肖莉春，杜娟，2 綜述，張芳梅，2，朱迎男，2 審校

1.鄭州大學(xué)藥物安全性評價研究中心，河南 鄭州 450001；2.鄭州大學(xué)藥物研究院，河南 鄭州 450001

2020年3月，新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）成為全球性大流行?。╬andemic），給人類生活帶來巨大影響。COVID-19 的病原體嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）持續(xù)在全球范圍內(nèi)感染人類，據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）數(shù)據(jù)顯示，自暴發(fā)以來，SARSCoV-2 引起的COVID-19 大流行已導(dǎo)致全球超過5 億人感染，600多萬人死亡［1］。SARS-CoV-2是冠狀病毒家族成員，與β冠狀病毒相似，基因組大小為29 900 bp，具有由基因組RNA 和磷酸化的核衣殼蛋白組成的核衣殼，核衣殼位于磷脂雙分子層中，表面覆蓋有兩種刺突蛋白：存在于所有冠狀病毒中的刺突糖蛋白三聚體（S）和僅存在于某些冠狀病毒中的血凝素酯酶（hemagglutinin esterase，HE）。膜蛋白M 和E 蛋白包膜位于病毒包膜中的S蛋白之間。

SARS-CoV-2 在復(fù)制過程中易出錯，大量復(fù)制可引起多種變異。一旦出現(xiàn)一種適應(yīng)性好的變異株，則可能引起廣泛傳播。SARS-CoV-2 刺突蛋白的亞基S1 被認(rèn)為是一個突變熱點，可能在毒性、傳播能力和宿主免疫逃逸方面具有很高的臨床相關(guān)性，其他突變也可能導(dǎo)致病毒對抗SARS-CoV-2 抗體的抵抗力增強(qiáng)。與原型株相比，變異株的傳播能力更強(qiáng)，且可不同程度地逃逸宿主的免疫反應(yīng)。由于發(fā)病率高，潛伏時間較長，人類對SARS-CoV-2無免疫力，而且目前缺乏有效的治療手段和特效藥物。因此，迫切需要開發(fā)安全有效的疫苗來控制并防止SARSCoV-2 的進(jìn)一步傳播，而SARS-CoV-2 疫苗的非臨床安全性評價作為臨床使用前的最后一關(guān)至關(guān)重要。

本文參考國內(nèi)外指導(dǎo)原則和相關(guān)文獻(xiàn)，對當(dāng)前SARS-CoV-2 疫苗的非臨床安全性評價的研究進(jìn)展作一概述，以期為SARS-CoV-2 疫苗的非臨床研究提供參考。

1 國內(nèi)外指導(dǎo)原則

為指導(dǎo)和規(guī)范SARS-CoV-2 疫苗的研發(fā)工作，WHO、國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）、美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）、歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）等全球衛(wèi)生組織或監(jiān)管機(jī)構(gòu)和日本獨立行政法人醫(yī)藥品醫(yī)療器械綜合機(jī)構(gòu)（Pharmaceuticals and Medical Devices Agency，PMDA）均發(fā)布了評估SARS-CoV-2 疫苗緊急使用的相關(guān)非臨床／臨床研究框架和指南。

WHO發(fā)布的《Considerations for evaluation of COVID-19 vaccines》［2］中提到，針對其他冠狀病毒（SARSCoV 和MERS-CoV）的某些疫苗構(gòu)建動物模型的研究引發(fā)了人們對新冠疫苗相關(guān)的增強(qiáng)性呼吸道疾?。╡nhanced respiratory disease，ERD）理論風(fēng)險的擔(dān)憂。目前人們對SARS-CoV-2 疫苗相關(guān)ERD 潛在風(fēng)險的認(rèn)識和理解有限，對可用動物模型在預(yù)測人類發(fā)生此類事件可能性方面的了解也十分有限。但研究動物模型（如嚙齒動物和非人類靈長類動物）對解決疫苗相關(guān)ERD 的潛在風(fēng)險至關(guān)重要。另外，為適合每個納入的SARS-CoV-2 抗原，研究應(yīng)包括對體液、細(xì)胞和功能免疫反應(yīng)的評估，還應(yīng)考慮使用抗原特異性ELISA 來表征體液反應(yīng)。細(xì)胞反應(yīng)的評估應(yīng)包括使用敏感和特異性的試樣檢測CD8+和CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)，應(yīng)在任一野生型病毒的體外中和試驗或假病毒微量中和試驗中進(jìn)行免疫反應(yīng)的活性評估。

