王秀君，朱文博，朱天嬌，張秋萍，龐小可，許繼飛*

（1.內(nèi)蒙古大學生態(tài)與環(huán)境學院，呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境污染控制與廢物資源化重點實驗室，呼和浩特 010021；3.山西師范大學生命科學學院，太原 030031；4.南開大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300350）

畜禽糞便作為抗生素抗性基因（Antibiotic resis?tance genes，ARGs）的儲存池已成為當下的研究熱點[1]。四 環(huán) 素類ARGs（Tetracycline resistance genes，TRGs）在畜禽糞便中頻頻檢出，為糞源ARGs 的主要門類[2-3]。同時，畜禽糞便也是一種應(yīng)用價值高且常見的農(nóng)業(yè)有機肥料[4]。由此，糞源ARGs 可能會隨著畜禽糞便應(yīng)用和養(yǎng)殖廢水排放進入土壤、水體等自然環(huán)境，并經(jīng)食物鏈傳遞等途徑進入植物、動物體中，進而對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成潛在威脅。

厭氧消化是糞便資源化的常用方式之一，可對糞源ARGs 在環(huán)境中的傳播和擴散起控制作用[5]。作為消化基質(zhì)，畜禽糞便的理化性質(zhì)將影響厭氧消化對糞源ARGs 的作用效果，其中，氨氮可為ARGs 宿主微生物提供氮源，也可作為厭氧消化系統(tǒng)的緩沖劑，增強消化系統(tǒng)穩(wěn)定性，然而，氨氮濃度高會抑制微生物的生命活動，進而導致消化失敗[6]。朱文博等[7]的研究表明氨氮濃度對厭氧消化中糞源ARGs 的相對豐度變化有顯著影響。Zhang 等[8]的研究發(fā)現(xiàn)豬糞中的ARGs經(jīng)中溫厭氧消化后的總相對豐度隨糞便中氨氮濃度的升高而升高，且ARGs 發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移的概率也隨之增加。對于養(yǎng)殖場中的畜禽糞便，其氨氮濃度可能會隨著養(yǎng)殖單元、養(yǎng)殖規(guī)模和清糞方式的不同而有差異。美英等[9]研究發(fā)現(xiàn)從產(chǎn)奶牛舍和待產(chǎn)牛舍收集的糞便中氨氮濃度高于其他養(yǎng)殖單元，且大規(guī)模養(yǎng)殖場的氨氮濃度高于中小規(guī)模養(yǎng)殖場。此外，高溫會促進畜禽糞便中氨氮的釋放，夏季奶牛糞便中氨氮濃度高于冬季。于厭氧消化而言，高溫厭氧消化較中溫厭氧消化更有利于減少ARGs 的豐度[10-11]，然而，畜禽糞便中氨氮濃度對高溫厭氧消化中糞源ARGs豐度變化及其驅(qū)動因子的影響尚有待闡明。

本研究以TRGs為目的基因，以牛糞為消化基質(zhì)，并外源添加尿素以形成牛糞氨氮濃度梯度；在確保高溫厭氧消化可運行的情況下，探究氨氮濃度對牛糞高溫厭氧消化系統(tǒng)中TRGs豐度變化的影響，分析TRGs、可移動遺傳元件（Mobile genetic elements，MGEs）和微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性以揭示TRGs豐度變化的驅(qū)動因子，以期進一步加深對畜禽糞便理化性質(zhì)與厭氧消化工藝削減ARGs效果相互作用關(guān)系的理解。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

