錢路兵張夢蝶劉金林李宗波,3

（1. 西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400715；3. 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233）

云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）是一種以云南松（Pinus yunnanensis）為寄主的蛀干害蟲，該蠹蟲自20 世紀(jì)80 年代在云南中部大爆發(fā)以來，現(xiàn)已擴(kuò)散至四川、貴州、廣西等云南松（Pinus yunnanensis）的原生分布區(qū)[1-2]，嚴(yán)重威脅我國西南地區(qū)云南松松林生態(tài)系統(tǒng)的安全及生物多樣性。云南切梢小蠹1 年發(fā)生1 代，具有干轉(zhuǎn)梢、梢轉(zhuǎn)梢和梢轉(zhuǎn)干3 個(gè)獨(dú)特的生活時(shí)期。其中，在松梢中補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，完成生殖器官的成熟，并會導(dǎo)致云南松的生長勢衰弱；在樹干韌皮部進(jìn)行交配、產(chǎn)卵，并完成胚后發(fā)育，最終致使樹木死亡[2]。盡管云南切梢小蠹會有一個(gè)短暫的轉(zhuǎn)移期，但其90%以上的生活史均在樹木內(nèi)部度過，隱蔽的生活方式?jīng)Q定了云南切梢小蠹的防治難度大。目前，營造針闊混交林被認(rèn)為是防治云南切梢小蠹最為有效的方式。在混交林生態(tài)系統(tǒng)中，非寄主林木與寄主林木之間常因時(shí)間和空間的持續(xù)變化，形成獨(dú)特的空間分布與配置的關(guān)系，一方面能夠增加物種的多樣性，增強(qiáng)物種之間的互作關(guān)系和制衡能力（如天敵、捕食者、寄生蜂），從而降低害蟲的危害程度和發(fā)生頻率[3]；另一方面在于非寄主林木釋放的特征氣味譜，可直接影響或干擾害蟲的多種行為[4-5]。如綠葉揮發(fā)物能夠大幅度地降低云南切梢小蠹、南部松大小蠹（Dendroctonus frontalis）、中穴星坑小蠹（Pityogenes chalcographu）對聚集信息素和寄主氣味的趨向性，影響其寄主識別能力[5-7]。樹皮揮發(fā)物苯甲醇、苯甲醛、愈創(chuàng)木酚、鄰羥基苯甲醛以及7-甲基-1,6-二氧螺環(huán)[4-5]癸烷（又稱conophthorin）可干擾害蟲產(chǎn)卵地的選擇，延長求偶時(shí)間，縮短交配持續(xù)期，也會增加天敵的非致死效應(yīng)[4,8-10]。并且，非寄主林木氣味也是混交林氣味的重要組成部分，且這些氣味物質(zhì)無時(shí)不有，無處不在，很可能作為一種間接的環(huán)境脅迫因子[5,11]。相較于其他害蟲，云南切梢小蠹的主要生活史均在樹干的坑道內(nèi)完成，生活環(huán)境也相對封閉，推測這些無時(shí)不在的非寄主氣味，特別是活性氣味物質(zhì)，很可能作為一種非致死效應(yīng)而直接影響云南切梢小蠹的發(fā)育和存活幾率。因此，采用前期篩選的非寄主林木—川滇榿木（Alnus ferdinandi-coburgii）的氣味活性物質(zhì)，用生測法持續(xù)干擾云南切梢小蠹的胚后發(fā)育，以驗(yàn)證非寄主林木氣味對害蟲繁殖機(jī)能的影響，并為深入理解混交林抑制害蟲種群數(shù)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 云南切梢小蠹的胚后發(fā)育及形態(tài)特征

云南切梢小蠹的生殖器官發(fā)育成熟后，于當(dāng)年10 月至翌年3 月開始蛀入樹干，待雌雄兩性在交配室內(nèi)交配后，雌蟲即沿樹干縱向方向蛀食，并將卵產(chǎn)于母坑道左右兩側(cè)（圖1a）。卵呈橢圓形，長（1.02 ± 0.11）mm，寬（0.63 ± 0.05）mm，乳白色。卵經(jīng)歷5～12 d 便會孵化為幼蟲，幼蟲沿著與母坑道垂直的方向進(jìn)行取食，形成子坑道，每個(gè)幼蟲均在自己的坑道內(nèi)發(fā)育；幼蟲體稍微彎曲，粗而多皺紋，有3 齡。其中，1 齡幼蟲呈淡黃褐色，頭殼寬0.2～0.6 mm；2 齡幼蟲為黃褐色，頭殼寬0.64～0.90 mm；3 齡幼蟲為橙黃色，頭殼寬0.92～1.28 mm[12]。1.5～2 個(gè)月后，幼蟲就會在坑道末端的蛹室內(nèi)化蛹，新蛹呈乳白色，隨后復(fù)眼、口器和翅逐漸變成黑褐色。蛹經(jīng)歷20～25 d 后，逐漸羽化為成蟲，新成蟲呈淡黃褐色，鞘翅末端2/3 處最先開始出現(xiàn)黑色斑塊，隨后整體呈黑褐色（圖1b）。成蟲在蛹室內(nèi)待4～7 d 后，則會從蛹室上方咬開羽化孔爬出樹干，尋找合適的嫩梢補(bǔ)充營養(yǎng)，開始新的生命循環(huán)。

