qū)。

表2 野生柑桔和栽培柑桔上柑桔衰退病毒及JY基因型的檢測結(jié)果 個

注:M為DNA 2 000 marker,PC為陽性對照,NC為陰性對照,WC為水對照,1—15為檢測樣品。

圖3 柑桔衰退病毒野生柑桔種群與栽培柑桔種群主成分分析結(jié)果

2.2 JY基因型分離物遺傳特征

2.2.1 序列多樣性分析 將獲得的12個JY分離物的ORF1b、p33、p25、p23基因序列與JY-2的對應(yīng)基因序列進行相似性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各分離物ORF1b、p33、p25的核苷酸(nt)和氨基酸(aa)序列相似性非常高:ORF1b基因nt相似性為99.8%～100%,aa相似性為99.8%～100%;p33基因nt相似性為99.0%～100%,aa相似性為98.3%～100%;p25基因nt相似性為99.7%～100%,aa相似性為100%。與ORF1b、p33、p25相比,p23具有較高的多樣性,nt相似性為96.8%～100%,aa相似性為97.1%～100%?？傮w而言,JY分離物之間4個基因序列相似性均較高。說明,JY基因型種群內(nèi)的遺傳變異較少,種群較為穩(wěn)定。

進一步將所有JY分離物的ORF1b、p33、p25、p23基因序列與CTV各基因型代表分離物的對應(yīng)基因序列進行序列相似性比對分析,結(jié)果顯示JY分離物ORF1b、p33、p25、p23基因序列與CTV各基因型代表分離物的平均核苷酸序列相似性分別為79.2%～92.7%、80.8%～85.9%、90.5%～93.6%、87.5%～91.8%,而平均氨基酸序列相似性分別為89.5%～98.1%、80.8%～84.4%、93.7%～97.3%、85.4%～91.6%(見表3)。說明,JY基因型分離物ORF1b、p25蛋白氨基酸序列較p33、p23蛋白保守。另外,與CTV JY-2基因組全長序列分析結(jié)果一致[21],ORF1b、p33基因序列與CN-M1-ZT1分離物相似性最高,而p25、p23基因序列與A18分離物相似性最高(見表3)。

表3 柑桔衰退病毒JY基因型分離物與其他基因型代表分離物在4個基因序列上的平均核苷酸和氨基酸序列一致性 %

2.2.2 遺傳分化與種群動態(tài)分析 為進一步明確JY分離物與現(xiàn)存已報道的CTV基因型分離物之間的遺傳分化程度與種群動態(tài),運用Dnasp計算核苷酸多樣性、核苷酸分散度、種群間遺傳分化系數(shù)(Fst)和進行Tajima’s D檢驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ORF1b、p33、p25、p23基因的核苷酸多樣性分別為0.121 53、0.119 22、0.061 36和0.076 28,說明CTV種群ORF1b、p33基因的核苷酸多樣性顯著高于p23、p25基因;ORF1b、p33、p25、p23基因的Tajima’s D檢驗值分別為-0.263 15、-0.747 63、-0.878 30和-0.355 29,但差異不顯著(p>0.1),表明CTV種群可能處于擴張趨勢中。JY基因型分離物與CTV其他基因型分離物之間,在ORF1b、p33、p25、p23等4個基因上的Fst均大于0.25(見表4)。這說明JY基因型與CTV其他基因型存在明顯的遺傳分化。另外,核苷酸分散度分析結(jié)果顯示,JY分離物與VT、T30、T3、T68、S1、T36分離物ORF1b基因的Ks(Silent)和Ks(JC-Silent)較高,分別為0.177 95～0.206 36和0.203 13～0.241 33;JY分離物與RB、VT、T30、T3、T68、S1、T36分離物p33基因的Ks(Silent)和Ks(JC-Silent)較高,分別為0.167 85～0.189 05和0.190 01～0.217 83;JY基因型分離物與CTV其他基因型分離物p25、p23的核苷酸分散度較低,p25的Ks(Silent)和Ks(JC-Silent)分別為0.079 11～0.090 84和0.083 60～0.096 83,p23的Ks(Silent)和Ks(JC-Silent)分別為0.083 88～0.117 34和0.088 96～0.127 60(見表4)。這說明JY分離物與CTV其他基因型遺傳分化來自O(shè)RF1b和p33基因的貢獻高于p23和p25基因。

表4 柑桔衰退病毒JY基因型分離物與其他基因型分離物在4個基因上的核苷酸分散度及遺傳分化系數(shù)(Fst)

2.2.3 分子變異分析及主成分分析 為探究JY基因型遺傳分化的來源,根據(jù)CTV分離物來源將其劃分為野生柑桔種群(JY基因型分離物)和栽培柑桔種群(大部分其他基因型分離物)。分子變異分析結(jié)果顯示,來自CTV野生柑桔種群與栽培柑桔種群間、CTV野生柑桔種群內(nèi)個體間、CTV栽培柑桔種群內(nèi)個體間的變異分別占43%、42%和15%,說明CTV野生柑桔種群與栽培柑桔種群的主要變異來自種群間;CTV野生柑桔種群與栽培柑桔種群間差異的p值為0.001(p<0.05為顯著),且Nm(Haploid) =0.396<1{Nm(Haploid) = [(1 / PhiPT) - 1] / 2},說明差異非常大,且基因交流小。因此,推測野生柑桔獨特的生境可能是影響JY基因型種群出現(xiàn)明顯遺傳分化的重要因素。主成分分析顯示,CTV野生柑桔種群與栽培柑桔種群明顯分開(見圖 3),進一步證實兩種群間存在明顯遺傳分化。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育