本試驗利用無菌聚乙烯塑料瓶于內(nèi)蒙古呼和浩特某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場采集新鮮牛糞（記為U0），4 ℃保存運回實驗室。牛糞理化性質(zhì)于48 h內(nèi)測定，其余樣品于-80 ℃保存。新鮮牛糞初始理化性質(zhì)：可溶性COD（SCOD）濃度為7 575.00 mg·L-1；氨氮濃度為595.30 mg·L-1；pH 為6.08；總揮發(fā)酸（TVFAs）濃度為3 092.47 mg·L-1。為避免引入其他化學元素，采用尿素（CH4N2O）為外源添加物調(diào)節(jié)牛糞中氨氮濃度，并以牛糞和尿素的混合物作為厭氧消化基質(zhì)。一般認為，當厭氧消化中的氨氮濃度超過1 500 mg·L-1時會對厭氧消化產(chǎn)生不利影響[12]，基于此，本試驗消化基質(zhì)中氨氮濃度最終設(shè)定為600、1 100 mg·L-1和1 600 mg·L-1，記為U1、U2 和U3。選用500 mL 厭氧培養(yǎng)瓶為厭氧消化反應(yīng)器。培養(yǎng)瓶內(nèi)添加400 mL 新鮮牛糞和尿素混合物后通氮氣5~8 min。發(fā)酵濃度為8%。以未檢出ARGs 的厭氧微生物菌劑（廣州微生源，中國）為接種物，接種率為0.1%（m/m）。利用水浴法保證反應(yīng)溫度為（55±1）℃，每組處理設(shè)置3個重復。

1.2 樣品采集與理化性質(zhì)測定

采用排水法收集氣體，并每日記錄日產(chǎn)氣量。當日產(chǎn)氣量小于5%反應(yīng)體積（25 mL·d-1）時，視作厭氧消化反應(yīng)終點。在反應(yīng)前、反應(yīng)第6 天、第16 天、第28 天和第45 天（反應(yīng)結(jié)束）時采集樣品。將1 mL 樣品收集于離心管內(nèi)，12 000 r·min-1離心5 min，上清液用于理化性質(zhì)測定，沉淀物于-80 ℃保存，用于TRGs、MGEs 和16S rRNA 的定量分析以及微生物群落分析。

沼氣成分采用沼氣分析儀（MRU Optima7，德國）分析測定；SCOD 采用重鉻酸鉀法測定；氨氮采用納氏試劑光度法測定；pH 值采用pH 計（PHS-3E，上海雷磁）測定；TVFAs采用酸性氯化鐵比色法測定；堿度采用滴定法測定。

1.3 ARGs與MGEs定量分析

基因組DNA 的提?。翰捎眉S便基因組DNA 提取試劑盒（天根DP-328，北京）提取每毫升樣品沉淀物中的DNA，詳細步驟參見試劑盒說明書。所提取的DNA 用超微量紫外分光光度計（Nanodrop-2000，美國）檢測其含量和純度（A260/280為1.7~2.0）。

實時熒光定量PCR（qPCR）：通過普通PCR 儀（ABI 9902，美國）檢測樣品中的TRGs 和MGEs，目的基因為編碼外排泵基因（tetA、tetC、tetG），編碼核糖體保護蛋白基因（tetO、tetQ、tetT），轉(zhuǎn)座酶修飾基因（tetX）以及MGEs（intI1，intI2和Tn916/1545）。采用熒光定量系統(tǒng)（Bio-Rad CFX96，美國）對上述目的基因進行定量分析，qPCR 所用引物序列、退火溫度和反應(yīng)程序等詳見文獻[10，13]。

1.4 高通量測序與微生物群落結(jié)構(gòu)分析

委托上海派森諾生物公司利用Illumina Novaseq平臺進行16S rRNA 高通量測序。測序區(qū)域為V3~V4區(qū)，引 物 為338F（ACTCCTACGGCAGGCAGCA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）?；跍y序獲得的原始序列經(jīng)Qiime 2 平臺中的dada 2 軟件質(zhì)控去噪獲得擴增子序列變異（Amplicon sequence variants，ASVs），將代表序列ASV 與SILVA 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫進行比對，使用Na?ve Bayes 分類器對物種進行注釋，獲得每個分類水平下的物種豐度信息。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 軟件整理原始試驗數(shù)據(jù)；利用SPSS 22.0 進行單因素方差分析及Pearson 相關(guān)性分析；采用Origin Pro 9.0 繪制柱狀圖和折線圖；采用R3.5.3繪制熱圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨氮濃度對牛糞厭氧消化性能的影響

