馬玉捷 文星星 申童 向瓊昊

摘要：本調(diào)查旨在了解弓形蟲(chóng)病在校園流浪動(dòng)物（犬、貓）體內(nèi)的感染情況，于2018.9月～2022.2月期間，在湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院采集流浪犬、貓血清樣品及糞便樣品共52份，采用熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行犬貓弓形蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣品共有17份，陽(yáng)性率為32.69％，其中犬樣本21份，陽(yáng)性樣品6份，陽(yáng)性率為28.57％；貓樣本21份，陽(yáng)性樣品11份，陽(yáng)性率為35.48％。

關(guān)鍵詞：流浪動(dòng)物；弓形蟲(chóng)；檢測(cè)；熒光探針?lè)?/p>

隨著國(guó)內(nèi)寵物行業(yè)的迅猛發(fā)展，社會(huì)上的流浪動(dòng)物數(shù)量也與日俱增。流浪犬貓主要是指散布在城市公園、社區(qū)以及城鄉(xiāng)接合部的無(wú)主人的犬和貓。它們主要來(lái)源于兩方面：一是由被棄養(yǎng)的伴侶犬貓組成；二是由流浪犬貓自由交配、繁殖產(chǎn)生的后代[1]。流浪犬貓幾乎遍布每個(gè)城市。流浪犬貓大多沒(méi)有注射疫苗及驅(qū)蟲(chóng)，容易攜帶諸多病原菌、寄生蟲(chóng)等，從而造成疾病的傳播。

犬貓弓形蟲(chóng)病（Toxoplasmosis）是由剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）引起的一種人畜共患的原蟲(chóng)病。弓形蟲(chóng)幾乎可以感染所有的溫血?jiǎng)游?，貓既是弓形蟲(chóng)的中間宿主又是其終末宿主，而人類(lèi)和其他動(dòng)物只是中間宿主[2]。人以及其他哺乳動(dòng)物通過(guò)攝入含有感染期蟲(chóng)體的食物，包括生肉、蛋制品、奶制品、飲用水而感染。也可經(jīng)破損皮膚、黏膜以及通過(guò)胎盤(pán)由母體垂直傳播而感染。蒼蠅、蟑螂以及節(jié)肢動(dòng)物也可以攜帶并傳播弓形蟲(chóng)卵囊[2]。其可引起妊娠期婦女流產(chǎn)、胎兒發(fā)育不良、死胎等，還可以引起男性不育，弓形蟲(chóng)是計(jì)劃生育、優(yōu)生優(yōu)育的大敵。因此，防止弓形蟲(chóng)病的傳播已經(jīng)成為我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。校園寵物隨著學(xué)生畢業(yè)等種種原因被遺棄在各大高校內(nèi)形成一定數(shù)量的流浪動(dòng)物群體。校園流浪犬貓已成為各大高校出現(xiàn)的共同問(wèn)題。因此對(duì)校園流浪犬貓的弓形蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查是對(duì)長(zhǎng)沙城區(qū)流浪犬貓弓形蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查的重要組成部分。

湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)有大量流浪犬貓，由于食物和健康無(wú)法保證，其很可能感染攜帶弓形蟲(chóng)。而校園內(nèi)有大量師生能夠接觸到流浪動(dòng)物，由此可能產(chǎn)生一系列關(guān)系到人身健康的問(wèn)題。流浪動(dòng)物隨地排泄，發(fā)情期易攻擊人等情況，使得人與動(dòng)物的矛盾沖突近年來(lái)也在不斷加劇，因此，調(diào)查校園內(nèi)流浪犬貓的重要人畜共患病——弓形蟲(chóng)攜帶和感染情況顯得尤為重要。為全面掌握校園內(nèi)流浪犬貓弓形蟲(chóng)的感染情況，采用熒光探針?lè)▽?duì)動(dòng)物體內(nèi)弓形蟲(chóng)特異性基因片段進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 被檢樣品

