蔣海濤，杜勝奇，李福青，王紅#

1遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化病醫(yī)院/遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563000

2荊州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 荊州 434000

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居全球男性惡性腫瘤第三位，女性惡性腫瘤第二位[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制復(fù)雜，涉及多個基因及信號通路，具體機制不明，探索與之相關(guān)的基因和信號通路將有助于結(jié)直腸癌的早期診斷及治療。晝夜節(jié)律是哺乳動物維持機體正常代謝的重要前提，節(jié)律基因異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，節(jié)律基因腦和肌肉ARNT 樣蛋白1（brain and muscle ARNT-like protein 1，BMAL1）和周期晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)因子2（period circadian regulator 2，PER2）表達(dá)缺失可促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[2-3]。Notch 通路是進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要由跨膜Notch 受體（Notch1～4）、Notch 配體（DLL1、DLL3、DLL4、JAG1 及JAG2）及DNA 結(jié)合蛋白CSL 組成，在結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，Notch信號通路異常所發(fā)揮的抑癌/促癌作用取決于細(xì)胞和組織內(nèi)環(huán)境；但在結(jié)直腸癌中，Notch1普遍被認(rèn)為是促癌基因[4-5]。糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是糖原合成的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有GSK-3α和GSK-3β兩種亞型，既往被認(rèn)為是潛在的抑癌因子，近年來被認(rèn)為是晚期腫瘤細(xì)胞存活和增殖的積極調(diào)節(jié)因子。有研究認(rèn)為，GSK-3 可調(diào)控視交叉上核中BMAL1、PER2等節(jié)律基因的表達(dá)，維持機體穩(wěn)定的晝夜節(jié)律[6]；而GSK-3β與Notch1 又可能存在正向調(diào)控作用。本研究應(yīng)用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription- polymerase chain reaction，RTPCR）及免疫組化法檢測BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況，分析GSK-3β、BMAL1、PER2 及Notch1 表達(dá)的相關(guān)性，旨在為結(jié)直腸癌的診治提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2019年9月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前已行放化療或免疫抑制劑治療；合并其他惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入61 例結(jié)直腸癌患者，取其中11 例手術(shù)切除的新鮮結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織，取50 例手術(shù)切除的結(jié)直腸腺癌及癌旁石蠟組織標(biāo)本；另選取30例經(jīng)內(nèi)鏡切除的結(jié)直腸腺瘤患者的結(jié)直腸腺瘤石蠟組織標(biāo)本。50 例結(jié)直腸腺癌患者中，男26 例，女24 例；年齡≥60 歲28 例，＜60 歲22 例；腫瘤類型：結(jié)腸腺癌31 例，直腸腺癌19 例；浸潤深度：T1～2期11 例，T3～4期39 例；腫瘤直徑：≥5 cm 26 例，＜5 cm 24 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期29 例，Ⅲ～Ⅳ期21 例；病理類型：管狀腺癌24 例，黏液腺癌24 例，乳頭狀腺癌2例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑

BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β、β-actin引物均由英淮捷基（上海）貿(mào)易有限公司提供；TransZol Up、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR 擴增試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；二乙基焦碳酸酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水購自北京綠澤森生物科技有限公司；兔抗人多克隆抗體BMAL1、PER2、Notch1 及兔抗人GSK-3β單克隆抗體均購自美國Abcam 公司；胰蛋白酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）、檸檬酸鹽緩沖液、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液均購自基因科技（上海）股份有限公司；通用型山羊血清購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TO 透明生物試劑購自廣州市鎮(zhèn)湖焊材有限公司。

1.3 實時熒光定量RT-PCR 法檢測BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β mRNA 的相對表達(dá)量