圖 1 云南切梢小蠹的坑道特征和胚后發(fā)育Fig. 1 Single maternal gallery and post-embryonic development of T. yunnanensis

1.2 氣味活性物質(zhì)的篩選與來源

前期在抗云南切梢小蠹混交樹種的篩選過程中，已發(fā)現(xiàn)用川滇榿木營造的針闊混交林，能夠很好地削弱云南切梢小蠹的危害，隨后用昆蟲電生理和行為選擇實(shí)驗(yàn)篩選出對乙基苯乙酮、反-2-己烯-1-醇、順-4-己烯-1-醇和4-烯丙基苯甲醚對云南切梢小蠹有趨避活性[13]。干擾實(shí)驗(yàn)使用的4 個(gè)化合物以及對照試劑，均從商業(yè)公司購買的標(biāo)準(zhǔn)化合物，見表1。

表 1 干擾用的活性氣味物質(zhì)及來源Table 1 Description of odor-active compounds employed in stressing experiments for T. yunnanensis

1.3 氣味活性物質(zhì)的干擾實(shí)驗(yàn)

將從云南松松林采集的、生殖器官已發(fā)育成熟的云南切梢小蠹帶回實(shí)驗(yàn)室，先根據(jù)腹部背板形態(tài)以及是否可見第8 節(jié)的特征區(qū)分雌雄，然后按照雌、雄各15 只的方式放在廣口玻璃瓶（高50 cm，直徑25 cm，體積20 L）中。瓶內(nèi)先放置2 根新鮮的云南松木段，木段長30 cm，直徑10 cm，且兩端用液體石蠟封閉保濕，用紗布封住瓶口，以便于云南切梢小蠹的侵入和繁殖。待見到木段表面或瓶底有木屑后，意味著雌雄已完成了交配，雌蟲開始蛀坑產(chǎn)卵，隨即將內(nèi)含活性氣味物質(zhì)（0.45 ng/μL，溶劑為正己烷）的緩釋瓶置于廣口瓶瓶底，每隔15 d 更換1 次。每個(gè)化合物設(shè)置3 次重復(fù)，并以溶劑（正己烷）和對小蠹蟲具有較強(qiáng)引誘效果的寄主活性成分（α-蒎烯）為對照[14]。最后，將處理好的廣口瓶放置在養(yǎng)蟲室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)，每隔15 d 各取一木段進(jìn)行解剖，收集云南切梢小蠹幼蟲（1～3 齡）、蛹及新羽化成蟲（圖1b），將其置于蔡氏體式鏡下拍照（Ste-REO Discovery V20, Geman），并用微量天平測量其體質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將體視鏡拍攝的照片導(dǎo)入ImageJ（Version 1.53c, http://imagej.nih.gov/ij）軟 件 中，分 別 對 云南切梢小蠹的幼蟲、蛹、成蟲、頭殼以及正常羽化木段內(nèi)的母坑道和子坑道等指標(biāo)進(jìn)行量化，再根據(jù)卵室的數(shù)量判斷雌蟲的產(chǎn)卵量。隨后，采用單因素方差分析或者Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)分析氣味活性物質(zhì)對云南切梢小蠹胚后發(fā)育的影響程度。所有的數(shù)據(jù)分析均在開源軟件Rstudio 中（R Version 4.0.5, https://cran.r-project.org/）完 成，作圖使用GraphPad Prism（Version 8.0.2）。