對(duì)湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)流浪犬貓進(jìn)行血液采集或糞便采集。對(duì)于可以捕捉的39只犬貓施行捕捉麻醉后采血并做絕育手術(shù)。對(duì)于不能捕捉的動(dòng)物收集其糞便進(jìn)行檢測(cè)。2018年9月～2022年2月期間共收集到52份樣本，其中貓血清樣本21，糞便樣本10，犬血清樣本11，糞便樣本10。

1.2 樣品采集

動(dòng)物麻醉后無(wú)菌采集受檢動(dòng)物的靜脈血1.0～1.5ml，離心析出血清，-20℃冷凍備用。采集動(dòng)物糞便樣本3～5g/份，采集后立刻放入無(wú)菌采便管內(nèi)，

-20℃冷凍備用。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，定性測(cè)定犬貓樣本中的弓形蟲(chóng)基因的特異性片段。

1.3 試劑

弓形蟲(chóng)免核酸提取實(shí)時(shí)熒光PCR一鍵式試劑盒?？ㄓ鹊仙锟萍加邢薰?，批號(hào)S2004-07Y。

1.4 儀器

CoyoteBio Mini8 plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，北京尤卡迪生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備

從試劑盒中取出TOX-PCR反應(yīng)液，待其充分溶解后，振蕩混勻5s，瞬時(shí)離心5s。根據(jù)所要檢測(cè)的樣本數(shù)，取相應(yīng)份數(shù)的反應(yīng)液，20μl/份，于0.2ml PCR反應(yīng)管中備用。試劑用畢后立即放入-20℃保存。

1.5.2 樣本處理

糞便樣本處理：挑取固體糞便樣本0.1g（黃豆粒大?。┲?00μl樣本稀釋液中渦旋振蕩1min，13000 rpm離心10 min，取50μl上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，70℃加熱2min，加熱后取20μl加熱處理后的樣本加入2μl糞便樣本裂解液混勻。加入樣本裂解液，混勻處理后應(yīng)立即加入PCR反應(yīng)體系中。血樣本處理：血清樣本經(jīng)樣本稀釋液（或生理鹽水）稀釋5倍后，即可直接上樣；

1.5.3 加樣

在分裝有TOX-反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中分別加入5μl處理后的待檢樣本、TOX-陽(yáng)性對(duì)照品或TOX-陰性對(duì)照品2μl（用3μl樣本稀釋液將總體積補(bǔ)足到25μl）。壓緊管蓋，瞬時(shí)離心。

1.5.4 PCR擴(kuò)增

將加完樣的PCR管按照相對(duì)應(yīng)的位置放置到CoyoteBio Mini8 plus儀器里，等待運(yùn)行。按照說(shuō)明書(shū)操作儀器軟件。檢測(cè)結(jié)束后查看檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。

2 結(jié)果

利用實(shí)時(shí)熒光PCR（熒光探針）方法對(duì)湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)流浪的21只犬31只貓進(jìn)行了弓形蟲(chóng)基因特異性片段的檢測(cè)，其中17動(dòng)物檢測(cè)為陽(yáng)性，感染率為32.69%，有6犬檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，感染率為28.57%，有11只貓檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，感染率為35.48%。具體感染情況見(jiàn)表。

3 討論

3.1 弓形蟲(chóng)的分布

弓形蟲(chóng)為世界性分布，在人群中感染較普遍，全世界有1/4的人口受到威脅，血清陽(yáng)性率平均為25%～50%，有的高達(dá)85%以上[3]。據(jù)我國(guó)第二次寄生蟲(chóng)病調(diào)查顯示，我國(guó)一般人群弓形蟲(chóng)的平均感染率在7.89%[4]，動(dòng)物飼養(yǎng)員陽(yáng)性率明顯高于普通人群。獸醫(yī)和屠夫在各職業(yè)中感染率最高，達(dá)9.20%和7.70%。2006年青島市調(diào)查表明飼養(yǎng)寵物者弓形蟲(chóng)感染率為11.86%，未飼養(yǎng)寵物者為7.38%，飼養(yǎng)寵物者弓形蟲(chóng)感染高于未飼養(yǎng)寵物者[5]。2016年調(diào)查表明寵物犬和鄉(xiāng)村犬弓形蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率分別為14.5 %和24.6%，流浪貓和寵物貓弓形蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率分別為24.1%和13.4 %[6]。2011年對(duì)長(zhǎng)沙城區(qū)504只犬貓弓形蟲(chóng)的調(diào)查結(jié)果表明長(zhǎng)沙地區(qū)犬貓弓形蟲(chóng)感染率較高已達(dá)24.4%[7]；

