岳偉芊, 張旭桐, 逯忠斌, 侯志廣, 李月茹, 逯 洲*,,

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部參茸產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室 (長(zhǎng)春)，長(zhǎng)春 130118 )

人參Panax ginsengC.A.Meyer 是五加科人參屬多年生草本植物，具有多種藥理活性[1-3]。人參制品是以人參為原料，經(jīng)過不同的工藝加工炮制而成的。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)以及加工工藝的進(jìn)步，人參制品的種類大大增加，目前主要有生曬參、紅參、人參茶、人參蜜片、人參酒、人參口服液、紅參膏和人參糖等[4]。人參種植周期一般為4 至6 年，期間易發(fā)生多種病蟲害，所以農(nóng)藥的施用必不可少。長(zhǎng)期用藥會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥的積累，這也使得人參制品中存在農(nóng)藥殘留超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要建立適用于多種人參制品的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法。目前對(duì)人參制品中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的研究主要集中于生曬參和紅參[5-9]，而有關(guān)人參蜜片、人參水煎液、人參功能飲料和人參酒中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)則未見相關(guān)報(bào)道，并且國(guó)內(nèi)外均未對(duì)這4 種人參制品中農(nóng)藥的最大殘留限量 (MRL)作出規(guī)定。

QuEChERS (quick, easy, cheap, effective,rugged, and safe) 法是Anastassiades 等于2003 年提出的一種快速、有效的農(nóng)藥殘留樣品前處理方法，主要包括乙腈鹽析提取、分散固相萃取 (d-SPE) 凈化等過程[10]，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留檢測(cè)。為了提高凈化效果，減少基質(zhì)共萃物對(duì)分析結(jié)果的干擾，后續(xù)研究采用不同的凈化材料對(duì)QuEChERS 法進(jìn)行改進(jìn)。有報(bào)道指出，氧化鋯表面具有大量路易斯酸點(diǎn)位，可以吸附脂肪酸等路易斯堿，從而降低基質(zhì)對(duì)分析的干擾[11]。目前，基于氧化鋯 (ZrO2) 開發(fā)的新型材料如氧化鋯改性硅膠 (Z-Sep) 已經(jīng)成功應(yīng)用于多種食品的農(nóng)藥殘留分析[12-15]。與傳統(tǒng)的QuEChERS 法使用的d-SPE 凈化相比，新型的磁性固相分散萃取可以通過磁鐵快速分離提取液和凈化材料，省去了離心步驟，提高凈化的效率[16]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (UHPLC-MS/MS) 法具有高靈敏度、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，與高效液相色譜 (HPLC) 法相比，分析時(shí)間大大縮短，與氣相色譜 (GC) 以及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (GC-MS/MS) 法相比，UHPLC-MS/MS不僅所需分析時(shí)間更短，而且可以檢測(cè)不易揮發(fā)的以及受熱易分解的化合物，現(xiàn)已成為農(nóng)藥殘留分析中最為重要的檢測(cè)手段之一[17-20]。

截至2022 年底，我國(guó)已經(jīng)在人參上登記了43 種農(nóng)藥有效成分[21]。其中，枯草芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌等生物殺菌劑沒有規(guī)定MRL，一些無機(jī)殺菌劑如氫氧化銅和王銅不適用于色譜法分析。因此，本研究選擇其中23 種與UHPLCMS/MS 檢測(cè)適配的農(nóng)藥，并添加了16 種潛在用于人參種植的高效、低毒農(nóng)藥作為檢測(cè)對(duì)象，采用QuEChERS 法快速提取，將Fe3O4-ZrO2首次應(yīng)用于人參制品樣品的凈化，結(jié)合UHPLC-MS/MS建立了4 種人參制品中39 種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法，并用所建立的方法對(duì)采集的人參制品樣品進(jìn)行了篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30 超高效液相色譜儀 (日本Shimadzu 公司)；AB Sciex QTRAP4500 串聯(lián)質(zhì)譜儀 (美國(guó)SCIEX 公司)；Milli-Q 超純水儀 (美國(guó)Millipore 公司)；X1R 型離心機(jī) (美國(guó)ThermoFisher 公司)；TECNAI F20 透射電子顯微鏡 (美國(guó)FEI 公司)。