單基因的ML樹顯示,12個JY基因型分離物均與JY-2聚集在同一簇,且獨立于現(xiàn)有CTV基因型之外;但不同基因的系統(tǒng)發(fā)育中顯示的親緣關(guān)系有所差異,ORF1b基因ML樹顯示JY基因型分離物與M1基因型分離物親緣關(guān)系最近,p25和p33基因ML樹顯示JY基因型分離物與M1和L1基因型分離物親緣關(guān)系最近,p23基因的ML樹顯示JY基因型分離物與T30、S1基因型分離物親緣關(guān)系最近。在單基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果中,ORF1b、p33和p23系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與基因序列多樣性分析和核苷酸分散度分析結(jié)果基本一致,僅p25基因略有不同。聯(lián)合4個基因構(gòu)建ML樹,發(fā)現(xiàn)與ORF1b單基因系統(tǒng)發(fā)育樹和JY-2全基因組序列分析[21]結(jié)果最為相似,即JY基因型與M1基因型分離物親緣關(guān)系最近,其次是T36、RB、A18基因型(見圖4)。

圖4 柑桔衰退病毒JY基因型12個分離物基于4個基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(ML)

3 討論

本研究對湖南的道縣、江永、宜章(莽山)和江西的崇義4個地區(qū)的野生柑桔樣品,以及湖南、江西、浙江、福建、重慶、四川、湖北、廣西、廣東等柑桔主產(chǎn)區(qū)的栽培柑桔樣品進行了CTV JY基因型的檢測,結(jié)果僅湖南都龐嶺山脈江永地區(qū)的野生柑桔樣品檢出JY基因型分離物,說明JY基因型的發(fā)生和分布并不普遍。2020年,從枳上鑒定到L1和M1兩種CTV新基因型[11],兩者也僅在重慶采集的樣品中檢出。此外,有研究在云南省哀牢山地區(qū)的野生柑桔中鑒定了4種長線形病毒,包括CTV和長線形病毒科的3個新成員(CiVB、CaAV-1、CaAV-2),同樣這些新的柑桔長線形病毒分布并不廣泛[22]。因此,推測柑桔中可能存在許多未知的長線形病毒或CTV新基因型,但前期缺乏相關(guān)研究[23]。盡管這些新病毒與CTV新基因型目前發(fā)生和分布并不普遍,但野生柑桔中的未知長線形病毒和CTV新基因型很可能通過人為和昆蟲媒介的方式傳播至附近的栽培柑桔果園,從而對柑桔產(chǎn)業(yè)造成威脅。

本研究通過克隆測序ORF1b、p33、p25和p23 等4個基因序列,進一步分析了JY基因型分離物的分子特征。其中,ORF1b編碼蛋白參與病毒基因組復(fù)制[24-25];p33編碼蛋白具有多種,如與致病性、寄主范圍、重復(fù)侵染和運動等有關(guān)[26];p25編碼蛋白是CTV主要的外殼蛋白[2]同時也作為RNA沉默抑制子[27];p23為CTV沉默抑制子[27]。遺傳多樣性分析顯示,JY基因型分離物間ORF1b、p33、p25、p23基因序列的核苷酸和氨基酸序列相似性(>96.8%)非常高,說明JY基因型種群內(nèi)的遺傳變異較少,種群較為穩(wěn)定;其中,p23基因核苷酸和氨基酸序列多樣性相對最為豐富,這可能與其作為CTV RNA沉默抑制子的功能有關(guān)[27]。遺傳多樣性、遺傳分化、分子變異及主成分分析的結(jié)果均證實,JY基因型分離物與CTV其他基因型分離物存在明顯的遺傳分化。進一步通過核苷酸分散度分析發(fā)現(xiàn),JY基因型分離物與CTV其他基因型分離物ORF1b、p33基因的分化程度明顯高于p23、p25基因,說明4個基因盡管種群內(nèi)都較為穩(wěn)定但其面臨的選擇壓卻不同。這一結(jié)果與之前的報道[6]一致,即CTV 5’端基因序列多樣性高于3’端。

基于ORF1b、p33、p25、p23基因單獨及4個基因聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育分析,表明JY基因型分離物均聚集在同一分支,且獨立于現(xiàn)有CTV基因型之外。盡管ORF1b、p33、p25系統(tǒng)發(fā)育分析顯示JY基因型分離物與M1基因型分離物親緣關(guān)系較近,但p23基因系統(tǒng)發(fā)育分析顯示JY基因型分離物與T30、S1基因型分離物親緣關(guān)系較近,遺傳多樣分析也顯示JY基因型分離物的p25、p23基因與M1基因型分離物的相似性低于A18基因型分離物。M1基因型分離物可檢測到多個重組事件[11],推測其為重組而產(chǎn)生的新基因型,但JY基因型分離物未檢測到重組事件。因此,推測JY基因型與M1基因型擁有共同的母系基因型,但分化后JY基因型與M1基因型是相互獨立演化的。

本研究以JY新基因型為研究對象,通過分子檢測、序列多樣性分析、遺傳分化分析、分子變異分析和系統(tǒng)發(fā)育分析,明確了JY基因型分離物發(fā)生分布范圍和種群分化特征,豐富了關(guān)于CTV種群多樣性的信息,將對解析CTV起源和進化提供參考。