本次針對(duì)湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)52只流浪犬貓進(jìn)行弓形蟲(chóng)檢測(cè)顯示，流浪動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染率為32.69%，其中流浪犬感染率達(dá)28.57%，流浪貓感染率達(dá)35.48%。高于長(zhǎng)沙城區(qū)家養(yǎng)寵物弓形蟲(chóng)感染率24.4%，也高于北京鄉(xiāng)村犬抗體陽(yáng)性率24.6%與流浪貓抗體陽(yáng)性率24.1%以及國(guó)外Harold Salant和Spira Dan T.的調(diào)查結(jié)果16.8%[8]。這可能與本次調(diào)查的樣本數(shù)量、檢測(cè)方法有關(guān)。由于流浪犬貓?jiān)趹敉庖捠常妒呈箢?lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)等弓形蟲(chóng)中間宿主，易接觸到節(jié)肢動(dòng)物、蚯蚓這類(lèi)弓形蟲(chóng)卵囊攜帶者，其食入弓形蟲(chóng)包囊和卵囊的機(jī)會(huì)要比家養(yǎng)犬貓大得多。因此流浪犬貓弓形蟲(chóng)感染率高于室內(nèi)飼養(yǎng)的犬貓。

3.2 弓形蟲(chóng)的檢測(cè)

犬貓感染弓形蟲(chóng)后是否發(fā)病取決于蟲(chóng)株的毒力、感染數(shù)量和途徑以及宿主免疫力等因素。貓對(duì)弓形蟲(chóng)的敏感性差，僅有少數(shù)出現(xiàn)臨床癥狀。人和動(dòng)物感染弓形蟲(chóng)多呈無(wú)癥狀的隱性感染，因此只能通過(guò)醫(yī)學(xué)檢測(cè)來(lái)確定是否感染。弓形蟲(chóng)病的檢查分為免疫學(xué)檢查和病原體檢查。目前臨床上主要應(yīng)用是免疫學(xué)方法，包括血清特異性抗體的診斷以及血清中弓形蟲(chóng)循環(huán)抗原的檢測(cè)[9]。已有多種血清學(xué)方法用于弓形蟲(chóng)病的診斷，包括間接血凝試驗(yàn)（IHA）、間接熒光抗體實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等方法。常見(jiàn)弓形蟲(chóng)的檢查指標(biāo)包括（1）特異性IgM抗體：該抗體常出現(xiàn)在感染早期，提示近期內(nèi)存在弓形蟲(chóng)感染，是急性期感染的標(biāo)志。IgM滴度達(dá)到高峰后很快降到低水平；（2）特異性IgG抗體：感染后IgG抗體在血液中出現(xiàn)較晚，但達(dá)到高峰后會(huì)基本穩(wěn)定在一個(gè)較高的滴度，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，是既往感染的標(biāo)志。因此健康帶蟲(chóng)者可長(zhǎng)期存在IgG抗體，曾感染弓形蟲(chóng)而現(xiàn)已治愈者IgG抗體仍可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。（3）循環(huán)抗原CAg：早期或現(xiàn)癥感染的指標(biāo)。抗原檢測(cè)的靈敏性和特異性都較高，可作為確診依據(jù)。弓形蟲(chóng)的病原體檢測(cè)一般有三種：第一種，直接涂片法，在涂片中的細(xì)胞漿內(nèi)尋找弓形蟲(chóng)。第二種，動(dòng)物接種。第三種，細(xì)胞培養(yǎng)。但病原體檢查操作復(fù)雜，檢出率較低，動(dòng)物接種和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，目前在臨床應(yīng)用較少，意義不大。

