廖夢香

(福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002)

河蜆(Corbiculafluminea)隸屬于蜆科(Corbicu lidae)、蜆屬(Corbicula)，俗稱黃蜆、蜆子、沙喇、蝲仔、蟟仔，廣泛分布于世界各地淡水、咸淡水水域，一般棲息于江、河、湖泊、溝渠的砂質、泥沙底部[1]。河蜆肉質鮮美、營養(yǎng)價值高，既有明目、通乳的作用，又有解酒護肝等功效[2]。除了供給國內消費市場外，鮮活河蜆還遠銷日本和韓國等地區(qū)。由于目前河蜆供給主要依賴野生資源，近年部分河流設置了禁捕和休漁期，導致河蜆供不應求，價格不斷升高，加劇了市場對未禁捕區(qū)域野生河蜆的資源掠奪，造成嚴重的生態(tài)資源破壞。

線粒體DNA作為動物遺傳學研究的理想分子標記，被廣泛應用于水生生物的遺傳多樣性、物種分析和分子系統(tǒng)進化等方面。線粒體細胞色素b基因(Cytb)被廣泛應用于魚類群體遺傳多樣性研究[3-5]、種群遺傳結構分析[6-8]和系統(tǒng)發(fā)育研究[9]等，也被用于洪澤湖和洞庭湖的河蜆種群遺傳多樣性研究[10-11]。另外線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因和線粒體16S核糖體RNA(16S rRNA)基因也常被用于魚類的仔稚魚鑒定[12]、分子系統(tǒng)進化分析[13-14]、物種鑒定[15-16]、遺傳多樣性分析[17-18]和DNA條形碼研究[19-21]，此外被廣泛應用于貝類遺傳多樣性分析[22]、系統(tǒng)學研究[23]和種間鑒定[24]等，但在河蜆遺傳多樣性分析中尚未見報道。

河蜆作為溪流中常見的貝類之一，已受到廣泛的關注和研究，已有的研究主要集中在生理生化[25]、營養(yǎng)成分[26-27]、繁殖生物學[28-30]、遺傳多樣性[31-32]和時空分布[33-35]等方面。福建閩江是我國河蜆的主要產(chǎn)區(qū)之一，由于閩江水質和沙質都很好，因此河蜆特別肥厚鮮美，目前針對閩江流域河蜆的研究僅限于多環(huán)芳烴和有機氯農(nóng)藥的富集等研究[36]，而關于其形態(tài)學和遺傳多樣性研究未見報道。因此，通過線粒體COⅠ、Cytb和16S rRNA基因探索閩江6個河段河蜆群體的遺傳多樣性及進化速度，對于推進閩江河蜆資源的保護和開發(fā)利用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別從閩江的延平河段(Yanping，YP)、閩侯河段(Minhou，MH)、龍祥島河段(Longxiangdao，LXD)、馬尾河段(Mawei，MW)、長樂河段(Changle，CL)和連江河段(Lianjiang，LJ)隨機采集30個試驗用蜆，共180個個體，采集地點如圖1所示。采集到的河蜆樣本保存于-20℃冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)學性狀測量

隨機選取閩江6個河段河蜆群體樣品共180個，每個河段30個，用紙巾將河蜆貝殼表面的水分吸干后，使用游標卡尺測量殼長(Shell length，SL)、殼高(Shell height，SH)和殼寬(Shell width，SW)，精確到0.01 mm。使用電子天平測量總重(Toll weight，TW)、殼重(Shell weight，SW)和軟體重(Soft body weight，SBW)，精確到0.01 g。河蜆的外形見圖2。

1.2.2 基因組DNA提取

參照TIANamp Marine Animals DNA Kit試劑盒說明書(TIANGEN)的提取方法，每個河段隨機選取12個河蜆斧足組織進行DNA提取。將提取到的72個DNA樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳和純度檢測。

1.2.3 引物合成

從NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找河蜆COⅠ、Cytb和16S rRNA序列，使用Primer Premier 6分別設計COⅠ、Cytb和16S rRNA序列引物(表1)，送至福州擎科生物技術有限公司進行合成。