唑菌酯標(biāo)準(zhǔn)品 (98.30%，天津阿爾塔科技有限公司)；烯酰嗎啉 (98.70%)、嘧菌酯 (99.50%)、雙炔菌酰胺 (99.40%)、咪鮮胺 (98.80%)、嘧霉胺(99.90%)、噻蟲啉 (99.68%)、乙霉威 (99.60%)、噻蟲嗪 (99.60%)、三唑酮 (98.70%)、腈菌唑 (99.90%)、嘧菌環(huán)胺 (99.90%)、氟吡菌胺 (99.30%)、肟菌酯(98.80%)、吡唑醚菌酯 (98.00%)、丙環(huán)唑 (99.00%)、三唑磷 (98.90%)、噻蟲胺 (99.12%)、溴氰蟲酰胺(98.20%)、仲丁靈 (98.70%)、霜靈 (97.60%)、胺苯吡菌酮 (99.60%)、氟唑菌酰胺 (99.00%)、苯醚甲環(huán)唑 (99.90%)、精喹禾靈 (99.00%)、精異丙甲草胺 (98.56%)、戊唑醇 (98.50%)、甲霜靈 (99.90%)、多菌靈 (98.60%)、四氯蟲酰胺 (98.00%)、霜霉威(98.20%)、氟硅唑 (98.00%)、氟吡菌酰胺 (99.70%)、氟嗎啉 (96.50%)、氯蟲苯甲酰胺 (97.80%)、異丙噻菌胺 (98.90%)、吡蟲啉 (99.00%)、氟啶胺 (99.90%)、咯菌腈 (99.80%) 標(biāo)準(zhǔn)品，均購自英國(guó)LGC 公司；Z-Sep 和甲酸銨 (99.995%) (美國(guó)Sigma 公司)；氧化鋯納米顆粒 (南京先豐納米材料科技有限公司)；ZrCl4和FeCl3? 6H2O (上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；FeCl2? 4H2O (上海阿法埃莎化學(xué)有限公司)；乙腈 (色譜純，北京迪科馬科技有限公司)；氯化鈉和無水硫酸鎂 (廣東西隴科學(xué)股份有限公司)；氨水 (純度25.0%，北京化工廠)。4 種人參制品樣品購買自中國(guó)人參主產(chǎn)區(qū)吉林省的超市和藥材商店。

1.2 儀器條件

色譜條件：Phenomenex Kinetex F5 色譜柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A 為5 mmol/L的甲酸銨水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈。梯度洗脫程序：0 min，10% B；1.0 min，10% B；6.0 min，65% B；10.0 min，95% B；11.0 min，95% B；11.1 min，10% B；15.0 min，10% B。柱溫設(shè)置為40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積為2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子和負(fù)離子掃描模式 (ESI+/ESI-)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM)；離子化電壓5500 V (ESI+)/-4500 V (ESI-)；離子源溫度550 ℃；氣簾氣241.3 kPa；噴霧氣和輔助加熱氣310.3 kPa。39 種農(nóng)藥的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)如表1 所示。

表1 39 種農(nóng)藥的檢測(cè)參數(shù)Table 1 Detection parameters of 39 pesticides

1.3 樣品制備

1.3.1 Fe3O4-ZrO2的合成 在文獻(xiàn)方法[22]的基礎(chǔ)上合成Fe3O4-ZrO2：將1.585 g FeCl2? 4H2O、3.785 g FeCl3? 6H2O、2.500 g ZrCl4以及160 mL除氧水加入250 mL 三口燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，80 ℃磁力攪拌1 h。隨后快速加入22.5 mL氨水，在相同條件下繼續(xù)攪拌1 h。冷卻至室溫后，用磁鐵收集產(chǎn)物并用超純水洗滌，直到pH 值達(dá)到7。最后，將產(chǎn)物置于80 ℃烘箱內(nèi)6 h，冷卻后研磨，保存在干燥器中待用。