取11 例手術(shù)切除的新鮮結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，使用TransZol Up 試劑提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）進(jìn)行PCR 反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，采用相對定量2-△△Ct法計算BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3βmRNA 的相對表達(dá)量。引物序列：BMAL1上游引物5'-GCTAAGGATGGCTGTTCAGC-3'，下游引物5'-CTCGGTCACATCCTA-CGACA-3'；PER2上游引物5'-TCTGACCAGGTTGCATCCAT-3'，下游引物5'-CTTTTCCGGACACTGACACG-3'；Notch1上游引物5'-GATCTTCCCCTACTACGGCC-3'，下游引物5'-CACTGCCGGTTGTCAATCTC-3'；GSK-3β上游引物5'-CCCGACTAACACCACTGGAA-3'，下游引物5'-CTGTCCACGGTCTCCAGTAT-3'；β-actin上游引物5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3'，下游引物5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3'。

1.4 免疫組化法檢測BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白的表達(dá)情況

取50 例手術(shù)切除的結(jié)直腸腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織，30 例經(jīng)內(nèi)鏡切除的結(jié)直腸腺瘤組織，石蠟固定后連續(xù)切片，依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)等步驟，免疫組化鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法染色，依次滴加BMAL1（稀釋濃度1∶100）、PER2（稀釋濃度1∶100）、Notch1（稀釋濃度1∶200）、GSK-3β（稀釋濃度1∶100）。DAB 顯色，顯微鏡下隨機選取5 個高倍視野觀察，依據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分：無著色計0 分，淡黃色染色計1 分，棕黃色染色計2 分，棕褐色染色計3 分；陽性細(xì)胞所占比例＜5%計0 分，5%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，＞75%計4 分。將染色強度評分和陽性細(xì)胞所占比例評分相乘，0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為中等陽性（++），9～12 分為強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗；BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β mRNA 相對表達(dá)量的比較

結(jié)直腸癌組織中BMAL1、PER2mRNA 的相對表達(dá)量均低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中Notch1、GSK-3βmRNA 的相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 結(jié)直腸腺癌組織及癌旁組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β mRNA 相對表達(dá)量的比較

2.2 結(jié)直腸腺癌組織、結(jié)直腸腺瘤組織、結(jié)直腸腺癌癌旁組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白表達(dá)情況的比較

結(jié)直腸腺癌組織、結(jié)直腸腺瘤組織、結(jié)直腸腺癌癌旁組織中，BMAL1、PER2 的表達(dá)呈遞增趨勢，而Notch1、GSK-3β的表達(dá)呈遞減趨勢。BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白在結(jié)直腸腺癌組織、結(jié)直腸腺瘤組織及結(jié)直腸腺癌癌旁組織中表達(dá)情況的組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（H=40.960、34.034、26.163、31.938，P＜0.01）。除Notch1、GSK-3β蛋白在結(jié)直腸腺癌組織與結(jié)直腸腺瘤組織間的表達(dá)無明顯差異外，結(jié)直腸腺癌組織、結(jié)直腸腺瘤組織及結(jié)直腸腺癌癌旁組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白表達(dá)情況兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1、表2）

圖1 BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

表2 結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤組織、結(jié)直腸腺癌癌旁組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白的表達(dá)情況

2.3 不同臨床特征結(jié)直腸腺癌患者結(jié)直腸腺癌組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、浸潤深度、病理類型結(jié)直腸腺癌患者結(jié)直腸腺癌組織中BMAL1、Notch1 蛋白表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸腺癌患者結(jié)直腸腺癌組織中BMAL1 蛋白表達(dá)分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.855、2.180，P＜0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸腺癌患者結(jié)直腸腺癌組織中Notch1 蛋白表達(dá)分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.465、2.174，P＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期結(jié)直腸腺癌患者結(jié)直腸腺癌組織中PER2、GSK-3β蛋白表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；病理類型為黏液腺癌的結(jié)直腸腺癌組織中PER2 蛋白表達(dá)高于管狀腺癌，GSK-3β蛋白表達(dá)低于管狀腺癌，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.833、2.633，P＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征結(jié)直腸腺癌患者結(jié)直腸腺癌組織中BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β蛋白的表達(dá)情況（n=50）

