劉麗蘋,汪軍成,司二靜,姚立蓉,魯宗輝,祁天濤,馬小樂(lè),王化俊,李葆春,趙池銘,尚勛武,孟亞雄

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730070; 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,甘肅蘭州 730070; 3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅蘭州 730070; 4.甘肅省定西市臨洮農(nóng)業(yè)學(xué)校,甘肅定西 730500)

鹽脅迫是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要環(huán)境因素之一,在全世界范圍內(nèi),約有20%的耕地受到鹽脅迫的影響[1]。土壤中高濃度的鹽離子會(huì)對(duì)植物造成鹽脅迫,影響植物正常的代謝過(guò)程,降低光合效率,造成農(nóng)業(yè)損失和生態(tài)系統(tǒng)惡化[2]。在農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育的重要時(shí)期使用化學(xué)物質(zhì)干預(yù)是提高農(nóng)作物耐鹽性的有效方法之一[3]。

氨基酸及其衍生物能夠有效提高農(nóng)作物對(duì)土壤鹽脅迫的適應(yīng)性[4]。甘氨酸甜菜堿(glycine betaine,GB)簡(jiǎn)稱甜菜堿,是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的生物堿,能夠有效調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透壓,維持生物膜完整性[5]。農(nóng)作物響應(yīng)土壤鹽脅迫時(shí),可利用自身細(xì)胞內(nèi)積累滲透保護(hù)物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡,從而緩解鹽脅迫對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)的影響。通常,鹽脅迫下禾本科植物細(xì)胞內(nèi)甜菜堿的積累水平與植物抵抗逆境脅迫的能力成正比[6]。韓志平等[7]發(fā)現(xiàn),不同濃度GB浸種可以降低黃瓜在萌發(fā)期的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量,有效緩解鹽脅迫對(duì)幼苗細(xì)胞膜的氧化損傷,且在1.0～10.0 mmol·L-1范圍內(nèi),隨著GB濃度的增加,緩解效果越明顯。華智銳[8]研究表明,施加外源GB可以顯著提高鹽脅迫下千屈菜種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、葉綠素含量和保護(hù)酶活性。GB通過(guò)調(diào)節(jié)滲透平衡緩解鹽脅迫對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)的損傷,對(duì)鹽堿地作物的增產(chǎn)、增收具有重要意義[9]。

脯氨酸(proline,Pro)是一種重要的滲透調(diào)節(jié)保護(hù)劑,具有分子量小、水溶性大的特征,且對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用,已被廣泛用于緩解植物鹽堿、干旱、低溫等非生物脅迫中[10]。植物在響應(yīng)逆境脅迫時(shí),可以通過(guò)合成大量的Pro調(diào)節(jié)滲透平衡,穩(wěn)定原生質(zhì)膠體和組織代謝,以緩解因環(huán)境脅迫引起的損傷,從而提高抗逆性[11]。施用外源Pro可增加植物對(duì)逆境的抵御能力和適應(yīng)性,尤其對(duì)鹽脅迫具有較好的緩解效果[4]。陳曉云等[12]研究表明,20～30 μmol·L-1Pro處理下,蕎麥葉片抗氧化酶活性和凈光合速率均顯著提高。陳奮奇等[13]研究表明,施加250 μmol·L-1Pro顯著促進(jìn)NaCl脅迫下不同玉米品種幼苗根系和地上部生長(zhǎng),提高葉片抗氧化物酶活性,且對(duì)鹽敏感品種效應(yīng)更大。

大麥?zhǔn)鞘澜缟献罟爬系墓阮愖魑?與小麥、水稻等相比,它對(duì)鹽脅迫的耐受性更強(qiáng)[14]。但其品種之間的耐鹽性差異很大,深入研究不同耐鹽性品種在關(guān)鍵生育時(shí)期對(duì)鹽脅迫下施加外源物質(zhì)的響應(yīng),對(duì)提高大麥耐鹽性具有重要指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)以耐鹽品種中川大麥和鹽敏感品種ZY218為試驗(yàn)材料,研究其在鹽脅迫下萌發(fā)期及苗期表型和理化指標(biāo)對(duì)外源GB和Pro的響應(yīng),以期為大麥耐鹽品種選育提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為中川大麥(耐鹽型)和ZY218(鹽敏感型),分別由甘肅省農(nóng)科院、甘肅省省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室麥類育種課題組提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用200 mmol·L-1NaCl 溶液模擬鹽脅迫,GB處理液設(shè)0、0.5、1.0、5.0、10.0 mmol·L-1(G0,G0.5,G1,G5,G10)5個(gè)濃度梯度,Pro處理液設(shè)0、5、15、30、45 mmol·L-1(P0,P5,P15,P30,P45)5個(gè)濃度梯度,均用1/2 Hoagland配制。選取大小一致、飽滿的大麥種子,用10% NaClO溶液浸泡10 min,用蒸餾水沖洗3次,并用濾紙吸干表面水分;將消毒后的種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)和苗期試驗(yàn)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