1.3.2 人參制品樣品的前處理 將人參蜜片在80 ℃下烘干24 h，粉碎，稱取5 g (精確至0.01 g) 至50 mL離心管中，加入10 mL 超純水，渦旋混勻后浸泡30 min；人參功能飲料或人參水煎液量取10.0 mL，置于50 mL 離心管中。向離心管中加入10.0 mL乙腈，2500 r/min 渦旋1 min。隨后加入4 g 無水硫酸鎂和1 g 氯化鈉，渦旋1 min，5000 r/min離心5 min。取1 mL 上清液加入裝有凈化材料的2 mL 離心管 (人參蜜片和人參水煎液用100 mg Fe3O4-ZrO2凈化，人參功能飲料用25 mg Fe3O4-ZrO2凈化)，渦旋10 s，使用磁鐵磁力收集2 min。取上清液，過0.22 μm 濾膜后待測(cè)。

人參酒是有機(jī)相和水相的混合物。其中，有機(jī)相無法通過鹽析與乙腈分層，而水相會(huì)被凈化材料吸附導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，人參酒取1 mL 過0.22 μm 濾膜后直接上機(jī)，無需其他處理。

1.4 方法驗(yàn)證

稱取39 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別加入10 mL乙腈溶解，配制成1000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；使用39 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制成20 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用乙腈或空白基質(zhì)提取液 (人參蜜片、人參水煎液和人參功能飲料) 以及人參酒的空白基質(zhì)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成0.005、0.01、0.02、0.05 和0.1 mg/L 的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用1.2 節(jié)中的條件檢測(cè)，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (x)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo) (y)，權(quán)重為1/x，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在0.01、0.1、1 μg/g 3 個(gè)添加水平下，對(duì)4 種人參制品空白樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)5 次。由于1 μg/g 添加水平下樣品中分析物的濃度超出了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，因此，使用空白人參制品提取物將該添加水平的樣品稀釋10 倍以達(dá)到范圍內(nèi)濃度。采用1.3.2節(jié)中的方法處理樣品，在1.2 節(jié)的條件下檢測(cè)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

基質(zhì)效應(yīng) (ME) 是由基質(zhì)共萃物離子化引起的，是UHPLC-MS/MS 分析中影響方法準(zhǔn)確度、精密度的重要因素之一。按 (1) 式計(jì)算ME。

式中Sm為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，Ss為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME > 20% 時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，-20% ≤ ME ≤ 20%時(shí)基質(zhì)效應(yīng)不明顯，當(dāng)ME ＜-20%時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)[23]。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用針泵在10 μL/min 流速下將1.0 mg/L 的39 種標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入質(zhì)譜，得到每個(gè)化合物的母離子以及兩個(gè)特征定性子離子，以響應(yīng)最高的子離子作為定量離子。分別優(yōu)化去簇電壓 (DP) 和碰撞能 (CE)，以提高母離子與子離子的響應(yīng)。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取方法的優(yōu)化 Lehotay 等在對(duì)QuEChERS

法進(jìn)行驗(yàn)證的過程中發(fā)現(xiàn)，在非酸性基質(zhì)中，一些對(duì)堿性pH 敏感的農(nóng)藥回收率較低[24]。為解決此問題，Anastassiades 等又開發(fā)了檸檬酸鹽緩沖體系將基質(zhì)的pH 值調(diào)節(jié)至弱酸性，使對(duì)堿性pH 敏感的農(nóng)藥的回收率提高到70%以上[25]。本研究對(duì)比了非緩沖QuEChERS 法和檸檬酸鹽緩沖QuEChERS法對(duì)人參蜜片、人參水煎液以及人參功能飲料中39 種農(nóng)藥提取回收率的影響，結(jié)果 (圖1) 表明：采用無緩沖QuEChERS 法提取人參蜜片、人參水煎液以及人參功能飲料中39 種農(nóng)藥的回收率分別為73%～101%、75%～109%和74%～94%，RSD 分別為1.5%～12%、2.4%～16%和1.4%～15%；而采用檸檬酸鹽緩沖QuEChERS 法提取，相應(yīng)的農(nóng)藥回收率分別為78%～109%、80%～99% 和71%～91%，RSD 分別為1.8%～14%、1.5%～13% 和0.8%～17%。兩種方法均滿足農(nóng)藥殘留分析標(biāo)準(zhǔn)的要求 (回收率為70%～120%，RSD ≤ 20%)[26]，這可能是由于本方法中包含的農(nóng)藥對(duì)提取環(huán)境酸堿度不敏感造成的。因此，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，本研究選用無緩沖QuEChERS 法作為提取方法。