表1 引物信息

1.2.4 COⅠ、Cytb和16S rRNA基因片段的PCR擴增和測序

COⅠ、Cytb和16S rRNA基因片段的PCR擴增反應體系為 40 μL：Premix TaqTM(TaKaRa)20 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL、去離子水16 μL，擴增程序如表2所示。將PCR產(chǎn)物進行1%凝膠電泳，選取條帶單一且符合預期大小片段的PCR產(chǎn)物，送至福州擎科生物技術有限公司進行雙末端測序。

表2 PCR擴增程序

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2007對形態(tài)學數(shù)據(jù)進行初步計算變異系數(shù)，再采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析和顯著性分析，P<0.05表示組間差異顯著。使用Mega 7軟件Clustal W進行多序列比對，人工校對和計算閩江6個不同河段河蜆群體的COⅠ、Cytb和16S rRNA基因片段序列長度和堿基組成。使用Dnasp 5軟件計算閩江6個河段河蜆群體COⅠ、Cytb和16S rRNA基因的遺傳多樣性。使用Mega 7軟件的最大似然法(Maximum likelihood，ML)和鄰接法(Neighbor-joining，N-J)構建閩江6個河段河蜆群體COⅠ、Cytb和16S rRNA基因片段序列分子系統(tǒng)進化樹。通過中性檢驗Tajima’sD、Fu’sFs和核苷酸不配對分布圖來檢測閩江河蜆的群體歷史動態(tài)。

2 結果與分析

2.1 閩江6個河段河蜆形態(tài)學性狀分析

閩江6個河段河蜆的形態(tài)學性狀統(tǒng)計量見表3。不同河段河蜆殼長、殼高和殼寬的變異系數(shù)較小，而軟體重、殼重和總重的變異系數(shù)較大，其中軟體重、殼重和總重變異系數(shù)最大的群體分別為LJ(53.30%)、MW(48.82%)和MW(49.82%)。LXD群體的殼高/殼長顯著高于YP、MW和CL(P<0.05)，與MH和LJ的差異不顯著(P>0.05)。LJ群體的殼寬/殼長極顯著高于YP、MH、LXD、MW(P<0.01)，與CL的差異不顯著(P>0.05)。MW和LJ群體的軟體重/總重均極顯著高于YP、MH、LXD、CL(P<0.01)，MW和LJ之間的差異不顯著(P>0.05)。LJ群體的殼重/總重極顯著高于YP、MH和MW(P<0.01)，顯著高于CL(P<0.05)，與LXD的差異不顯著(P>0.05)。

表3 閩江6個河段河蜆群體的形態(tài)學性狀統(tǒng)計量(n=180)

2.2 閩江6個河段河蜆群體COⅠ、Cyt b和16S rRNA基因的堿基組成

采集閩江6個河段河蜆群體共72個樣品進行線粒體CO Ⅰ、Cytb和16S rRNA基因PCR擴增、測序和分析。使用MEGA7.0對COⅠ、Cytb和16S rRNA基因序列進行比對、人工校對和剪切后，分別獲得444、466、364 bp的序列片段。COⅠ基因中A、C、T和G四種堿基的平均含量分別為32.3%、16.9%、33.5%和17.3%，A+T和C+G的含量分別為65.8%和34.2%；Cytb基因中A、C、T和G四種堿基的平均含量分別為39.3%、16.0%、32.1%和12.6%，A+T和C+G含量分別為71.4%和28.6%；16S rRNA基因A、C、T和G 4種堿基的平均含量分別為34.6%、15.2%、34.4%和15.7%，A+T和C+G的含量分別為69.1%和30.9%(表4)。閩江6個河段河蜆種群的COⅠ、Cytb和16S rRNA基因堿基組成基本一致。