2 結(jié)果及分析

2.1 氣味脅迫對雌蟲產(chǎn)卵量與蛀食坑道的影響

與對照相比，云南切梢小蠹在4 種非寄主氣味脅迫下的產(chǎn)卵量沒有顯著的變化，產(chǎn)卵量均在50～60 粒（表2）。但是，雌成蟲在產(chǎn)卵過程中蛀食的母坑道有顯著的增長（P＜0.05），尤其是對乙基苯乙酮、順-4-己烯-1-醇和4-烯丙基苯甲醚，母坑道的長度分別增加了60.47%、55.68%和36.84%，但卵與卵之間的間距沒有明顯的變化。當(dāng)卵孵化后，幼蟲在子坑道內(nèi)取食，4 種氣味活性物質(zhì)均能顯著增加幼蟲蛀食的坑道長度（P＜0.05）。其中，4-烯丙基苯甲醚增加的最多，達(dá)到47.91%，而順-4-己烯-1-醇增加比例最低，僅為13.07%（表2）。

表 2 氣味活性物質(zhì)對云南切梢小蠹產(chǎn)卵與坑道的影響Table 2 Responses of egg production and maternal gallery of T. yunnanensistressed by the odor-active compounds

2.2 氣味脅迫對幼蟲的影響

在幼蟲發(fā)育階段，4 種非寄主氣味活性物質(zhì)均能夠顯著增加幼蟲各發(fā)育階段的體長（P＜0.01），以反-2-己烯-1-醇的增加得最多，其次為對乙基苯乙酮，順-4-己烯-1-醇和4-烯丙基苯甲醚增加的最少（表3、圖2）。并且，反-2-己烯-1-醇、對乙基苯乙酮和4-烯丙基苯甲醚對幼蟲的影響效果一致，即從1 齡幼蟲至3 齡幼蟲呈先高后低的趨勢，而順-4-己烯-1-醇則為先低后高的趨勢（圖2）。與對照相比，4 種氣味活性物質(zhì)均能夠增加幼蟲的體質(zhì)量，但并沒有顯著差異（表3）。

表 3 氣味活性物質(zhì)對云南切梢小蠹的幼蟲發(fā)育的影響Table 3 Responses of larval development of T. yunnanensisstressed by the odor-active compounds

圖 2 氣味活性物質(zhì)對云南切梢小蠹體長的相對增加比例的影響Fig. 2 Relative percentage of lengthened body length ofT. yunnanensislarvae stressed by the odor-active compounds

2.3 氣味脅迫對蛹和新羽化成蟲的影響

與對照相比（圖3），4 種氣味物質(zhì)均能顯著降低云南切梢小蠹蛹（P＜0.01）和新羽化成蟲的體長（P＜0.01），以蛹的效果最好，順-4-己烯-1-醇、對乙基苯乙酮和4-烯丙基苯甲醚的降幅分別為16.63%、14.45%和13.68%，而反-2-己烯-1-醇則為6.95%。在體質(zhì)量方面，4 種氣味活性物質(zhì)干擾效果并不一致，反-2-己烯-1-醇、順-4-己烯-1-醇和4-烯丙基苯甲醚能夠顯著地降低蛹（P＜0.01）和新羽化成蟲的體質(zhì)量（P＜0.01），以反-2-己烯-1-醇效果最佳，前者降幅為20.09%，后者降幅為15.78%；但對乙基苯乙酮?jiǎng)t會小幅度增加蛹和成蟲的體質(zhì)量，但效果并不明顯。

圖 3 氣味活性物質(zhì)對云南切梢小蠹蛹與新羽化成蟲的影響Fig. 3 Responses of pupa and newly eclosed adults of T. yunnanensisstressed by the odor-active compounds

3 結(jié)論與討論

四種川滇榿木氣味活性物質(zhì)均能明顯干擾云南切梢小蠹的胚后發(fā)育，特別是綠葉氣味成分—反-2-己烯-1-醇和順-4-己烯-1-醇能夠直接降低蛹和成蟲的個(gè)體大小和體質(zhì)量，進(jìn)而影響云南切梢小蠹后續(xù)的寄主識別過程及其存活能力，為深入理解針闊混交林降低害蟲種群數(shù)量提供了另一例證。