美國FDA 發(fā)布的《Development and licensure of vaccines to prevent COVID-19》［3］中指出，SARS-CoV-2候選疫苗非臨床研究的目的是通過體外和體內(nèi)試驗確定其免疫原性和安全性特征。動物模型的非臨床研究有助于識別疫苗潛在的安全風(fēng)險，并指導(dǎo)臨床研究中使用劑量、給藥方案和給藥途徑的選擇。對于由一種新產(chǎn)品類型組成的SARS-CoV-2 候選疫苗，如無先前的非臨床和臨床數(shù)據(jù)，在進(jìn)行首次人類試驗（first in human，F(xiàn)IH）前，需進(jìn)行非臨床安全性研究。應(yīng)選擇對SARS-CoV-2 疫苗抗原有反應(yīng)的動物模型開展免疫原性研究，以評估SARS-CoV-2 候選疫苗的免疫特性，并支持首次FIH臨床試驗。

日本PMDA 發(fā)表的《Principles for the evaluation of vaccines against the novel coronavirus SARS-CoV-2》［4］中提到，SARS-CoV-2 候選疫苗的非臨床安全性評價研究應(yīng)按照良好實驗室規(guī)范（good laboratory practice，GLP）的規(guī)定進(jìn)行。為了支持臨床試驗，通常需進(jìn)行安全藥理學(xué)、一般毒性（多劑量毒性）和局部刺激的評估。用于非臨床安全性評價研究的試驗物質(zhì)應(yīng)是適當(dāng)反映其特性（成分、配方、制造工藝和控制等）的配方，且其劑量應(yīng)包含臨床試驗中的最大人用劑量。在開始臨床試驗前，任何作為預(yù)防傳染病的SARS-CoV-2 候選疫苗均需確認(rèn)疫苗功能和評估疫苗的免疫原性，檢驗相關(guān)動物對候選疫苗的免疫反應(yīng)。此外，為了評價SARS-CoV-2 疫苗可能引起的潛在疾病增強(qiáng)風(fēng)險，在開始臨床試驗前，必須對使用候選疫苗所引起的免疫反應(yīng)進(jìn)行描述。

2020 年8 月，中國NMPA 發(fā)布了《新型冠狀病毒用疫苗研發(fā)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》［5］和《新型冠狀病毒預(yù)防用疫苗非臨床有效性研究與評價技術(shù)要點（試行）》［6］，建議非臨床安全性評價研究進(jìn)行SARSCoV-2的攻擊試驗以評價疫苗的保護(hù)效果；建立劑量與生物效價的關(guān)系，在藥效學(xué)試驗中探索免疫程序和接種途徑，為臨床試驗方案提供參考。在開展臨床試驗前，需有疫苗的免疫原性、體內(nèi)保護(hù)力等藥效學(xué)研究數(shù)據(jù)。

2 SARS-CoV-2感染的實驗?zāi)Ｐ?/h2>

2.1 體外模型

與SARS-CoV、MERS-CoV 和其他新出現(xiàn)的病毒一樣，體外模型可了解病毒復(fù)制動力學(xué)和病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷概況。SARS-CoV-2 的研究涉及諸多體外模型，包括原代細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞系、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，IPSC）的細(xì)胞、器官芯片、類器官和組織塊，見表1。

表1 體外模型在COVID-19研究中的優(yōu)勢和局限性Tab.1 Strengths and limitations of in vitro models in COVID-19 research