取1.2中消毒后大麥種子30粒,均勻擺放在墊有雙層濾紙培養(yǎng)皿中,加入5 mL不同處理液在溫室中進(jìn)行萌發(fā),每個(gè)處理3次重復(fù);萌發(fā)后第3 天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì);發(fā)芽第7 天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率,并測(cè)定幼苗株高、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和總根數(shù)。以芽長(zhǎng)等于根長(zhǎng)的1/2作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。溫室條件:晝/夜溫度23 ℃/18 ℃,濕度 50%～60%,光周期12 h/12 h (明/暗),光強(qiáng) 400～500 μmol·m-2·s-1。

1.3.2 苗期相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

取1.2中消毒大麥種子50粒,均勻放入底部用蒸餾水浸潤(rùn)的發(fā)芽盒中,溫室內(nèi)培養(yǎng)至二葉一心期;用10 L不同處理液培養(yǎng),每2 d更換相應(yīng)的培養(yǎng)液;14 d后取樣,測(cè)定株高、地上和地下部鮮/干重、葉片SOD、POD、CAT活性及葉綠素含量,采用掃根儀(EPSON Expression 12000XL)測(cè)定幼苗總根長(zhǎng)、總根體積、總根表面積。溫室條件同1.3.1。每個(gè)處理3次重復(fù)。葉綠素含量采用丙酮提取法測(cè)定[15];超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定參照李合生[16]的方法;過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定參照高俊鳳[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用 Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、作圖,運(yùn)用SPSS 19.0的Duncans法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GB和Pro對(duì)鹽脅迫下大麥種子萌發(fā)的影響

由表1可知,GB對(duì)鹽脅迫下兩個(gè)大麥品種的根長(zhǎng)與根數(shù)均無(wú)顯著效應(yīng),對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和芽長(zhǎng)均有顯著提高作用(P< 0.05)。在1.0 mmol·L-1GB處理下,中川大麥和ZY218的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和芽長(zhǎng)均達(dá)到最大值;中川大麥較其對(duì)照(0 mmol·L-1)的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、芽長(zhǎng)增加52.2個(gè)百分點(diǎn)、49.5個(gè)百分點(diǎn)和63.77%;ZY218較其對(duì)照的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、芽長(zhǎng)分別增加25.2個(gè)百分點(diǎn)、24.5個(gè)百分點(diǎn)和62.07%。結(jié)果表明,1.0 mmol·L-1GB對(duì)鹽脅迫下兩個(gè)品種萌發(fā)促進(jìn)效應(yīng)最佳,且主要促進(jìn)大麥莖的生長(zhǎng),對(duì)根的生長(zhǎng)影響不顯著。

表1 外源GB對(duì)不同耐鹽性大麥種子萌發(fā)的影響Table 1 Effect of exogenous betaine on germination of barley seeds with different salt tolerance

Pro對(duì)鹽脅迫下兩個(gè)品種根生長(zhǎng)無(wú)顯著效應(yīng),對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和芽長(zhǎng)均有顯著提高作用(表2)。中川大麥和ZY218的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和芽長(zhǎng)分別在30.0和15.0 mmol·L-1Pro處理下達(dá)到最大值;中川大麥的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和芽長(zhǎng)較大對(duì)照分別增加了48.9個(gè)百分點(diǎn)、43.3個(gè)百分點(diǎn)和61.54%;ZY218的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和芽長(zhǎng)分別增加了44.5個(gè)百分點(diǎn)、58.9個(gè)百分點(diǎn)和70.71%、64.52%。結(jié)果表明,30.0 mmol·L-1Pro對(duì)鹽脅迫下中川大麥種子萌發(fā)促進(jìn)作用最佳, 15.0 mmol·L-1Pro對(duì)鹽脅迫下ZY218種子萌發(fā)促進(jìn)作用最佳;在最適濃度下,ZY218各萌發(fā)指標(biāo)增幅大于中川大麥;Pro處理對(duì)2大麥品種根生長(zhǎng)影響不顯著,對(duì)莖的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。