表4 閩江6個河段河蜆群體COⅠ、Cyt b和16S rRNA基因堿基組成

2.3 閩江6個河段河蜆群體COⅠ、Cyt b和16S rRNA基因的的遺傳多樣性

在COⅠ基因的72條序列中檢出20種單倍型即Hap1～Hap20，其中Hap5為YP獨享單倍型，Hap6～Hap9為LXD獨享單倍型，Hap10～Hap14和Hap16均為MW獨享單倍型，Hap17～Hap18為CL獨享單倍型，Hap19～Hap20為LJ獨享單倍型，其余均為共享型單倍型，如表5所示。6個河段群體的單倍型數(shù)量：MW>CL>LXD>YP >LJ >MH，其中Hap3在6個河段群體中分布最多，占比為31.9%(23/72)。在Cytb基因的71條序列中檢出20種單倍型即Ha1～Ha20，其中Ha1、Ha3為YP獨享單倍型，Ha8～Ha10為LXD獨享單倍型，Ha11～Ha15為MW獨享單倍型，Ha16～Ha20為LJ獨享單倍型，其余均為共享型單倍型，如表5所示。6個河段群體的單倍型數(shù)量：LJ>MW>YP/LXD>CL>MH，其中Ha6在6個河段群體中分布最多，占比為25.4%(18/71)。在16S rRNA基因71條序列中檢出9種單倍型即H1～H9，其中H5～H7為LXD獨享單倍型，H8～H9為MW獨享單倍型，其余均為共享型單倍型，如表5所示。6個河段群體的單倍型數(shù)量：LXD>MW/LJ>YP /MH/CL，其中H2在6個河段群體中分布最多，占比為28.2%(20/71)。

表5 閩江6個河段河蜆群體COⅠ、Cyt b和16S rRNA基因單倍型分布

續(xù)表5

在COⅠ、Cytb和16S rRNA基因中河蜆總的單倍型多樣性、核苷酸多樣性及平均核苷酸差異數(shù)分別為(0.840±0.030)、(0.313±0.008)、136.010，(0.892±0.021)、(0.230±0.001)、98.330和(0.800±0.019)、(0.316±0.009)、108.212(表6)。在COⅠ、Cytb和16S rRNA基因中單倍型多樣性(Hd)最高的群體分別為MW群體、LJ群體和LJ群體，最低的群體分別為MH群體、MH群體和YP群體；核苷酸多樣性(π)最高的群體分別為MW群體、LJ群體和LJ群體，最低的群體分別是YP群體、MW群體和YP群體。

表6 閩江6個河段河蜆群體COⅠ、Cyt b和16S rRNA基因的遺傳多樣性

2.4 閩江6個不同河段河蜆群體系統(tǒng)進化樹

通過ML法和N-J法建立COⅠ、Cytb和16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹，以硬殼蛤(Mercenariamercenaria)作為外類群，bootstrap 1 000。在COⅠ基因ML和N-J系統(tǒng)進化樹中均顯示，11個單倍型(38個個體)聚為一支，置信度分別為89和94，主要分布在MH、LXD、CL、LJ、MW；9個單倍型(34個個體)聚為另一支，主要分布在YP；20個單倍型聚為一大支后再與硬殼蛤相聚(圖3)，表明閩江河蜆有2個種且能與硬殼蛤區(qū)分開。在Cytb基因ML和N-J系統(tǒng)進化樹中均顯示，14個單倍型(49個個體)聚為一支，置信度分別為100和99，主要分布在MW、LJ、CL、LXD、MH；其他6個單倍型(22個個體)與硬殼蛤聚為另一支，主要分布在YP(圖4)。在16S rRNA基因ML和N-J系統(tǒng)進化樹中均顯示，5個單倍體(34個個體)聚為一支，置信度分別為100和99，主要分布在MH、LXD、CL、LJ；另4個單倍體(37個個體)與硬殼蛤聚為另一支，主要分布在YP、MW、CL、LJ(圖5)。表明閩江河蜆線粒體基因的進化速度為COⅠ>Cytb > 16S rRNA。

2.5 閩江6個河段河蜆群體歷史動態(tài)