獲取食物是物種繁衍后代的本能需求。然而，其取食活動(dòng)除了受到自身生理狀態(tài)影響外，還會受到各種外界因素的影響。如氣溫變暖引起中歐山松大小蠢（D. ponderosae）、黃杉大小蠹（D. rufipennis）的種群數(shù)量大爆發(fā)[15-16]、地球磁場改變導(dǎo)致褐飛虱（Nilaparvata lugens）新羽化雌、雄成蟲的體質(zhì)量顯著下降（14.67%）和（13.17%）[17]、苯并二唑衍生物能夠直接抑制地中海實(shí)蠅（Ceratitis capitafa）保幼激素與受體的結(jié)合[18]、種間競爭聲信號能夠降低南部松大小蠹母坑道長度，并會增加成蟲羽化死亡率[19]。對小蠹蟲而言，尤其是針葉樹皮小蠹，在坑道內(nèi)取食是其獲取營養(yǎng)物質(zhì)和能量的唯一來源，其產(chǎn)卵量亦會隨著坑道長度的增加而增加[2]。在本研究中，4 種氣味活性物質(zhì)脅迫能夠增加云南切梢小蠹的母坑道長度，但平均產(chǎn)卵量和卵間距沒有顯著的變化，這可能與其在生殖上所分配的能量是恒定的有關(guān)，生殖前增加或減少自身營養(yǎng)并不會影響其對生殖所分配的能量，如饑餓并不會影響中歐山松大小蠢的產(chǎn)卵量[20]。另一種可能就是氣味化合物抑制了雌成蟲的能量轉(zhuǎn)化效率，如合成卵黃原蛋白或卵母細(xì)胞受體[18,21]，使其必須通過攝取更多的食物才能獲取與對照組等量的營養(yǎng)，幼蟲期既是一個(gè)明顯的例證，也是云南切梢小蠹對不良環(huán)境的一種生理響應(yīng)，類似于生活在南北兩極的昆蟲為抵抗低溫而擁有更高的代謝速率、歐洲葡萄蛾（Lobesia botrana）幼蟲在溫度增加時(shí)會增加取食來補(bǔ)充自身的能量[22]。Huber 等[5]發(fā)現(xiàn)反-2-己烯-1-醇、順-4-己烯-1-醇、1-乙烯基己醇等綠葉氣味能夠降低中歐山松大小蠢、西部松大小蠹（D. brevicomis）、黃杉大小蠹幼蟲的取食量，這與本研究的結(jié)果并不一致，可能暗示著通用的綠葉氣味物質(zhì)的干擾性質(zhì)不同，正如反-2-己烯-1-醇干擾效果呈下降趨勢，而順-4-己烯-1-醇呈上升趨勢（圖2）。另一方面，大量的研究已經(jīng)證明昆蟲激素存在低促高抑的現(xiàn)象，昆蟲對不同濃度的同種化合物同樣存在較大的差異[2,23]。在蛹期，受化合物干擾后的云南切梢小蠹的體長及體質(zhì)量均出現(xiàn)不同程度的減少，這可能因它們幼蟲期擁有較快的代謝導(dǎo)致蛹期消耗更多的能量，從而導(dǎo)致了該階段以及新羽化成蟲的體長和體質(zhì)量減少[20-21,23]。

混交林作為有害生物生態(tài)調(diào)控的重要措施之一，已被證明能夠有效抑制害蟲的種群數(shù)量，目前已有資源集中假說、寄主可見性假說、天敵假說等對其進(jìn)行解釋[3-4]，但本研究發(fā)現(xiàn)非寄主林木氣味能夠降低害蟲的繁殖機(jī)能，尤其是蛹和成蟲，將對其以后的存活、繁衍，甚至種間的互作和級聯(lián)關(guān)系等產(chǎn)生明顯的影響。如昆蟲的體長和體質(zhì)量常作為衡量其繁殖力的一個(gè)重要特征。紅脂大小蠹在求偶的時(shí)候，雌蟲更偏愛體型更大的雄性，因?yàn)轶w型大意味著優(yōu)良的后代；同樣的，雄蟲也偏愛選擇體型更大的雌蟲，因?yàn)轶w型越大意味著能夠產(chǎn)生更多的后代[24-25]。并且，在雄性間的競爭中，體型大小也是一個(gè)決定性因素，往往個(gè)體較大者容易在競爭中獲勝，容易實(shí)現(xiàn)自我繁殖適合度[26-27]。此外，個(gè)體小，體質(zhì)量輕的個(gè)體，容易在擴(kuò)散遷飛和寄主識別過程中死亡，或者被天敵或捕食者殺死[2,28-29]，這可能是混交林抑制害蟲種群數(shù)量的重要因素之一。對于云南切梢小蠹來說，考慮到不同坑道間幼蟲發(fā)育程度，以及坑道相互交錯(cuò)而致使部分幼蟲缺少食物而死亡（死亡率約為39.85%）[2]，非寄主氣味干擾后幼蟲取食量增加可能會進(jìn)一步加劇種內(nèi)競爭。因此，在其種群密度較高時(shí)，未來是否可用非寄主氣味持續(xù)干擾來增加云南切梢小蠹的死亡率有待研究。