表2 外源Pro對(duì)不同耐鹽性大麥種子萌發(fā)的影響Table 2 Effect of exogenous proline on germination of barley seeds with different salt tolerance

2.2 外源GB和Pro對(duì)鹽脅迫下大麥幼苗生長(zhǎng)的影響

由表3可知,GB對(duì)兩個(gè)大麥品種的地下鮮重、總根長(zhǎng)、總根表面積、總根體積均無(wú)顯著效應(yīng),對(duì)根冠比有顯著降低作用(P< 0.05)。在1.0 mmol·L-1GB處理下,中川大麥和ZY218的根冠比均達(dá)到最小值,與對(duì)照相比,中川大麥根冠比降低61.43%,ZY218根冠比降低60.80%。GB對(duì)兩個(gè)品種的株高、地上鮮重有顯著提高作用(P< 0.05)。在1.0 mmol·L-1GB處理下,中川大麥和ZY218的株高、地上鮮重均達(dá)到最大值;與對(duì)照相比,中川大麥幼苗的株高、地上鮮重分別增加了34.59%、60.73%,ZY218幼苗的株高、地上鮮重分別增加了56.84%、66.68%。結(jié)果表明,適量外源GB能有效緩解鹽脅迫對(duì)大麥幼苗生長(zhǎng)的影響,以1.0 mmol·L-1GB的緩解效果最佳;GB處理對(duì)大麥苗期根生長(zhǎng)的影響不顯著,對(duì)莖生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。

表3 外源GB對(duì)不同耐鹽性大麥幼苗生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of exogenous betaine on the growth of barley seedlings with different salt tolerance

由表4可知,Pro對(duì)兩個(gè)麥品種的根冠比均無(wú)顯著效應(yīng),對(duì)株高、地上鮮重、地下鮮重、總根長(zhǎng)、總根表面積、總根體積有顯著提高作用(P< 0.05)。在30.0 mmol·L-1Pro處理下,中川大麥的被測(cè)指標(biāo)達(dá)到最大值,與對(duì)照相比,其株高、地上鮮重、地下鮮重、總根長(zhǎng)、總根表面積、總根體積分別增加了33.15%、59.41%、58.27%、 53.58%、66.68%、71.42%;在15.0 mmol·L-1Pro處理下ZY218的被測(cè)指標(biāo)達(dá)到最大值,其株高、地上鮮重、地下鮮重、總根長(zhǎng)、總根表面積、總根體積較CK2分別增加了66.12%、70.18%、 65.17%、34.48%、63.14%、57.48%。以上結(jié)果表明,適量外源Pro能有效緩解鹽脅迫對(duì)大麥幼苗生長(zhǎng)的影響,其生長(zhǎng)顯著提高。

表4 外源Pro對(duì)不同大麥幼苗生長(zhǎng)的影響Table 4 Effect of exogenous proline on the growth of barley seedlings

2.3 外源GB和Pro對(duì)鹽脅迫下大麥幼苗葉綠素含量的影響

由圖1A和圖2A可知,GB和Pro處理對(duì)兩個(gè)大麥品種幼苗的葉綠素含量均有顯著提高作用(P< 0.05)。在1.0 mmol·L-1GB處理下,中川大麥和ZY218的葉綠素含量均達(dá)到最大值,與對(duì)照相比,中川大麥葉綠素含量增加62.48%,ZY218葉綠素含量增加57.03%。中川大麥和ZY218幼苗的葉綠素含量分別在30.0 mmol·L-1、15.0 mmol·L-1Pro處理下達(dá)到最大值;與對(duì)照相比,中川大麥增加33.68%,ZY218增加50.57%。這表明適量外源GB和Pro可以有效緩解鹽脅迫對(duì)大麥幼苗葉綠素含量的影響,且不同耐鹽性大麥的最適Pro濃度不同。