圖1 為不同氨氮濃度下牛糞高溫厭氧消化產(chǎn)氣速率和氨氮累積情況。當氨氮濃度為600 mg·L-1和1 100 mg·L-1時，厭氧消化分別在第4天和第5天達到產(chǎn)氣峰值，最大產(chǎn)氣速率分別為933 mL·d-1和800 mL·d-1，總產(chǎn)氣量分別為8 036 mL 和7 696 mL。雖然氨氮濃度為1 100 mg·L-1的厭氧消化較600 mg·L-1的厭氧消化在產(chǎn)氣性能方面略有降低，但未表現(xiàn)出顯著差異（P>0.05）。然而，當氨氮濃度升高至1 600 mg·L-1時，厭氧消化的產(chǎn)氣峰值推遲至第12天，其最大產(chǎn)氣速率（280 mL·d-1）與其余兩試驗組相比分別下降了70%和65%，且其總氣量（4 773 mL）較另兩組厭氧消化也分別下降了40%和38%，這可能是因為牛糞中較高的氨氮濃度及其后續(xù)累積對系統(tǒng)中的產(chǎn)甲烷菌活性造成了不良影響，進而影響了厭氧消化性能[14]。各試驗組的產(chǎn)氣速率均在第30 天趨于穩(wěn)定，并于第44 天結(jié)束。消化結(jié)束時，600、1 100 mg·L-1和1 600 mg·L-1處理的氨氮濃度分別累積至790、1 428 mg·L-1和2 201 mg·L-1（圖1b）。

圖1 牛糞高溫厭氧消化過程中日產(chǎn)氣速率和氨氮累積情況Figure 1 Biogas production rate and the concentration of ammonia during thermophilic anaerobic digestion based on diary manure

2.2 氨氮濃度對TRGs絕對豐度的影響

圖2 為TRGs 的絕對豐度在厭氧消化中的變化。如圖2a 所示，7 種目的基因均在牛糞中檢測出，包括tetA、tetC、tetG、tetO、tetQ、tetT 和tetX，總絕對豐度為5.02×109copies·mL-1。tetQ的絕對豐度在7種目的基因中占比最大，為53%。這可能與多數(shù)tetQ 潛在宿主菌能夠在常溫環(huán)境下存活有關(guān)[15]。消化過程中，不同氨氮濃度條件下TRGs的總絕對豐度均隨消化反應(yīng)的進行先下降后升高，但氨氮濃度為600 mg·L-1的拐點發(fā)生在消化晚期（第28~45 天），而氨氮濃度為1 100 mg·L-1和1 600 mg·L-1的拐點發(fā)生在消化初期（第6~16 天），且1 600 mg·L-1的反應(yīng)體系中TRGs 總絕對豐度始終高于600 mg·L-1和1 100 mg·L-1的反應(yīng)體系（P<0.05）。這可能與在較高氨氮濃度（1 600 mg·L-1）的厭氧消化體系中微生物的停滯期延長有關(guān)[16]。各TRG 在氨氮濃度為600 mg·L-1和1 100 mg·L-1的消化過程中均被削減，但tetA和tetG卻在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的消化過程中大量增加。消化結(jié)束后，TRGs的總絕對豐度在氨氮濃度為1 600 mg·L-1條件下最高，為1.70×109copies·mL-1；在氨氮濃度為600 mg·L-1和1 100 mg·L-1條件下TRGs 的總絕對豐度接近，分別為4.56×108copies·mL-1和4.6×108copies·mL-1。箱線圖中的中位數(shù)可表示TRGs絕對豐度在厭氧消化后的平均水平（圖2b）。在氨氮濃度為1 600 mg·L-1時，厭氧消化后TRGs 的平均水平最高，為7.50 logs，該水平與氨氮濃度為1 100 mg·L-1的試驗組接近（7.36 logs），當氨氮濃度為600 mg·L-1時，厭氧消化后TRGs 的平均水平最低，為6.67 logs，該結(jié)果表明高氨氮濃度的厭氧消化削減的TRGs 較少（P<0.05）。此外，對各TRG 在不同條件下厭氧消化后的絕對豐度進行對比可知，tetA、tetG、tetQ、tetT 和tetX 的絕對豐度在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的條件下最高，特別是te?tA 和tetG，這兩個基因經(jīng)此條件下的厭氧消化后變?yōu)橄暗?.05 倍和1.85 倍。TetO 的絕對豐度在氨氮濃度為1 100 mg·L-1的條件下最高。僅tetC 的絕對豐度在氨氮濃度為600 mg·L-1的條件下最高，但其絕對豐度在數(shù)值上與其他條件下的結(jié)果無顯著差異（P>0.05）。