閩江6個河段河蜆群體COⅠ基因的中性檢驗Tajima’sD值在1.933～2.831之間，其中YP群體差異不顯著(P>0.05)，其余差異極顯著(P<0.01)；Fu’sFs值為10.597～37.394，差異均極顯著(P<0.01)。Cytb基因的中性檢驗Tajima’sD值在-0.395～2.183之間，其中YP群體和CL群體為負值，其余均為正值；MH群體和LJ群體差異顯著(P<0.05)，其余差異不顯著(P>0.05)；Fu’sFs值在0.303～34.509之間，其中只有MW群體差異不顯著(P>0.05)，其余均差異極顯著(P<0.01)。16S rRNA基因的中性檢驗Tajima’sD值在2.182～3.042之間，其中YP群體差異顯著(P<0.05)，其余差異極顯著(P<0.01)；Fu’sFs值在17.796～35.355之間，差異均極顯著(P<0.01)，詳見表7。該3個基因的岐點分布圖均呈多峰型(圖6～圖8)。以上均表明閩江河蜆群體很穩(wěn)定，均未發(fā)生過大規(guī)模的種群擴張等歷史事件。

表7 閩江6個不同河段河蜆COⅠ、Cyt b 和16S rRNA基因的中性檢驗

3 討論

3.1 形態(tài)學差異分析

環(huán)境是影響雙殼類動物個體差異的主要原因之一，雖然河蜆具有因棲息地環(huán)境變化而形成高度形態(tài)變異的特性，但是已有的研究表明形態(tài)差異很難被用于區(qū)分不同河段的河蜆[37-39]。本研究分析了閩江6個河段河蜆群體的形態(tài)學數(shù)據(jù)，結果表明殼長、殼高和殼寬的變異系數(shù)較小，而軟體重、殼重和總重的變異系數(shù)較大，其中軟體重的變異系數(shù)最大，為53.30%，這與學者對凹線仙女蜆(Cyrenobatissasubsulcata)[37]、波紋巴菲蛤(Paphiaundulata)[40]和紅樹蜆(Polymesodaerosa)[41]的研究結果相一致。綜合對比殼高/殼長(LXD>MH>LJ>YP/MW/CL)、殼寬/殼長(LJ>CL>MH>LXD>YP/MW)、軟體重/總重(MW>LJ>YP/LXD/CL>MH)和殼重/總重(LJ>LXD/CL>MH>YP/MW)的數(shù)據(jù)，可以看出YP和MW群體的殼高/殼長、殼寬/殼長和殼重/總重均最小，但MW群體的軟體重/總重最大，YP群體的軟體重/總重居中；表明閩江6個河段的河蜆在形態(tài)上無顯著性差異，因此無法通過形態(tài)學數(shù)據(jù)區(qū)分閩江不同河段的河蜆。

3.2 遺傳多樣性與進化速度比較分析

本研究綜合分析了閩江6個河段河蜆群體的COⅠ(444 bp)、Cytb(466 bp)和16S rRNA(364 bp)基因部分序列片段，3個基因中A+T含量(65.8%、71.4%和69.1%)明顯高于C+G的含量(34.2%、28.6%和30.9%)。撈刀河和洪澤湖河蜆的線粒體COⅠ基因序列中發(fā)現(xiàn)A+T的含量(64.3%和65.0%)高于C+G的含量(35.7%和35.0%)[32，42]，且洞庭湖河蜆線粒體Cytb基因部分序列中也發(fā)現(xiàn)A+T的含量(70.4%)明顯高于C+G的含量(29.6%)[11]，表明了COⅠ和Cytb基因序列在不同地域的河蜆中具有可比性。16S rRNA基因在其他貝類中也有相似的結果，閆永斌等[22]在日本鏡蛤(Dosiniajaponica)、四角蛤蜊(Mactraveneriformis)、中國蛤蜊(Mactrachinensis)和西施舌(Coelomactraantiquata)中發(fā)現(xiàn)A+T (67.11%、61.35%、59.30%和60.59%)含量高于C+G (32.89%、38.65%、40.70%和39.41%)；陳麗梅等[23]在大竹蟶(Solengrandis)、長竹蟶(Solenstrictus)和小刀蟶(Cultellusattenuatus)中發(fā)現(xiàn)A+T (60.8%、62.3%和62.5%)的含量高于C+G (39.2%、37.7%和37.5%)的含量；孫超等[24]在光滑河藍蛤(Potamocorbulalaevis)、黑龍江河藍蛤(P.amurensis)、焦河藍蛤(P.ustulata)河紅肉河藍蛤(P.rubromuscula)中也發(fā)現(xiàn)A+T (61.48%、61.48%、61.53%和61.10%)的含量高于C+G (38.52%、38.52%、38.46%和38.90%)的含量?？梢?A+T)%含量高于(C+G)%是許多雙殼類動物線粒體堿基組成的共性。