2.1.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)物 基于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）和跨膜蛋白酶絲氨酸2 型（transmembrane protease serine type 2，TMPRSS2）的高表達(dá)，人氣道上皮細(xì)胞如鼻杯狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞、支氣管細(xì)胞為SARS-CoV-2 藥物篩選提供了臨床相關(guān)模型［7］。PIAAORNO等［8］利用在氣液界面（air-liquid interface，ALI）培養(yǎng)的人氣道上皮（human airway epithelium，HAE）來表征病毒傳染動力學(xué)、組織水平的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)重塑、SARS-CoV-2 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄免疫特征，是用于評估瑞德西韋或瑞德西韋-地爾硫卓聯(lián)合對抗SARS-CoV-2 抗病毒活性的有效模型。由于該模型可很好地再現(xiàn)病毒-宿主細(xì)胞的相互作用（如在受感染的上呼吸道和下呼吸道），已被用于評估抗病毒藥物的療效［9］。

2.1.2 細(xì)胞系 細(xì)胞培養(yǎng)模型可表征細(xì)胞向性、病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和新出現(xiàn)病毒的復(fù)制，因此被用于研究SARS-CoV-2 感染［10］。Caco-2 是一種來自人類結(jié)直腸腺癌的上皮細(xì)胞系，已被用于評估COVID-19 病理。ELLINGER 等［11］利用Caco-2細(xì)胞系篩選了5 632 種化合物，以檢測其抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的潛力。Caco-2 細(xì)胞還揭示了與SARS-CoV-2 感染相關(guān)的途徑，包括核酸代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)、翻譯和剪接［12］。

CHU 等［13］分析了25 個細(xì)胞株的差異敏感性，并比較了SARS-CoV-2 的復(fù)制能力，采用定量反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行評估［14］，結(jié)果顯示，在120 h內(nèi)，SARS-CoV-2在人類胃腸道（Caco-2）和呼吸道（Calu-3）細(xì)胞中感染并復(fù)制至類似水平。該研究為SARS-CoV-2 的細(xì)胞取向、復(fù)制動力學(xué)和細(xì)胞損傷提供了有意義的信息，但研究者也指出了這些細(xì)胞株的一些局限性：首先，細(xì)胞系間的趨向性可能不能完全反映SARS-CoV-2在生理條件下復(fù)制和影響人體器官的方式；其次，研究僅使用了一種病毒分離株（但與其他報道的SARSCoV-2分離株高度同源）；另外，人體器官和組織中含有多種異質(zhì)性表達(dá)ACE2的細(xì)胞類型。

2.1.3 IPSC 的細(xì)胞 雖然原代細(xì)胞培養(yǎng)模型常被用于研究SARS-CoV-2，但其在體外維持時間較短，而且由于基因組改變，細(xì)胞系可能不能精確地對SARSCoV-2 感染做出反應(yīng)。相比之下，IPSC 與人體組織細(xì)胞相似性更高。IPSC來源細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組與其各自的主要對應(yīng)物相似，同時可對免疫刺激做出反應(yīng)。目前，已有幾種IPSC 類型用于開發(fā)藥物、系統(tǒng)探索SARS-CoV-2趨向性以及研究細(xì)胞對感染的反應(yīng)。

2.1.4 類器官 由于具有克服二維培養(yǎng)和永生細(xì)胞株局限性的潛力，干細(xì)胞的體外三維細(xì)胞培養(yǎng)方法的出現(xiàn)受到了廣泛關(guān)注［15］。類器官是主要由多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC）或多能成體干細(xì)胞在組織中建立的三維結(jié)構(gòu)。其由特定組織的細(xì)胞類型組成，通過細(xì)胞分類和自我組織，生成具有相應(yīng)組織功能和結(jié)構(gòu)特征的細(xì)胞組合。類器官最優(yōu)地包含目標(biāo)器官中存在的全部分化細(xì)胞類型［16］。許多類器官被用于在單細(xì)胞和組織之間研究SARS-CoV-2 感染，由于SARS-CoV-2 的主要感染靶點是呼吸道，多個研究組已使用肺類器官來模擬人的肺。腭扁桃體是免疫系統(tǒng)抵御病原體的第一道防線，扁桃體上皮細(xì)胞衍生的類器官具有相應(yīng)組織的鮮明特征，已被用于研究冠狀病毒感染和COVID-19 生物學(xué)特征。盡管類器官技術(shù)有許多優(yōu)點，但一個重要的限制是在體內(nèi)器官之間缺乏通信。因此，這些發(fā)現(xiàn)需在更復(fù)雜的模型中進(jìn)行驗證。人類的類器官培養(yǎng)仍處于發(fā)展階段，許多研究仍在進(jìn)行中。