圖2 牛糞厭氧消化過程中不同時間和不同處理的TRGs絕對豐度Figure 2 Absolute abundance of TRGs during anaerobic digestion based on diary manure

2.3 氨氮濃度對MGEs絕對豐度的影響

MGEs 是ARGs 在不同微生物之間轉(zhuǎn)移的重要媒介，對ARGs 在環(huán)境中的擴散起重要作用，因此，檢控其在厭氧消化中的絕對豐度變化十分重要。如圖3a所示，在牛糞原料中，目的MGEs（intI1、intI2和Tn916/1545）均存在，其總絕對豐度為1.46×108copies·mL-1，其中Tn916/1545 的占比最高，為66%。隨著消化反應(yīng)的進行，MGEs 的總絕對豐度均先升高后下降。消化過程中，氨氮濃度為1 600 mg·L-1的試驗組中MGEs 的總絕對豐度始終顯著高于其他兩試驗組。消化結(jié)束時，氨氮濃度為600、1 100 mg·L-1和1 600 mg·L-1條件下的總絕對豐度分別為3.40×107、2.26×107copies·mL-1和6.01×108copies·mL-1。圖3b 為各MGEs 絕對豐度在厭氧消化前后的倍數(shù)變化值（值大于1表示基因增加，小于1表示基因減少）。氨氮濃度為1 100 mg·L-1和600 mg·L-1的厭氧消化反應(yīng)體系中各MGE 及其總絕對豐度均表現(xiàn)為削減，而氨氮濃度為1 600 mg·L-1的條件下MGEs 的總絕對豐度在消化后增加了4.11 倍，這是因為在該條件下intI1 和intI2較厭氧消化前分別增加了10.55 倍和11.85 倍（圖3b）。整合子（intI1 和intI2）被認為是ARGs 發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子[17-18]。上述結(jié)果表明牛糞厭氧消化中氨氮濃度高時MGEs 將增加，由此TRGs 在不同微生物之間轉(zhuǎn)移風險也將升高。

圖3 厭氧消化過程中MGEs絕對豐度及其變化Figure 3 Absolute abundance of MGEs and their changes during anaerobic digestion based on diary manure