圖2 外源脯氨酸對(duì)不同大麥幼苗生理指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of exogenous proline on physiological indices of barley seedlings

2.4 外源GB和Pro對(duì)鹽脅迫下大麥幼苗保護(hù)酶活性的影響

由圖 1和圖2可知,GB和Pro處理對(duì)鹽脅迫下兩個(gè)大麥品種幼苗的3種保護(hù)酶活性均有顯著提高作用(P< 0.05)。在1.0 mmol·L-1GB 處理下,中川大麥和ZY218幼苗的3種保護(hù)酶活性均達(dá)到最大值,中川大麥幼苗的POD、SOD、CAT活性比對(duì)照增加了71.98%、43.40%、54.97%,ZY218幼苗的POD、SOD、CAT活性分別增加了80.95%、24.89%、71.01%。中川大麥在30.0 mmol·L-1Pro處理下幼苗的POD、SOD、CAT活性分別比對(duì)照增加了 76.01%、37.43%、74.61%;ZY218的POD、SOD、CAT活性在15.0 mmol·L-1Pro處理下幼苗的POD、SOD、CAT活性分別比增加了83.04%、40.00%、66.48%。以上結(jié)果表明,適量外源GB和Pro可以有效緩解鹽脅迫對(duì)大麥幼苗保護(hù)酶活性的影響,且不同耐鹽性大麥的最適Pro濃度不同。

3 討論

3.1 外源甜菜堿、脯氨酸對(duì)鹽脅迫下大麥種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)期是植物生長(zhǎng)最重要的階段,也是耐鹽性最差的階段[18],故提高種子萌發(fā)期的耐鹽性十分重要。研究表明,外源甜菜堿能顯著改善黑枸杞[19]、紫花苜蓿[20]和番茄[21]等在鹽脅迫條件下的種子萌發(fā)。華智瑞[8]研究發(fā)現(xiàn),外源甜菜堿能顯著提高千屈菜種子在NaCl脅迫下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等萌發(fā)指標(biāo)。本研究中,外源甜菜堿可以顯著提高鹽脅迫下大麥種子的芽長(zhǎng)、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率,在1.0 mmol·L-1處理下改善效果最顯著,說(shuō)明適宜濃度的外源甜菜堿可以有效緩解鹽脅迫對(duì)大麥種子萌發(fā)的抑制,這與前人研究結(jié)果一致。外源甜菜堿對(duì)萌發(fā)期大麥的根長(zhǎng)和根數(shù)無(wú)顯著影響,這可能與甜菜堿的調(diào)控特性有關(guān)。

脯氨酸作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)劑,在緩解植物鹽脅迫中發(fā)揮著重要作用[22]。已有大量研究證實(shí),外源脯氨酸能提高鹽脅迫下不同作物種子的萌發(fā)指標(biāo),如水稻[23]、高粱[24]和油菜[25]。本研究發(fā)現(xiàn),外源脯氨酸可以有效緩解鹽脅迫對(duì)大麥發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和芽長(zhǎng)的抑制,但對(duì)其根系生長(zhǎng)影響不顯著。中川大麥和ZY218最適脯氨酸緩解濃度分別為30.0和15.0 mmol·L-1,這可能與兩種大麥耐鹽性差異有關(guān),這與朱世楊等[26]對(duì)花椰菜的研究結(jié)果一致。顏志明等[27]發(fā)現(xiàn),同一濃度的外源脯氨酸對(duì)不同耐鹽性甜瓜的鹽脅迫的緩解效果不同。因此,在實(shí)際生產(chǎn)中,施加外源脯氨酸緩解作物鹽脅迫時(shí),不同品種選用其適宜的處理濃度。