2.1.5 器官芯片 器官芯片技術(shù)為模擬人體器官感染提供了一個特殊的平臺。人體器官芯片是用人體細(xì)胞填充的微流體裝置，可再現(xiàn)組織-組織界面、流體流動、機(jī)械信號和器官水平的生理學(xué)［17］。SI 等［18］開發(fā)了一種以人肺氣道上皮為襯里的器官芯片微流控培養(yǎng)裝置，細(xì)胞在ALI 條件下由連續(xù)流動的培養(yǎng)基培養(yǎng)。該模型模擬了病毒的進(jìn)入、復(fù)制和宿主細(xì)胞因子的產(chǎn)生，為加快藥物再利用提供了一個更有利的平臺。肺部是SARS-CoV-2 感染的主要靶點，可導(dǎo)致輕度或重度肺損傷綜合征，最終可能導(dǎo)致多器官功能衰竭。肺泡是肺的主要功能單位，肺泡-毛細(xì)血管屏障在維持氣體交換和防止病毒感染傳播方面起著重要作用。許多嚴(yán)重的COVID-19 病例發(fā)展為進(jìn)行性呼吸衰竭，導(dǎo)致死亡的部分原因是彌漫性肺泡損傷、炎癥和肺炎。因此，肺芯片三維模型可通過精確的流體流動，在正常和疾病狀態(tài)下建立SARSCoV-2引起的肺損傷模型。

2.1.6 組織塊 組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)背景下發(fā)生的人類細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-病原體相互作用的研究對于破譯許多正常和致病過程的潛在機(jī)制具有重要意義［19］。由手術(shù)切除材料建立的穩(wěn)定的體外模型-組織外植體或器官培養(yǎng)，可在細(xì)胞培養(yǎng)模型和動物模型之間的水平上成為高度匹配的平臺。與其他體外方法相比，這些模型具有幾個獨特的優(yōu)勢：通常保留其起源區(qū)域的組織結(jié)構(gòu)，保持細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，并允許直接進(jìn)行實時觀察［20］。人肺組織外植體是比較SARS-CoV-2 與SARS-CoV 的病毒動力學(xué)、細(xì)胞向性和先天免疫反應(yīng)最有效的體外模型之一。

2.2 體內(nèi)模型

體外方法可能無法洞察有害的體內(nèi)效應(yīng)。因此，迫切需要開發(fā)用于研究SARS-COV-2對靶器官的影響和全身感染效應(yīng)的動物模型。動物物種的選擇在疫苗非臨床評估中十分重要。動物模型應(yīng)盡可能模仿需預(yù)防的人體疾病，且能夠證明疫苗對疾病的預(yù)防作用。目前已有多種動物模型用于SARS-COV-2疫苗的非臨床安全性試驗，其中包括小鼠、倉鼠、雪貂、非人靈長類（non-human primate，NHP）模型等，每種模型各有優(yōu)點和局限性，見表2。

表2 體內(nèi)模型在COVID-19研究中的優(yōu)勢和局限性Tab.2 Strengths and limitations of in vivo models in COVID-19 research

2.2.1 小鼠 由于小鼠ACE2（mACE2）不像hACE2易與SARS-CoV-2結(jié)合，實驗室小鼠品系不易被SARSCoV-2 感染［21-22］。為提升SARS-CoV-2 的易感性，基于基因修飾的多種干預(yù)措施已被引入。SUN 等［23］介紹了一種基于腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的可感染SARS-CoV-2 的小鼠模型（Ad5-hACE2-致敏小鼠），這些小鼠可發(fā)展為肺炎，其特征是體重減輕、嚴(yán)重的肺部病理和高滴度病毒在肺部復(fù)制。該模型為研究COVID-19 的發(fā)病機(jī)制以及潛在的治療模式提供了一個有效工具。另一個建議的模型是細(xì)胞角蛋白18（cytoke-ratin 18，K18）-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠，其中hACE2的表達(dá)受上皮細(xì)胞K18 啟動子的驅(qū)動。這些轉(zhuǎn)基因小鼠與嚴(yán)重的COVID-19感染有許多共同特征［24］。