圖1 不同提取方式從人參水煎液、人參功能飲料、人參蜜片和人參酒中提取39 種農(nóng)藥的回收率(n = 5)Fig.1 Recoveries (n = 5) of 39 pesticides from ginseng decoction, ginseng energy drink, honey ginseng slices and ginseng wine extracted by different methods

2.2.2 凈化材料的優(yōu)化 對(duì)合成的產(chǎn)物使用透射電子顯微鏡 (TEM) 和能量色散X 射線衍射 (EDX)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2 所示。圖2(a)顯示制備的產(chǎn)物呈顆粒狀，圖2(b)顯示產(chǎn)物中含有Fe、O 和Zr，經(jīng)過測(cè)試，所制備的產(chǎn)物具有磁性，上述結(jié)果 (圖2) 表明本研究成功合成了Fe3O4-ZrO2。

圖2 Fe3O4-ZrO2 的表征：(a) 透射電子顯微鏡圖像，(b) 能量色散X 射線衍射圖像Fig.2 Characterizations of Fe3O4-ZrO2: (a) transmission electron microscope (TEM) image,(b) energy-dispersive X-ray diffraction (EDX) image

ZrO2中的鋯原子含有空的d 軌道，可以作為電子受體吸附脂肪酸和氨基酸等化合物[17,25]。Z-Sep已經(jīng)作為凈化材料廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析。因此，本研究選取了3 種ZrO2材料 (ZrO2納米顆粒、Z-Sep、Fe3O4-ZrO2) 并對(duì)比分析了它們?cè)?5、50 和100 mg 3 種用量下的回收率和凈化效果。

不同用量下使用Z-Sep 凈化人參蜜片、人參水煎液和人參功能飲料提取液，39 種農(nóng)藥在人參蜜片中的回收率分別為63%～93%、69%～90%和72%～95%，在人參水煎液中分別為54%～92%、59%～97%和63%～97%，在人參功能飲料中分別為45%～97%、45%～89%和52%～96%。不同用量下使用ZrO2納米顆粒凈化3 種基質(zhì)，在人參蜜片中的回收率分別為71%～103%、79%～97% 和77%～93%，在人參水煎液中分別為61%～91%、73%～96%和75%～97%，在人參功能飲料中分別為74%～98%、70%～92%和80%～98%。除霜霉威以外，其余農(nóng)藥回收率均在70%～120%之間。不同用量下使用Fe3O4-ZrO2凈化3 種樣品，在人參蜜片中的回收率分別為78%～97%、72%～95%和78%～98%，在人參水煎液中分別為71%～96%、72%～93%和77%～95%，人參功能飲料中分別為76%～108%、74%～98%和77%～95%。所有凈化材料都提供了良好的回收率。