3.3 弓形蟲(chóng)的傳播

動(dòng)物是弓形蟲(chóng)的重要傳染源，弓形蟲(chóng)在它的生活史中，除配子體外，包括滋養(yǎng)體、包囊和卵囊都是均具有感染性的。蟲(chóng)體在宿主內(nèi)的形式多樣，包括感染力較強(qiáng)的速殖子、生長(zhǎng)緩慢感染力較差的緩殖子及卵囊等。在自然界感染最多的是貓科動(dòng)物，貓既是弓形蟲(chóng)的中間宿主又是其終末宿主，而人類(lèi)和其他動(dòng)物只是中間宿主。弓形蟲(chóng)僅在貓?bào)w內(nèi)進(jìn)行有性繁殖形成卵囊，并隨其糞便排出體外。校園內(nèi)流浪犬貓因撿拾垃圾，捕食鼠類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)等感染弓形蟲(chóng)。感染的貓排出弓形蟲(chóng)卵囊，進(jìn)入環(huán)境中的卵囊經(jīng)過(guò)2～4d發(fā)育成具有感染性的成熟卵囊。這些卵囊可以長(zhǎng)期存在于外界環(huán)境中[10]。當(dāng)其他動(dòng)物或家養(yǎng)寵物接觸被卵囊污染的土壤、水后易感染弓形蟲(chóng)。

3.4 流浪動(dòng)物對(duì)弓形蟲(chóng)的影響

流浪犬貓的繁殖力驚人，一只流浪母貓一年產(chǎn)仔2胎，每胎產(chǎn)仔4～10只[1]。流浪犬貓大多未進(jìn)行絕育手術(shù)，其大量無(wú)序繁殖導(dǎo)致城市流浪動(dòng)物數(shù)量急劇增多。因此帶來(lái)的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題都日益尖銳。目前，流浪犬貓問(wèn)題已成為世界性的熱點(diǎn)問(wèn)題，各國(guó)對(duì)于流浪犬貓如何處理的問(wèn)題也在不斷探索。對(duì)于校園流浪動(dòng)物的管理，一方面應(yīng)借助專業(yè)學(xué)科力量為其進(jìn)行絕育手術(shù)以控制數(shù)量。另一方面應(yīng)定期對(duì)校園環(huán)境中的犬貓排泄物進(jìn)行清理、消毒。校園內(nèi)家養(yǎng)犬應(yīng)使用引導(dǎo)繩牽引外出，避免犬在外撿食或接觸流浪貓排泄物。家養(yǎng)貓應(yīng)完全室內(nèi)飼養(yǎng)，避免其捕食老鼠、蚯蚓等中間宿主。飼喂寵物商品糧，不應(yīng)飼喂生肉或半熟肉。避免寵物感染弓形蟲(chóng)病。

犬貓作為與人類(lèi)關(guān)系密切的動(dòng)物，在弓形蟲(chóng)的傳播過(guò)程中起著非常重要的作用，充分了解校園內(nèi)流浪犬貓的弓形蟲(chóng)感染狀況對(duì)該病的防控以及公共衛(wèi)生具有重要的指導(dǎo)意義。校園流浪犬貓已成為各大高校出現(xiàn)的共同問(wèn)題。因此對(duì)校園流浪犬貓的弓形蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查是對(duì)城區(qū)流浪犬貓弓形蟲(chóng)感染情況調(diào)查的重要組成部分。同時(shí)對(duì)于校園內(nèi)可抓捕的流浪動(dòng)物進(jìn)行絕育手術(shù)在很大程度上控制了流浪動(dòng)物的數(shù)量以及人畜共患病的傳播。

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