除了轉(zhuǎn)基因小鼠外，研究者還對感染了適應(yīng)型SARS-CoV-2 變異株的野生型小鼠進(jìn)行了COVID-19病理學(xué)研究。GU 等［25］通過給小鼠接種SARS-CoV-2有效感染幼齡和老年BALB／c 小鼠，引起中度肺炎和炎癥反應(yīng)。DINNON 等［26］利用反向遺傳學(xué)重塑病毒S 蛋白和mACE2 的結(jié)合界面，繞過了病毒S 蛋白和mACE2 的低效相互作用，產(chǎn)生了利用mACE2 進(jìn)入的重組病毒（SARS-CoV-2 MA）。無論小鼠鼠齡大小，這種SARS-CoV-2 MA 均能在小鼠上下氣道中復(fù)制。雖然這兩種野生型小鼠模型被認(rèn)為是藥物和疫苗篩選的可靠平臺，但它們可能不能完全概括人類疾病的所有方面［27］。

2.2.2 倉鼠 敘利亞金倉鼠是另一種被廣泛用于模擬SARS-CoV-2 感染的小型嚙齒動物［28-30］。倉鼠ACE2對SARS-CoV-2 S 糖蛋白受體結(jié)合域具有高親和力。CHAN 等［31］發(fā)現(xiàn)，除人類和恒河猴外，倉鼠ACE2對S蛋白的親和力最高。此外，SARS-CoV-2 分離株在倉鼠肺中的高效復(fù)制，可導(dǎo)致鼻內(nèi)感染后嚴(yán)重的病理性肺部病變［32］。值得注意的是，感染了SARS-CoV-2的倉鼠，除表現(xiàn)出疾病的臨床癥狀外，還可通過直接接觸和／或氣溶膠將病毒傳播給同居的動物［33］。盡管該模型可概括人類發(fā)病機(jī)制的某些方面，但受感染的動物可在感染后2 周內(nèi)恢復(fù)至原來的體質(zhì)量，并產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)其免受SARS-CoV-2 隨后的再次感染［34-35］。另一項實驗中，OSTERRIEDER 等［36］比較了幼齡倉鼠和老齡倉鼠的感染過程，發(fā)現(xiàn)兩組倉鼠的上、下呼吸道病毒復(fù)制率相同，但僅在幼年倉鼠中觀察到肺部快速恢復(fù)，這與人類年齡相關(guān)的差異有相似性。因此，倉鼠模型是研究SARS-CoV-2 傳播、發(fā)病機(jī)制、治療和疫苗接種的有效模型。

2.2.3 雪貂 在研究流感病毒和SARS-CoV 引起的人類疾病中，雪貂是一種非常有效的動物模型，因為其呼吸道在解剖學(xué)上與人類相似，且其在氣管和支氣管的Ⅱ型肺泡和顆粒上皮細(xì)胞上大量表達(dá)ACE2［37-38］。此外，雪貂ACE2 含有關(guān)鍵的SARS-CoV 結(jié)合殘基，使其對SARS-CoV-2 敏感［39-40］。受感染的雪貂在上呼吸道顯示出高病毒滴度，因此，可通過直接或間接接觸發(fā)生雪貂之間的高效傳播［41］。RICHARD 等［42］對雪貂傳播模式進(jìn)行了研究，在間接接受者中發(fā)現(xiàn)了受感染的病毒，表明SARS-CoV-2 雪貂模型再現(xiàn)了人與人之間的傳播。考慮到SARS-CoV-2 在人類中的快速傳播，雪貂成為了解COVID-19傳播動態(tài)的有力模型。

2.2.4 NHP SARS-CoV-2 的NHP 模型因其具有與人類的遺傳同源性和解剖相似性，成為模擬人類發(fā)病機(jī)制和測試臨床干預(yù)措施的黃金標(biāo)準(zhǔn)［43］。恒河猴ACE2 刺突活性高，是一種易受SARS-CoV-2 感染的NHP［44-45］，已廣泛應(yīng)用于評估醫(yī)療措施的有效性。目前研究者正在開發(fā)多種候選疫苗，并在NHP 模型中評估其有效性。