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)變化

微生物是ARGs 豐度變化的主要驅(qū)動因子[19]，其可能造成不同氨氮濃度條件下厭氧消化中TRGs絕對豐度變化差異。圖4 為厭氧消化過程中門水平微生物群落結(jié)構(gòu)變化。在牛糞原料中，Bacteroidetes 為優(yōu)勢菌門，占比為34%，其次為Firmicutes和Proteobacte?ria，占比分別為32%和17%。消化過程中，不同處理中的優(yōu)勢菌門發(fā)生改變。在消化初期（第6 天），氨氮濃度為600 mg·L-1和1 100 mg·L-1的厭氧消化系統(tǒng)中Firmicutes 變?yōu)榈谝粌?yōu)勢菌門，占比高達71%和80%，而在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的條件下消化系統(tǒng)中第一優(yōu)勢菌門為Proteobacteria（51%），F(xiàn)irmicutes 僅占34%。隨著消化反應(yīng)的進行，F(xiàn)irmicutes 的占比逐漸增大并變?yōu)榈谝粌?yōu)勢菌門，Bacteroidetes 逐漸消失。這與Firmicutes 對氨氮濃度的耐受性高而Bacteroide?tes 的生長會受到氨氮濃度的抑制有關(guān)[20]。不同處理間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異主要由第二優(yōu)勢菌門造成。消化結(jié)束時，氨氮濃度為600 mg·L-1的系統(tǒng)中次要優(yōu)勢菌門為Spirochaetes，而氨氮濃度為1 600 mg·L-1的系統(tǒng)中次要優(yōu)勢菌門為Proteobacteria。研究表明Fir?micutes 對厭氧消化中纖維素的分解起關(guān)鍵作用，其優(yōu)勢地位也反映出氨氮濃度較高時反應(yīng)體系中乙酸的積累[21]。Spirochaetes 多出現(xiàn)在底物匱乏的厭氧消化器中，能夠發(fā)酵葡萄糖為乙酸、乙醇等[22]，而Proteo?bacteria 多為寡營養(yǎng)厭氧菌，其在有機質(zhì)較少的環(huán)境中易生存[7]。Wang 等[23]的研究表明上述菌門均為ARGs 的常見潛在宿主菌門，其豐度的差異可能是不同氨氮水平下TRGs絕對豐度差異的原因。

圖4 厭氧消化過程中門水平細菌群落結(jié)構(gòu)Figure 4 Relative abundances of bacterial community at the phylum level during anaerobic digestion

圖5 為厭氧消化過程中屬水平微生物（前50）的相對豐度變化，其中按行（樣本）對數(shù)據(jù)進行標準化。經(jīng)厭氧消化后，屬水平微生物變化較為明顯。一些菌屬經(jīng)厭氧消化后相對豐度顯著降低甚至被消滅，如Acinetobacter、Coprococcus和Clostridium等，而一些菌屬經(jīng)厭氧消化后相對豐度顯著增加，如Syntrophomon?as、Ruminococcus和Treponema等。不同氨氮濃度條件下厭氧消化體系中屬水平微生物差異也較為明顯。消化初期（第6 天），Comamonas、Pusillimonas和Sedi?mentibacter的相對豐度隨氨氮濃度的升高而降低，而unidentified_Desulfovibrionaceae、 unidentified_MBA08

圖5 厭氧消化過程中屬水平細菌物種豐度Figure 5 Relative abundances of bacteria the genus level during anaerobic digestion

和Pusillimonas的相對豐度則呈相反趨勢，且unidenti?fied_Pseudomonadaceae和unidentified_Thermoanaero?bacterales在氨氮濃度為1 100 mg·L-1的體系中最高。隨著消化反應(yīng)的進行，同一階段不同處理的優(yōu)勢菌屬均不同，表明微生物的群落結(jié)構(gòu)受到了氨氮濃度的影響。消化結(jié)束時，unclassified_Planococcaceae、uniden?tified_MBA08和Arcobacter為氨氮濃度1 600 mg·L-1條件下的優(yōu)勢菌屬，而unidentified_Bacteroidales和BF311為氨氮濃度1 100 mg·L-1條件下的優(yōu)勢菌屬，unidentified_Porphyromonadaceae和Sphaerochaeta為氨氮濃度600 mg·L-1條件下的優(yōu)勢菌屬。上述結(jié)果表明，不論消化過程中還是消化結(jié)束時，不同牛糞氨氮濃度條件下厭氧消化體系中的屬水平微生物均存在差異。當這些微生物攜帶TRGs 時，勢必會在一定程度上造成TRGs的豐度差異。由此，微生物與TRGs的關(guān)系需進一步分析。