3.2 外源甜菜堿和脯氨酸對(duì)鹽脅迫下大麥幼苗生長(zhǎng)的影響

鹽脅迫會(huì)嚴(yán)重抑制作物幼苗的生長(zhǎng),作物也會(huì)分泌甜菜堿和脯氨酸等有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以響應(yīng)鹽脅迫[28]。楊曉云等[29]研究發(fā)現(xiàn),外源甜菜堿可有效促進(jìn)NaCl脅迫下玉米幼苗根系和地上部的生長(zhǎng)。談建中等[30]研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)葉片噴施脯氨酸也可顯著緩解鹽脅迫對(duì)桑樹幼苗生長(zhǎng)的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下施加1.0 mmol·L-1甜菜堿可顯著提高不同耐鹽性大麥幼苗的株高和地上鮮重,且在鹽敏感型品種ZY218的增幅高于耐鹽品種中川大麥,這可能是由于鹽敏感型品種在鹽脅迫下受到更強(qiáng)烈的抑制作用;不同濃度甜菜堿處理對(duì)苗期大麥的地下鮮重、總根長(zhǎng)、總根體積、總根表面積無(wú)顯著影響,而根冠比均低于對(duì)照組,這與高 雁等[31]研究一致,推測(cè)外源甜菜堿主要通過(guò)緩解鹽脅迫對(duì)莖生長(zhǎng)的抑制調(diào)控植株根冠比以響應(yīng)鹽脅迫。本研究發(fā)現(xiàn),外源脯氨酸不僅緩解了鹽脅迫對(duì)不同耐鹽性大麥地上部生長(zhǎng)的抑制,同時(shí)顯著促進(jìn)了根系的生長(zhǎng),這說(shuō)明脯氨酸在參與大麥苗期鹽脅迫響應(yīng)時(shí)可以同時(shí)調(diào)控根系和地上部的生長(zhǎng)。兩種耐鹽性大麥在苗期的最適脯氨酸濃度存在差異。

3.3 外源甜菜堿和脯氨酸對(duì)鹽脅迫下大麥幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素,其含量可作為衡量葉片光合能力的指標(biāo)[32]。有研究表明,鹽脅迫可降低水稻[33]、番茄[34]、黃瓜[35]等多種植物的葉綠素含量。尹海龍等[36]研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下,玉米幼苗葉片葉綠素含量顯著下降,但根施甜菜堿可明顯緩解這種抑制作用。與上述結(jié)果一致,本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度甜菜堿可有效緩解鹽脅迫對(duì)不同耐鹽性大麥葉綠素含量的影響 ,1.0 mmol·L-1甜菜堿處理的緩解效果最為顯著。這表明適宜濃度的甜菜堿可通過(guò)提高大麥幼苗葉綠素的含量改善光和效率,從而增強(qiáng)抗鹽性。外源脯氨酸在緩解鹽脅迫對(duì)植物葉綠素含量的影響方面也起著積極作用。唐依萍等[37]研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下施加一定濃度的外源脯氨酸可以延緩番茄葉片葉綠素含量的下降趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度脯氨酸可有效緩解鹽脅迫對(duì)大麥幼苗葉綠素含量的影響,但不同耐鹽性大麥的適宜濃度存在差異。這與洪春桃等[38]研究結(jié)果一致。

3.4 外源甜菜堿、脯氨酸對(duì)鹽脅迫下大麥幼苗抗氧化酶活性的影響

鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致作物幼苗積累大量活性氧(ROS),而植物主要通過(guò)增加SOD、POD以及CAT等酶活性清除體內(nèi)過(guò)多的ROS[39]。本研究結(jié)果表明,在鹽脅迫下施加不同濃度的甜菜堿顯著增加了不同大麥品種幼苗葉片的POD、SOD和CAT活性,在1.0 mmol·L-1濃度時(shí)效果最顯著。這說(shuō)明外源甜菜堿可以通過(guò)增加大麥的抗氧化能力緩解鹽脅迫對(duì)大麥幼苗生長(zhǎng)的抑制作用。這與凌欣聞等[40]對(duì)早熟禾的研究結(jié)果一致。陳曉云等[13]研究發(fā)現(xiàn),外源脯氨酸處理可以顯著降低鹽脅迫下蕎麥葉片的質(zhì)膜透性和MDA含量,增加POD、SOD 活性,且對(duì)鹽敏感蕎麥葉片細(xì)胞具有更好的保護(hù)作用。與上述結(jié)果一致,本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度脯氨酸可有效緩解鹽脅迫對(duì)不同耐鹽性大麥POD、SOD、CAT活性的影響,且對(duì)鹽敏感品種ZY218葉片保護(hù)酶的緩解效果較好。結(jié)果表明,外源甜菜堿和脯氨酸不僅可以直接參與植物鹽脅迫下細(xì)胞滲透壓的調(diào)節(jié),還能通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)參與大麥幼苗的鹽脅迫響應(yīng)。