單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)是評價生物遺傳多樣性的兩個重要指標[43]。本研究發(fā)現(xiàn)，閩江6個河段河蜆群體COⅠ和Cytb基因的單倍型數(shù)量和多樣性均大于16S rRNA基因，可見COⅠ和Cytb基因的單倍型多樣性比16S rRNA基因高。COⅠ、Cytb和16S rRNA基因核苷酸多樣性差異不大。以上都表明了COⅠ和Cytb基因比16S rRNA基因遺傳多樣性更高。

根據(jù)系統(tǒng)進化樹可以看出，COⅠ基因的ML樹和N-J樹能明顯區(qū)分閩江6個河段河蜆群體20種單倍型與硬殼蛤的親緣關系；而Cytb(20種單倍型)和16S rRNA(9種單倍型)基因ML樹和N-J樹均無法完全區(qū)分他們之間的親緣關系；表明該3個基因片段的進化速度為COⅠ>Cytb>16S rRNA。在4種貝類、3種蟶類和4種河藍蛤的研究中也均出現(xiàn)了COⅠ基因比16S rRNA基因的進化速度更快的結果[22-24]，本研究再一次證明，在雙殼類動物線粒體基因中COⅠ進化速度快于16S rRNA基因。

3.3 群體歷史動態(tài)分析

中性檢驗和核苷酸不配對分布圖是檢驗種群歷史動態(tài)的兩種方法。在中性檢驗中，若Tajima’sD值和Fu’sFs值均為正值，表明種群趨于穩(wěn)定，若Tajima’sD值為負，且統(tǒng)計學上達到顯著水平，表明該群體偏離中性突變理論模型，有可能受到過選擇壓力、瓶頸效應的作用或者發(fā)生過大規(guī)模的群體擴張[44-45]。閩江6個河段河蜆群體COⅠ和16S rRNA基因的中性檢驗Tajima’sD值和Fu’sFs值均為正值。Cytb基因Tajima’sD值中YP群體和CL群體為負值，但統(tǒng)計學上差異不顯著(P>0.05)；Fu’sFs檢驗中6個河蜆群體Fs值均大于零。若核苷酸岐點分布圖呈現(xiàn)多峰型，則表明種群呈穩(wěn)定狀態(tài)，反之，若呈單峰型，則表明種群歷史有擴張現(xiàn)象[31]。閩江6個河段河蜆群體的核苷酸岐點分布圖均呈多峰型。以上均表明了閩江河蜆群體很穩(wěn)定，均未發(fā)生過大規(guī)模的種群擴張等歷史事件。

4 結論

本研究綜合分析了閩江6個河段河蜆群體形態(tài)學數(shù)據(jù)和線粒體CO Ⅰ(444 bp)、Cytb(466 bp)和16S rRNA基因(364 bp)部分序列片段。殼長、殼高和殼寬的變異系數(shù)較小，而軟體重、殼重和總重的變異系數(shù)較大，其中軟體重的變異系數(shù)最大的群體為LJ(53.30%)。在COⅠ、Cytb和16S rRNA基因中A+T含量相近且明顯高于C+G的含量；COⅠ和Cytb 基因的單倍型數(shù)量明顯多于16S rRNA基因；COⅠ和Cytb基因的遺傳多樣性比16S rRNA基因高；進化速度是COⅠ>Cytb>16S rRNA基因。COⅠ、Cytb和16S rRNA基因的中性檢驗和岐點分布圖均表明了閩江河蜆群體很穩(wěn)定。綜上所述，閩江6個河段河蜆群體的COⅠ、Cytb基因比16S rRNA基因遺傳多樣性更高、進化速度更快，即使分化出獨立的遺傳群體，也未發(fā)生過大規(guī)模的種群擴張等歷史事件，可以作為一個整體進行保護和開發(fā)應用。