2.5 TRGs、MGEs和微生物的相關(guān)性分析

在厭氧消化體系中ARGs 可通過垂直基因轉(zhuǎn)移（Vertical gene transfer，VGT）和水平基因轉(zhuǎn)移（Hori?zontal gene transfer，HGT）兩種方式在微生物間傳播，其中，HGT 是ARGs 在環(huán)境中被獲得和傳播的主要途徑，具有更大環(huán)境危害性[24]。為考察不同氨氮濃度條件下TRGs 絕對豐度變化的驅(qū)動因子，對TRGs 與MGEs和屬水平微生物進行相關(guān)性分析（圖6）。TRGs與微生物之間的相關(guān)性分析可識別TRGs的潛在宿主菌。潛在宿主菌的相對豐度變化可在一定程度解釋TRGs的豐度變化[25]。如圖6 所示，tetO、tetQ、tetT 和tetX 擁有較多的潛在宿主，且多為共同宿主菌，如Clostridium、Comamonas和Coprococcus等。這些潛在宿主菌的相對豐度隨著氨氮濃度的升高而降低（圖5），與上述TRGs經(jīng)不同氨氮濃度條件的厭氧消化之后絕對豐度的表現(xiàn)一致。tetC 與其潛在宿主菌也具有類似關(guān)系。tetA 和tetG 擁有的潛在宿主較少。不同氨氮濃度厭氧消化體系中tetA 和tetG 的潛在宿主菌的分布情況也有較明顯差異。tetA 的潛在宿主菌主要存在于氨氮濃度為600 mg·L-1的反應(yīng)體系中，而tetG 的潛在宿主菌則主要分布在氨氮濃度為1 100 mg·L-1的反應(yīng)體系中。tetA 和tetG 的大部分潛在宿主菌在氨氮濃度600 mg·L-1條件下的相對豐度較高，在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的反應(yīng)體系中較少，如Paludibacter和Bacteroides，這與厭氧消化后tetA 和tetG 的絕對豐度變化矛盾。對MGEs 和TRGs 進行相關(guān)性分析可知，在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的反應(yīng)體系中，tetA 與intI1呈顯著正相關(guān)（P<0.05），而tetG與intI2呈顯著正相關(guān)（P<0.05），表明tetA 和tetG 的增加與intI1 和intI2 的增加有關(guān)。這可能是因為牛糞中較高的氨氮濃度對微生物的DNA 造成了損傷，引發(fā)了微生物的SOS 反應(yīng)，因此，在形成質(zhì)粒的過程中整合子及其上的TRGs 也被快速復制[26-27]。上述結(jié)果表明潛在宿主菌的相對豐度變化可在一定程度上解釋TRGs 絕對豐度的變化，但氨氮濃度為1 600 mg·L-1的牛糞厭氧消化反應(yīng)體系中部分TRGs 可能主要以HGT 途徑增加，不利于通過厭氧消化方式控制TRGs 在環(huán)境中的傳播。

圖6 TRGs、MGEs和屬水平微生物的相關(guān)性分析Figure 6 Correlation analysis among TRGs，MGEs and bacterial community the genus level

3 結(jié)論

（1）氨氮濃度為1 600 mg·L-1時，tetA 和tetG 的絕對豐度在牛糞高溫厭氧消化后增加。不同氨氮濃度條件下，tetC、tetO、tetQ、tetT 和tetX 的絕對豐度在消化后均減少。

（2）不同氨氮濃度條件下牛糞厭氧消化后體系中的第一優(yōu)勢菌門均為Firmicutes。氨氮濃度為1 600 mg·L-1條件下消化后體系中的第二優(yōu)勢菌門為Proteobac?teria，而氨氮濃度為1 100 mg·L-1和600 mg·L-1條件下消化后體系中的第二優(yōu)勢菌門為Spirochaetes。

（3）四環(huán)素類抗生素抗性基因（TRGs）潛在宿主菌的種類和數(shù)目差異可在一定程度上解釋TRGs在消化過程中絕對豐度的變化。相關(guān)性分析表明，在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的厭氧消化反應(yīng)中tetA 和tetG 的增加主要與intI1 和intI2 的增加有關(guān)，說明利用含有較高氨氮濃度的牛糞進行厭氧消化時，TRGs 進行水平基因轉(zhuǎn)移的可能性較大，TRGs 在環(huán)境中進一步擴散的風險較高。