LU 等［46］比較了3 種NHP，包括恒河猴、食蟹猴和普通狨猴，用相同的SARS-COV-2菌株進(jìn)行攻擊，以確定最適合COVID-19的模型。從臨床癥狀、病毒復(fù)制、組織趨向性和宿主對SARS-CoV-2感染的反應(yīng)分析，恒河猴對SARS-CoV-2 的反應(yīng)最強(qiáng)。NHP 很好地再現(xiàn)了人類的反應(yīng)情況，在研究當(dāng)前COVID-19大流行中與人類病理相關(guān)方面，NHP是理想的動物模型。

2.3 計算和數(shù)學(xué)模型 除了體內(nèi)和體外模型，一些計算和數(shù)學(xué)模型也被用于研究SARS-CoV-2。這些計算模型已被廣泛應(yīng)用于篩選潛在的抗SARS-CoV-2 藥物［47-48］，定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）研究是一種從復(fù)雜數(shù)據(jù)集中提取關(guān)鍵信息的有效技術(shù)。QSAR 模型可分析化合物的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特征對所研究的生物活性的影響，并同時提供虛擬文庫的預(yù)測。一方面，通過結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)解釋（structure and physicochemical interpretation，SPCI）分析進(jìn)行片段／指紋分析，估計不同分子特征對主蛋白酶（the main protease，Mpro）的抑制作用；另一方面，構(gòu)建基于蒙特卡洛優(yōu)化的QSAR 模型，并進(jìn)一步利用最佳模型篩選近期的自然產(chǎn)品檢索庫；最后，從片段分析的角度分析產(chǎn)生的活性分子。該方法為SARS-CoV-2 Mpro 酶的片段探索和基于QSAR 的活性分子篩選奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步的體外和體內(nèi)研究SARS-CoV-2 提供了新的成分和靶點［49］。通過大量計算和數(shù)學(xué)模型可預(yù)測COVID-19 的傳播趨勢和感染人數(shù)，為疫情防控提供依據(jù)。

3 藥效學(xué)研究

藥效學(xué)研究主要包括疫苗的作用機(jī)制、免疫原性和保護(hù)力、免疫程序和接種途徑與效果的關(guān)系等。

3.1 疫苗的作用機(jī)制 不同的疫苗作用不同，其觸發(fā)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力也不同。如腺病毒載體疫苗和核酸疫苗對細(xì)胞免疫反應(yīng)的刺激更有效，而蛋白質(zhì)亞單位疫苗和滅活病毒疫苗則對體液免疫反應(yīng)的刺激更有效［50］。在已批準(zhǔn)的疫苗中，腺病毒載體疫苗和mRNA 疫苗需接種1 或2 針方案［51-53］，而滅活疫苗和蛋白亞單位疫苗則傾向于接種2 或3針方案［54-55］。其基本原則是確保中和抗體的效價足夠高，以減少感染和嚴(yán)重疾病的發(fā)生率，并抵抗變異株［56］。

DNA疫苗通過將編碼外源性抗原的基因插入含真核表達(dá)元件的載體上，將其導(dǎo)入人或動物體內(nèi)，使其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答以預(yù)防疾??；mRNA疫苗由編碼病毒抗原的mRNA組成，通過合適的載體送至人體，人類細(xì)胞通過翻譯這些RNA 產(chǎn)生抗原蛋白并刺激免疫系統(tǒng)；蛋白亞單位疫苗是提取或?qū)⒛康目乖蛲ㄟ^重組表達(dá)出抗原蛋白，純化后制成疫苗；重組病毒載體疫苗以病毒作為載體，采用基因工程技術(shù)將外源抗原基因插入病毒基因組內(nèi)，并轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得重組病毒，獲得的重組病毒在機(jī)體內(nèi)表達(dá)目的蛋白，誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，從而達(dá)到免疫接種的目的；滅活疫苗是選用免疫原性強(qiáng)的病原體，大規(guī)模培養(yǎng)后利用理化方法滅活制成疫苗。

