蔣梅玉,趙新鴻,牛云峰,李方龍,邱建宏

(1.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院,河北石家莊 050082;2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 河北省腫瘤研究所病理研究室,河北石家莊 050011)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)占成人腎臟惡性腫瘤的80%～90%[1]。50%的腎癌為偶然發(fā)現(xiàn),20%～30%的患者首診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移[2],轉(zhuǎn)移性腎癌5年生存率僅12%,遠(yuǎn)低于局部腎癌[3]。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)約占腎癌發(fā)病率的70%～80%[4],是腎癌主要死亡原因[5]。因此尋找早期診斷和預(yù)后評估的分子指標(biāo)及發(fā)病機制是提高患者生存率的重要手段。POU2F2是POU轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors)家族(POU域) 成員,位于染色體19q13.2,在體內(nèi)多種細(xì)胞中普遍表達(dá),能與基因5′端啟動子特異性結(jié)合,調(diào)控目的基因表達(dá)[6],在神經(jīng)元[7-9]、免疫細(xì)胞[10]生長發(fā)育及多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。有文獻(xiàn)報道POU2F2是調(diào)控胃癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤、肺癌、膠質(zhì)瘤及宮頸癌等多種腫瘤發(fā)展過程中的關(guān)鍵靶標(biāo)[11-18],影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,但其在ccRCC方面的研究尚未見報道。本實驗通過了解POU2F2與ccRCC的關(guān)系,期待挖掘其在ccRCC治療中潛在的臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗標(biāo)本來源ccRCC及癌旁正常組織取自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生物標(biāo)本庫。簡單隨機抽樣法選取2017-2020年收治的61例初診ccRCC患者的手術(shù)標(biāo)本,同時患者既往未曾接受其他器官惡性疾病手術(shù)及放化療,病例信息完整且無其他系統(tǒng)惡性腫瘤疾病。最終納入男性41例,女性20例;中位年齡55(27～81)歲。腫瘤直徑≤4 cm 27例,>4 cm 34例。取ccRCC原發(fā)灶組織及相應(yīng)癌旁正常組織(距原發(fā)灶邊緣5 mm以上)。手術(shù)切除標(biāo)本一部分石蠟包埋制片行HE染色;另一部分新鮮標(biāo)本提取組織總RNA。所有組織標(biāo)本由3位病理科主任醫(yī)師確診為ccRCC,癌旁正常組織無癌細(xì)胞浸潤。本實驗經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過(倫理編號:2020k-1147),研究對象均簽署知情同意書。

1.2 實驗材料反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自瑞士Roche;MTS、實時熒光定量試劑盒購自Promega公司;LipofectamineTM2000購自美國Thermo公司;胎牛血清購自美國BI公司;DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、DAB顯色試劑盒、胰酶購自北京索萊寶;小鼠SP試劑盒購自北京中山金橋;重組質(zhì)粒sh-POU2F2-763、sh-POU2F2-1013來自上海吉瑪大鼠POU2F2單抗購自Abcam公司;羊抗鼠IGg二抗購自北京聚合美生物;EMT相關(guān)單抗購自北京天德悅生物科技。人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、786-O,正常人腎上皮293-T細(xì)胞三株,由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所病理室饋贈。

1.3 實驗方法

1.3.1實時熒光定量法(real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測 采用qRT-PCR檢測POU2F2 mRNA在ccRCC組織和癌旁正常組織及其在細(xì)胞系(786-O和ACHN)和293-T中的表達(dá)。以GAPDH作內(nèi)參,引物序列見表1。

1.3.2免疫組織化學(xué)法 免疫組織化學(xué)SP法檢測ccRCC組織及癌旁正常組織中POU2F2蛋白的表達(dá)。人體組織標(biāo)本經(jīng)過40 g/L甲醛固定、石蠟切片、脫蠟至水,pH=9的EDTA抗原修復(fù)液高壓修復(fù)20 min,POU2F2一抗(大鼠POU2F2單抗1∶1 000)4 ℃過夜,羊抗鼠IGg二抗(1∶1 000),SP試劑盒和DAB顯色。PBS代替一抗做空白對照。