2.4 BMAL1、PER2、Notch1、GSK-3β表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中BMAL1 的表達(dá)與PER2 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.332，P=0.018），PER2 的表達(dá)與GSK-3β的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.291，P=0.040），Notch1的表達(dá)與GSK-3β的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.285，P=0.045），其余指標(biāo)的表達(dá)均無相關(guān)性。

3 討論

晝夜節(jié)律是哺乳動物為適應(yīng)地球上24 小時的晝夜循環(huán)而進(jìn)化的，是保持機體正常運轉(zhuǎn)的重要前提，慢性晝夜節(jié)律紊亂促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。目前已知的節(jié)律基因包括時鐘基因（CLOCK）、BMAL1、PER1、PER2、PER3、神經(jīng)元PAS 結(jié)構(gòu)域蛋白2（neuronal PAS domain protein 2，NPAS2）、隱花色素1（cryptochrome 1，Cry1）、隱花色素2（cryptochrome 2，Cry2）、Timeless（Tim）、視黃酸受體相關(guān)的孤兒受體（retinoic acid receptor-related orphan receptor，ROR）α/β/γ、核受體亞家族1 組D 成員1（nuclear receptor subfamily 1,group D,member 1，NR1D1）/孤兒核激素受體REV-ERBα等，控制著細(xì)胞周期和細(xì)胞有絲分裂在內(nèi)的多種細(xì)胞功能。Stokes 等[3]的研究顯示，BMAL1可調(diào)節(jié)與再生和腸干細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄物，晝夜節(jié)律基因表達(dá)缺失促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究RT-PCR結(jié)果顯示，BMAL1、PER2基因在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，免疫組化結(jié)果顯示，BMAL1、PER2 蛋白在結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸腺癌癌旁組織中的表達(dá)呈逐漸遞增趨勢，提示BMAL1、PER2蛋白表達(dá)上調(diào)可能能夠抑制正常結(jié)直腸組織向腺瘤及腺癌的轉(zhuǎn)變。BMAL1、PER2 與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸腺癌患者結(jié)直腸腺癌組織中BMAL1 蛋白表達(dá)分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示BMAL1 與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)；而PER2 的表達(dá)僅與結(jié)直腸癌患者的病理類型有關(guān)，病理類型為黏液腺癌結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中PER2 蛋白的表達(dá)高于管狀腺癌，這可能與BMAL1、PER2 在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率過低及本研究納入的樣本量過少有關(guān)，有待進(jìn)一步擴大研究樣本量來證實。

Notch 信號通路是高度保守的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Notch1～4 受體是細(xì)胞存活和功能的重要決定因素，Notch 可能是致癌性的，也可能是抑癌性的，這取決于組織和細(xì)胞環(huán)境。結(jié)腸解剖的功能單位是Lieberkuhn 隱窩，而Notch 受體的表達(dá)在隱窩底部的干細(xì)胞池中最高；目前研究認(rèn)為，Notch1在結(jié)直腸癌中發(fā)揮促癌基因作用，但具體機制不明，可能涉及多個基因及信號通路[8]。本研究免疫組化結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中Notch1 蛋白的表達(dá)高于結(jié)直腸癌癌旁組織，證實Notch1 高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究分析Notch1 蛋白表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者臨床特征間的關(guān)系，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸腺癌患者結(jié)直腸腺癌組織中Notch1 蛋白表達(dá)分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示Notch1 與結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。