3.2 疫苗的免疫原性 臨床前動物免疫原性試驗不僅可為疫苗進(jìn)入臨床試驗提供支持，也可為安全性評價的試驗方案設(shè)計（如實驗動物的選擇、免疫途徑、劑量、頻率等）和臨床試驗方案的制訂提供參考。

武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司、中國科學(xué)院武漢病毒研究所研制出新型SARS-CoV-2 全病毒滅活候選疫苗［57］。在臨床前研究中使用7 種不同的動物研究疫苗的低毒性、免疫原性和免疫持久性，結(jié)果表明，該候選疫苗具有良好的耐受性和高水平的特異性IgG 抗體和中和抗體。在候選疫苗的臨床前研究中，也證實了對3 種動物的低毒性或無毒性。在實驗動物中，劑量、增加次數(shù)、佐劑和免疫程序被證明對激發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)非常重要。

rVSV-ΔG-SARS-CoV-2-S 是一種臨床（2 期）復(fù)制能力強(qiáng)的SARS-CoV-2 重組疫苗［58］。為了評估疫苗的安全性，在小鼠、倉鼠、兔、豬4 種動物中進(jìn)行一系列非臨床安全性、免疫原性和有效性研究，采用多劑量（多達(dá)108 個斑塊形成單位／動物）的給藥方案。rVSV-ΔG-SARS-CoV-2-S 疫苗接種引起了中和抗體、細(xì)胞免疫反應(yīng)、脾臟生發(fā)中心和區(qū)域淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加。非臨床數(shù)據(jù)表明，rVSV-ΔG-SARSCoV-2-S疫苗是安全的，且具有免疫原性。

3.3 動物保護(hù)力 臨床前SARS-CoV-2 攻擊試驗可評價疫苗的保護(hù)效果，建立免疫劑量與生物效價的關(guān)系，可為臨床疫苗的使用劑量、頻率、不良反應(yīng)的預(yù)測等提供支持。

有研究將SARS-CoV-2 感染的金色（敘利亞）倉鼠模型作為一種有效的非致命小動物模型，用于研究疫苗對COVID-19 的保護(hù)效力。在被動轉(zhuǎn)移實驗中［59］，敘利亞倉鼠感染SARS-CoV-2可引起倉鼠肺部顯著病理改變。此外，在倉鼠中觀察到的免疫組化變化和體質(zhì)量減輕模式類似于人類中輕度SARSCoV-2 感染的過程［60］。盡管肺炎癥狀發(fā)展迅速且嚴(yán)重，研究表明，敘利亞倉鼠模型可用于研究中和抗體和疫苗對SARS-CoV-2的保護(hù)作用［61］。

采用敘利亞倉鼠模型評估幾種滅活疫苗的保護(hù)效果［62］，其中包括經(jīng)臨床認(rèn)證使用的滅活疫苗。主要評價指標(biāo)為感染后不同時期倉鼠的體質(zhì)量、鼻拭子、肺部和其他器官中病毒和／或病毒RNA 的存在情況。

KOZLOVSKAYA 等［63］將敘利亞倉鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為3 組：完整組（5 只）、接種組（15 只）和未接種組（15 只），接種組注射CoviVac 疫苗［5 μg／（劑·0.5 mL）］2 次，間隔14 d，并在第2 次免疫后14 d 鼻內(nèi)注射105TCID50的SARS-CoV-2株P(guān)IK35，每天對所有動物進(jìn)行觀察和稱重，并收集鼻、直腸拭子。實驗結(jié)果表明，CoviVac 疫苗對敘利亞倉鼠的SARS-CoV-2感染表現(xiàn)出保護(hù)作用。

3.4 接種途徑與效果 目前，大部分SARS-CoV-2 疫苗均采用肌肉注射，但由于SARS-CoV-2 主要通過上呼吸道感染，鼻腔通道的微環(huán)境對免疫十分重要。如使用N 蛋白通過小鼠鼻內(nèi)免疫導(dǎo)致肺支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage，BAL）比肌肉注射的T細(xì)胞反應(yīng)更高，而氣管和口腔的反應(yīng)相似。相比之下，鼻內(nèi)免疫誘導(dǎo)的脾臟、腹股溝淋巴結(jié)和腦部的T 細(xì)胞反應(yīng)低于肌肉注射［64］。表明免疫途徑不僅影響靶器官的免疫應(yīng)答，而且影響多個器官的免疫應(yīng)答。