1.3.3腎癌細(xì)胞的培養(yǎng) 體積分?jǐn)?shù)10%FBS+90%DMEM+1%雙抗培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)腎癌細(xì)胞。

1.3.4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)染效率的測算 重組質(zhì)粒sh-POU2F2-763、sh-POU2F2-1013分別轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞?？蛰d質(zhì)粒(sh-NC)作空質(zhì)粒對照組。qRT-PCR測轉(zhuǎn)染效率及EMT相關(guān)腫瘤標(biāo)記物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9、Snail、Twist、Zeb1mRNA的變化。

1.3.5克隆形成實驗、MTS法檢測細(xì)胞增殖 克隆實驗:sh-NC組、sh-POU2F2-1013組轉(zhuǎn)染后的786-O細(xì)胞消化重懸,6孔板(3×103個/孔)常規(guī)培養(yǎng)1周,40 g/L多聚甲醛固定20 min,體積分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫染色20 min,顯微鏡觀察細(xì)胞團(tuán)>50個細(xì)胞為1個克隆,計數(shù)克隆數(shù)目,計算克隆形成率。

MTS實驗:將sh-NC組、sh-POU2F2-1013組轉(zhuǎn)染后24 h的786-O細(xì)胞消化重懸,均勻的接種于96孔板(1×103個/孔),每組6個復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后0、24、48、72、96 h每孔加20 μL MTS(終濃度500 μg/mL)并孵育2 h,分別測其在592 nm 的吸光度A值,代表細(xì)胞增殖能力。

1.3.6劃痕實驗對細(xì)胞遷移能力的影響 sh-NC質(zhì)粒、sh-POU2F2-1013質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h的786-O細(xì)胞,接種在6孔板(5×105個/孔)中長至完全融合時用200 μL槍頭垂直劃痕。光學(xué)顯微鏡觀察0、12、24 h劃痕寬度;計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(劃痕寬度0h-劃痕寬度12h/24h)/劃痕寬度0h×100%。

1.3.7Transwell小室對細(xì)胞侵襲能力的影響 sh-NC組、sh-POU2F2-1013組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞24 h后,小室的上室中均勻鋪稀釋Matrigel膠50 μL,過夜。上室加1×105個細(xì)胞+200 μL DMEM,下室加600 μL含血清的完全培養(yǎng)基。24 h后取出,固定、染色,擦去上室中的膠和細(xì)胞,顯微鏡下觀察。

1.3.8Western blot檢測相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞POU2F2蛋白和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)腫瘤標(biāo)記物的蛋白表達(dá)的變化 提取轉(zhuǎn)染72 h后的786-O細(xì)胞蛋白。測定蛋白濃度,加樣(30 μg/孔)進(jìn)行10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜,封閉抗原,孵一抗(大鼠POU2F2單抗;兔單抗E-cadherin、MMP2、MMP9、Twist及β-actin濃度1∶1 000),4 ℃冰箱過夜。相應(yīng)二抗(羊抗鼠IgG抗體1∶1 000,羊抗兔IgG抗體1∶1 000,)孵1 h,曝光成像。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析、GraphPad Prism 8作圖。所有實驗均獨立重復(fù)3次取平均值,非參數(shù)檢驗進(jìn)行組間統(tǒng)計分析,統(tǒng)計量以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,計數(shù)資料兩樣本率的比較采用四格表χ2檢驗;雙尾檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 POU2F2 mRNA在ccRCC組織中的表達(dá)及與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性POU2F2 mRNA在ccRCC組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)正常腎組織(圖1)[1.585(1.122,2.243)vs.0.567(0.361,1.049),Z=-4.823,P<0.001],差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。POU2F2在ccRCC中的表達(dá)與臨床病例參數(shù)間的關(guān)系見表2。

圖1 ccRCC及癌旁正常組織中POU2F2mRNA的表達(dá)(***P<0.001)