GSK-3 通過磷酸化絲氨酸和蘇氨酸殘基，調(diào)節(jié)細(xì)胞中多種基本的生物過程。GSK-3β是WNT/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、Hedgehog（Hh）、Notch 和c-Myc 介導(dǎo)的主要促癌通路的關(guān)鍵成員。GSK-3在20世紀(jì)被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子，而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3 亞型也顯示出致癌特性，參與了細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA 修復(fù)、腫瘤代謝、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，上調(diào)了腫瘤細(xì)胞存活、增殖和耐藥的關(guān)鍵通路。GSK-3β表達(dá)失調(diào)在結(jié)腸隱窩細(xì)胞中可激活WNT通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[1]。越來越多的證據(jù)將GSK-3β定義為腫瘤的潛在治療靶點，從而鼓勵開發(fā)用于腫瘤治療的GSK-3β抑制劑[9-10]。已有研究表明，在食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和乳腺癌細(xì)胞中抑制GSK-3β的活性可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖，并且可以增強化療藥物和放療的療效[10-11]。本研究結(jié)果顯示，GSK-3β在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，再次證明GSK-3β在結(jié)直腸癌中發(fā)揮促癌基因的作用。

經(jīng)典的Notch 信號通路激活過程：Notch 受體和配體結(jié)合，通過3 次裂解，釋放Notch 信號胞內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)域（Notch intracellular domain，NICD），NICD轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核后與CSL 蛋白結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄活化復(fù)合體，協(xié)調(diào)下游基因的表達(dá)。Notch 信號的激活是多步驟的復(fù)雜過程，可在多個階段被調(diào)控，研究表明，GSK-3β磷酸化參與了NICD 的核定位，增加了Notch1 的轉(zhuǎn)錄活性，對Notch 信號具有重要的調(diào)控作用[12]。Cao 等[13]采用Notch 信號通路阻斷劑DAPT 作用于小鼠膠質(zhì)細(xì)胞后顯示，在下調(diào)NICD和Notch1 蛋白表達(dá)的同時，GSK-3β的表達(dá)也出現(xiàn)顯著下調(diào)；而使用GSK-3β的抑制劑氯化鋰（LiCl）后，NICD 的表達(dá)也顯著下調(diào)，說明GSK-3β 與Notch 信號通路之間存在相互調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，Notch1 的表達(dá)與GSK-3β的表達(dá)呈正相關(guān)，因此有理由推測GSK-3β與Notch1 在結(jié)直腸癌中可能也存在相互調(diào)控作用。

不僅如此，GSK-3 還能磷酸化多個核心時鐘蛋白（BMAL1、PER2、Cry2、和REV-ERBα），并作為核心時鐘調(diào)節(jié)的穩(wěn)定器維持其節(jié)律性。BMAL1 和PER2可能通過RORα和REV-ERBα改變細(xì)胞增殖和成骨分化，影響WNT/β-catenin 通路，從而調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老[14]。在結(jié)直腸癌方面，有研究發(fā)現(xiàn)，在p53+/+HCT116 細(xì)胞株中，抑制GSK-3β的表達(dá)可以促進(jìn)p53 的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。目前GSK-3 磷酸化節(jié)律基因在結(jié)直腸癌中的研究鮮有報道，本研究顯示，PER2 的表達(dá)與GSK-3β的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測可能是因為GSK-3β磷酸化PER2 導(dǎo)致其表達(dá)被抑制，從而參與調(diào)控了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，BMAL1、Notch 信號通路、GSK-3β均可能參與調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，且GSK-3β可能與BMAL1 和Notch 信號通路之間存在相互調(diào)控作用，這為結(jié)直腸癌發(fā)病機制的研究提供了新思路。通過抑制GSK-3β的表達(dá)來調(diào)控節(jié)律基因的表達(dá)及Notch 信號通路，可能成為結(jié)直腸癌防治的新思路。鋰劑是GSK-3β的特異性抑制劑，臨床長期用于治療雙相情感障礙，價格低廉，已被證明可以抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在結(jié)直腸癌放療中的輔助作用也已被關(guān)注[16]；若能證明鋰劑在結(jié)直腸癌治療中的確切療效，將為腫瘤的靶向治療提供強有力的理論依據(jù)。