一些使用鼻內(nèi)疫苗的實驗已取得了良好的效果?？晌胍呙缰苿┐笾驴煞譃閮深悾阂后w制劑和粉劑制劑。在小鼠模型中，鼻內(nèi)免疫ChAd-SARSCoV-2-S（基于猿猴Ad-36載體）比腸外途徑顯示出更好的免疫效力［65］。鼻內(nèi)和皮下注射Ad5.SARS-CoV-2-S1疫苗在小鼠模型中誘導(dǎo)了強(qiáng)大的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)［66］。在鼻腔中注射Ad5-S-nb2 也能誘導(dǎo)全身和局部抗體反應(yīng)，從而對獼猴產(chǎn)生保護(hù)［67］。上述研究表明，鼻內(nèi)注射疫苗可保護(hù)宿主免受SARS-CoV-2感染，局部接種足以誘導(dǎo)全身體液免疫應(yīng)答。

但其他鼻內(nèi)接種疫苗的實驗得到了不同的結(jié)果。鼻內(nèi)注射人中和抗體和DNA 疫苗并未減少鼻甲骨中的病毒載量，但對肺有保護(hù)作用［68］。與鼻內(nèi)注射相比，肌肉注射VSV-SARS2-EBOV 疫苗顯示出快速的保護(hù)作用［69］。但這與之前的研究相矛盾。雖然目前尚不清楚鼻內(nèi)接種疫苗是否優(yōu)于肌內(nèi)接種疫苗，但鼻內(nèi)接種疫苗可保護(hù)宿主免受感染。鼻內(nèi)接種疫苗的效力可能取決于劑量或疫苗種類。此外，鼻內(nèi)免疫可提供消除性免疫，防止人際傳播，可能是一種有效的群體免疫途徑。

4 SARS-CoV-2疫苗的不良反應(yīng)

安全性是使用疫苗時需考慮的一個重要因素。疫苗相關(guān)藥物不良反應(yīng)的范圍非常廣泛，其中最常見的不良反應(yīng)為疼痛、疲勞和頭痛，見表3。大多數(shù)不良反應(yīng)可忍受，嚴(yán)重程度主要為1或2級。目前已發(fā)現(xiàn)了一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)（血栓栓塞事件，每百萬劑量275例；心肌炎／心包炎，每百萬劑量2 ～3例）。疫苗對于控制COVID-19大流行是一種有效手段，具有高效力和可耐受的不良反應(yīng)。此外，與疫苗相關(guān)的不良反應(yīng)范圍很廣，大多數(shù)反應(yīng)出現(xiàn)在注射疫苗1周內(nèi)，有些反應(yīng)可能會延遲。因此，疫苗接種后需及時發(fā)現(xiàn)并處理不良反應(yīng)。

表3 現(xiàn)有SARS-CoV-2疫苗的種類與不良反應(yīng)Tab.3 Types of existing SARS-CoV-2 vaccines and adverse reactions

5 總結(jié)與展望

目前，已在動物模型中進(jìn)行了多種SARS-CoV-2疫苗的免疫原性、有效性和安全性評價，但由于這些疫苗藥效學(xué)實驗參數(shù)存在差異，無法對抗體反應(yīng)、保護(hù)效果等進(jìn)行統(tǒng)一比較。盡管如此，動物模型的實驗結(jié)果仍能有效評估SARS-CoV-2 疫苗在人體的安全性和保護(hù)效果，對SARS-CoV-2 疫苗的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。后續(xù)疫苗的保護(hù)作用能持續(xù)多久，疫苗對不同人群的保護(hù)效力如何，疫苗中哪些成分能引起過敏反應(yīng)，患者康復(fù)后有哪些后遺癥，如何避免后遺癥及不良反應(yīng)的發(fā)生等問題均需不斷開展非臨床安全性評價實驗，并結(jié)合臨床研究結(jié)果，優(yōu)化實驗方法和策略，為臨床安全用藥提供參考和依據(jù)，從而提高疫苗大規(guī)模接種的有效性和安全性。