表2 ccRCC組織中 POU2F2表達(dá)與臨床病例參數(shù)的關(guān)系

2.2 ccRCC組織中POU2F2蛋白的表達(dá)POU2F2蛋白在ccRCC及癌旁正常組織中陽性表達(dá)率分別為47.5%(29/61)和26.2%(16/61),統(tǒng)計量(χ2=5.950,P=0.015),P<0.05(圖2)。ccRCC組織POU2F2蛋白表達(dá)與臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系見表2。

A:ccRCC組織中高表達(dá);B:在正常組織中低表達(dá);C:POU2F2蛋白在不同組織中的表達(dá)情況比較。

2.3 POU2F2 mRNA在ccRCC細(xì)胞系中的表達(dá)POU2F2在293-T、786-O、ACHN細(xì)胞系中的表達(dá)分別為0.940±0.136、3.032±0.072、1.261±0.124。786-O、ACHN均高于293-T細(xì)胞[(t=17.878、P=0.003), (t=18.623、P=0.003)],差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。786-O細(xì)胞POU2F2表達(dá)量最高,選取其構(gòu)建POU2F2敲低細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞功能試驗(圖3A)。

A:癌細(xì)胞系中POU2F2 mRNA的表達(dá)(**P<0.01);B:786-O細(xì)胞中敲低POU2F2基因的驗證(*P<0.05)。

2.4 敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后測轉(zhuǎn)染效率sh-NC組和sh-POU2F2-763、sh-POU2F2-1013組的POU2F2 mRNA表達(dá)量分別為1.011±0.180、0.957±0.032、0.302±0.003,sh-NC組與sh-POU2F2-763組相比差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.545,P=0.640),sh-POU2F2-1013組的表達(dá)明顯降低(t=6.150,P=0.025),選取sh-POU2F2-1013質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞功能試驗(圖3B)。

2.5 POU2F2敲低對腎癌細(xì)胞增殖能力的影響克隆結(jié)果:與sh-NC組相比,sh-POU2F2-1013轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后,細(xì)胞的增殖能力明顯降低[(335.000±7.000)vs.(133.667±7.572),t=30.314,P=0.001,圖4A]。MTS結(jié)果:與sh-NC組相比,sh-POU2F2-1013組在72和96 h增殖能力明顯降低[(t72h=9.514,P=0.011)、(t96h=20.692,P=0.002)],差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4B)。

A:克隆形成實驗檢測POU2F2對786-O細(xì)胞增殖能力的影響,**P<0.01;B:MTS法檢測POU2F2對786-O細(xì)胞增殖能力的影響,*P<0.05。

2.6 POU2F2敲低對腎癌細(xì)胞遷移能力的影響劃痕實驗結(jié)果,與sh-NC組相比sh-POU2F2-1013轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后,12 h遷移能力降低[0.283±0.016)vs.(0.219±0.003),t=5.792,P=0.029],24 h遷移能力亦明顯降低[(0.514±0.007)、(0.438±0.021),t=4.653,P=0.043,圖5]。

圖5 敲低POU2F2基因后劃痕實驗結(jié)果(*P<0.05)

2.7 POU2F2敲低對腎癌細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell小室侵襲結(jié)果,與sh-NC組相比sh-POU2F2-1013轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后,細(xì)胞的侵襲能力明顯降低[(154.33±7.506)vs.(103.33±4.16),t=8.167,P=0.015,圖6]。

圖6 敲低POU2F2基因后Transwell小室侵襲實驗結(jié)果(*P<0.05)

2.8 敲低POU2F2后對腎癌細(xì)胞EMT相關(guān)分子標(biāo)記物表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果在sh-POU2F2-1013轉(zhuǎn)染組中,E-ca mRNA表達(dá)量(1.563±0.009)較sh-NC組(1.005±0.015)明顯升高,P<0.05,MMP2、MMP9、Twist mRNA表達(dá)量較sh-NC組均降低[(0.438±0.015)、(1.000±0.002),(0.305±0.015)、(1.000±0.004),(0.211±0.002)、(1.000±0.016),P<0.05,圖7A]。

A:q-PCR法檢測sh-POU2F2-1013對EMT相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響,*P<0.05,**P<0.01;B:Western blot法檢測sh-POU2F2-1013對EMT相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響。