在獲得良好回收率的同時(shí)，凈化材料應(yīng)盡可能多的去除基質(zhì)共萃物。本研究通過高效液相色譜法對(duì)比了3 種空白人參制品在不同凈化條件下的基質(zhì)背景。如圖3 所示，在相同用量下Fe3O4-ZrO2最大程度地降低了基質(zhì)背景，對(duì)人參水煎液和人參蜜片的凈化效果最好，而3 種材料對(duì)人參功能飲料的凈化效果基本相同，這是因?yàn)槿藚⒐δ茱嬃现刑砑拥娜藚⒊煞州^少。由于磁性材料的成本優(yōu)勢(shì)及快速凈化能力，選用Fe3O4-ZrO2凈化人參功能飲料。如圖4 所示，100 mg Fe3O4-ZrO2對(duì)基質(zhì)背景的去除效果最佳，對(duì)人參水煎液和人參蜜片的凈化效果最好，而3 種用量對(duì)人參功能飲料的凈化效果基本相同。ZrO2材料對(duì)人參制品提取液的凈化能力一方面來自于鋯原子上的路易斯酸點(diǎn)位對(duì)脂肪酸、氨基酸等路易斯堿的吸附，另一方面可能是因?yàn)殇喸优c含有羥基、羧基等基團(tuán)的人參皂苷、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)等化合物形成氫鍵而產(chǎn)生的吸附。3 種ZrO2材料的凈化效果不同，可能是因?yàn)橄嗤|(zhì)量下不同材料中鋯含量不同所造成的。綜上所述，本研究選用100 mg Fe3O4-ZrO2作為人參蜜片和人參水煎液的凈化材料，選用25 mg Fe3O4-ZrO2作為人參功能飲料的凈化材料。

圖3 使用相同用量的不同ZrO2 基材料凈化人參水煎液、人參功能飲料和人參蜜片后的基質(zhì)背景Fig.3 Matrix background of ginseng decoction, ginseng energy drink and honey ginseng slices that cleaned-up by different ZrO2-based sorbents at the same dosage

圖4 使用不同用量的Fe3O4-ZrO2 凈化人參水煎液、人參功能飲料和人參蜜片后的基質(zhì)背景Fig.4 Matrix background of ginseng decoction, ginseng energy drink and honey ginseng slices that cleaned-up by different amounts of Fe3O4-ZrO2

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系和基質(zhì)效應(yīng) 39 種農(nóng)藥在不同基質(zhì)中的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù) (r) 以及基質(zhì)效應(yīng)如表2 所示，在0.005～0.1 mg/L 的濃度范圍內(nèi)，39 種化合物在4 種人參制品中的線性良好，r大于0.99。在人參蜜片、人參功能飲料、人參水煎液和人參酒中分別有72%、36%、8%以及31%的農(nóng)藥存在基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，因此采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

表2 39 種農(nóng)藥在不同基質(zhì)中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Equations, correlation coefficient (r) and matrix effects (MEs) of 39 pesticides in different matrices

2.3.2 添加回收率和定量限 添加回收試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示，在0.01、0.1、1 mg/kg 3 個(gè)添加水平下，39 種農(nóng)藥在人參蜜片中的平均回收率為72%～117%，RSD 為0.7%～18%；在人參水煎液中的平均回收率為77%～115%，RSD 為0.7%～15%；在人參功能飲料中的平均回收率為74%～104%，RSD 為0.6%～16%；在人參酒中的平均回收率為77%～104%，RSD 為1.0%～16%。本研究以最低添加水平作為方法的定量限 (LOQ)，4 種人參制品基質(zhì)中39 種農(nóng)藥的LOQ 均為0.01 mg/kg。39 種農(nóng)藥的典型MRM 色譜圖如圖5所示。

圖5 0.01 mg/kg 添加水平下人參蜜片中39 種農(nóng)藥的MRM 色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of the 39 pesticides at spiking level of 0.01 mg/kg in honey ginseng slices

表3 39 種農(nóng)藥在4 種人參制品中的平均回收率(Rec.)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)Table 3 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 39 pesticides in 4 ginseng products

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

用建立的方法對(duì)吉林省市場(chǎng)上采集的人參蜜片 (n= 20)、人參水煎液 (n= 20)、人參功能飲料(n= 20) 及人參酒 (n= 20) 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，在所有樣品中均未檢出方法中所含農(nóng)藥的殘留。

3 結(jié)論

本研究建立了通過UHPLC-MS/MS 快速檢測(cè)4 種人參制品中39 種農(nóng)藥殘留的方法。該方法通過QuChERS 法提取，F(xiàn)e3O4-ZrO2快速凈化。經(jīng)驗(yàn)證，F(xiàn)e3O4-ZrO2對(duì)樣品的凈化效果比ZrO2納米顆粒和Z-Sep 更好，方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。該方法具有高通量、凈化效果好且操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可作為相關(guān)農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)篩查的技術(shù)依據(jù)。