Western blot結(jié)果與sh-NC組相比,sh-POU2F2-1013轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后,POU2F2蛋白表達(dá)量明顯降低, EMT相關(guān)腫瘤標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高、MMP2、Twist蛋白表達(dá)明顯降低,與mRNA的表達(dá)趨勢一致(圖7B)。

3 討 論

POU2F2最早是由SINGH等[19]在免疫B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的,廣泛表達(dá)于淋巴結(jié)、脾臟等組織。一方面POU2F2受白介素1、白介素6、神經(jīng)生長因子、炎癥以及流感病毒等的調(diào)控,另一方面其能特異性識別靶基因的5′-ATTTGCAT-3′區(qū)域,調(diào)控靶基因的表達(dá)。它不僅參與人體正常的調(diào)控和免疫應(yīng)答,也與多種腫瘤的發(fā)展有關(guān)。

本實驗初步研究了POU2F2在ccRCC中的表達(dá),首先檢測POU2F2在ccRCC及癌旁正常組織的表達(dá),結(jié)果顯示POU2F2 mRNA在癌組織的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織,與患者性別、WHO/ISUP核分級、TNM分期正相關(guān)。POU2F2蛋白在ccRCC中的表達(dá)量亦明顯高于癌旁正常組織,與腫瘤病理分級及臨床分期相關(guān)。ccRCC組織mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量與臨床病例資料的關(guān)系并不完全一致,這可能是抽樣誤差導(dǎo)致樣本與總體間存在差異或與基因轉(zhuǎn)錄及翻譯后修飾等有復(fù)雜的關(guān)系。組織表達(dá)實驗結(jié)果提示POU2F2在ccRCC中可能發(fā)揮癌基因的作用,為進(jìn)一步探究POU2F2對腎癌細(xì)胞系786-O體外增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響,我們選取786-O、ACHN兩株人腎癌細(xì)胞系分別檢測POU2F2 mRNA的表達(dá)情況,786-O細(xì)胞POU2F2 mRNA的表達(dá)量最高,故選786-O進(jìn)行敲低及功能試驗。細(xì)胞功能試驗表明:sh-POU2F2-1013質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后,細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力明顯降低。

EMT指上皮細(xì)胞在某些因素的作用下,極性消失、黏附力下降,失去頂-基底極性,具備間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及特性,更易突破基底膜,獲得侵襲性和遷移能力[20]。此現(xiàn)象最早是在胚胎發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn),指特定部位的上皮細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變。隨著研究不斷進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)在不良因素刺激下分化成熟的上皮細(xì)胞也可通過EMT產(chǎn)生間質(zhì)纖維母細(xì)胞,參與組織纖維化的形成,上皮性腫瘤細(xì)胞也可通過EMT,實現(xiàn)其體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移。該過程中上皮標(biāo)記物E-cadherin[21]表達(dá)降低,而Twist[21];MMP2、MMP9[22];vimentin、ZEB1[23];β-catenin、N-cadherin[24]等間皮標(biāo)記物表達(dá)增加。EMT在眾多腫瘤轉(zhuǎn)移[25]中得到廣泛的研究,例如在前列腺癌[24]、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌[26-31]。為了探究POU2F2是否影響ccRCC的EMT進(jìn)程,進(jìn)而影響腫瘤的生物學(xué)行為,本組實驗檢測敲低shPOU2F2-1013后分別從mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測EMT相關(guān)分子的變化,結(jié)果顯示上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)明顯升高,而間質(zhì)標(biāo)志物MMP2、MMP9及Twist表達(dá)明顯降低,提示POU2F2可以通過 EMT進(jìn)而調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞的惡行生物學(xué)行為。

綜上所述,本實驗結(jié)果表明,POU2F2在ccRCC中高表達(dá),并與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),敲低POU2F2可以抑制ccRCC細(xì)胞的體外增殖、侵襲和遷移能力,從而抑制 ccRCC的惡行生物學(xué)行為,為ccRCC的分子靶向治療提供一些新思路。