羅 玲,吳小華,廖紫君,張萌越,陳玉成,王 洋,楊志敏①

(1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院/ 重慶市生態(tài)環(huán)境局農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控重點實驗室,重慶 400716;2.重慶市能源生物資源開發(fā)重點實驗室,重慶 400716;3.重慶市江津區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,重慶 402260)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人們飲食結(jié)構(gòu)的變化,蔬菜已經(jīng)成為我國種植業(yè)中僅次于糧食的第二大農(nóng)作物[1],萵筍作為人們喜食的蔬菜在我國廣為種植。相關(guān)研究表明,我國農(nóng)業(yè)土壤中有一定的重金屬污染超標(biāo)率,且以中輕度污染為主[2]。MI等[3]對不同程度Cd污染土壤中10種萵筍的安全性評價發(fā)現(xiàn),輕度污染土壤(Cd含量為0.39 mg·kg-1)中種植的6種萵筍Cd累積量超過國家限量標(biāo)準(zhǔn),其余4種接近臨界值,表明萵筍較易受到來自土壤的重金屬污染。重金屬Cd脅迫對蔬菜生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用,會導(dǎo)致其出現(xiàn)植株矮小、生長遲緩、退綠、產(chǎn)量下降、品質(zhì)下降等現(xiàn)象[4]。

葉面噴施阻控劑是一種操作簡便、可實現(xiàn)邊修復(fù)邊生產(chǎn)的重金屬污染農(nóng)地安全利用技術(shù)。含Zn、Si的葉面阻控劑目前廣泛應(yīng)用于水稻、小麥等作物,可顯著降低重金屬在籽粒中的累積[1,5]。其主要機理為Zn作為與Cd化學(xué)物理性質(zhì)相近的生命必需元素,在質(zhì)膜中與Cd同用一個運輸系統(tǒng),其離子與Cd2+之間具有重要的拮抗效應(yīng),可有效競爭植物細(xì)胞內(nèi)的吸附位點和轉(zhuǎn)運蛋白[6],從而影響Cd在土壤-植物系統(tǒng)中的吸收轉(zhuǎn)運過程;Si與Cd可在帶有大量負(fù)電荷基團(tuán)的植株細(xì)胞壁發(fā)生絡(luò)合沉淀[7],增強細(xì)胞壁對Cd的吸附,將Cd區(qū)隔于細(xì)胞壁中[8],降低Cd在質(zhì)外體的運輸[9],以此阻控作物對Cd的轉(zhuǎn)運,降低可食用部位Cd含量[10]。關(guān)于蔬菜種植葉面噴施阻控劑的研究主要集中在改善生長品質(zhì)、營養(yǎng)狀況、光合特性等方面,含Zn、Si的葉面阻控劑能否有效阻控蔬菜對污染土壤中重金屬的累積,及其在器官及細(xì)胞水平的分布及變化規(guī)律鮮見報道。

該研究通過盆栽試驗,研究Zn、Si葉面阻控劑的施用對輕污染土壤蔬菜Cd累積的阻控效應(yīng),并從亞細(xì)胞分布、形態(tài)轉(zhuǎn)化等方面探索其阻控機制,研究結(jié)果可豐富農(nóng)用地重金屬污染防治理論,為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤采自西南大學(xué)紫色土監(jiān)測基地。將CdCl2溶解后投加于土壤中,土壤水分條件為田間最大持水量的80%,充分混勻,室溫條件下陳化4個月以制備輕度污染土壤。供試土壤pH值為7.9,有機質(zhì)含量為16.51 g·kg-1,堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為56.29、32.49、284.65 mg·kg-1,全Cd、有效Cd含量分別為0.8、0.4 mg·kg-1,全Zn、有效Zn含量分別為93.66、0.69 mg·kg-1。

萵筍(Lactucasativa)幼苗為當(dāng)?shù)仄贩N“科興尖葉九號”。葉面噴施肥為EDTA-Zn和ZnSO4,優(yōu)級純,購自阿拉丁試劑(上海)有限公司;Si噴施肥(主要成分為二氧化硅溶膠,Si質(zhì)量濃度為85 g·L-1)購自佛山市鐵人環(huán)保科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用盆栽進(jìn)行。每個盆缽裝土3.5 kg,種植4株三葉一心、大小均勻的萵筍幼苗。移栽前施入復(fù)合肥,采用稱重法保持土壤水分。試驗選取3種葉面噴施試劑,各2個濃度梯度,共6個處理組,設(shè)置1個空白對照噴施組CK(表1)。

種植30 d時噴施第1次,45 d時噴施第2次。每株每次噴施10 mL,葉片上、下表面均勻布霧,液體未流下。第1次噴施后每5 d進(jìn)行整株采樣,采集的萵筍用去離子水洗去表面土壤及灰塵,放入烘箱110 ℃殺青30 min之后,于75 ℃烘干至恒重,粉碎過0.25 mm孔徑篩,保存待測。

1.3 測定項目與方法

1.3.1萵筍總Cd和不同形態(tài)Cd含量

萵筍總Cd含量用火焰原子吸收分光光度法測定;萵筍中不同化學(xué)形態(tài)Cd組分的提取采用不同極性化學(xué)試劑的逐步提取法[11-12],逐步提取步驟如表2所示。

1.3.2萵筍中Cd的亞細(xì)胞組分分布

萵筍亞細(xì)胞組分提取采用差速離心法[12-13]：稱取預(yù)先冰凍好的樣品,加入預(yù)冷提取液〔0.25 mol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH值7.5)和1 mmol·L-1巰基乙醇〕,將樣品研磨成勻漿,在4 ℃下采用不同轉(zhuǎn)速依次離心,按2 400 r·min-1離心15 min(離心半徑13 cm),得到沉淀部分為細(xì)胞壁組分(F1);將上清液以10 000 r·min-1離心30 min(離心半徑47.7 mm),此時上清液為含核糖體和液泡的細(xì)胞液、胞質(zhì)溶膠及內(nèi)含物的細(xì)胞可溶部分(F2),沉淀部分即細(xì)胞器組分(F3)。將各組分加酸消煮后測定Cd含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根到葉的轉(zhuǎn)移系數(shù)(TF)為葉部Cd含量與根部Cd含量的比值。采用Microsoft Excel 2010和Origin Pro 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Duncan檢驗(P<0.05)和Pearson相關(guān)性分析。

表2 萵筍Cd形態(tài)逐步提取法

2 結(jié)果與討論

2.1 葉面噴施對萵筍Cd累積的影響

2.1.1收獲期萵筍可食部位Cd含量

GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》規(guī)定,葉菜蔬菜Cd限量值為0.2 mg·kg-1。收獲期可食部位Cd含量見圖1。

各處理設(shè)計見表1。

如圖1所示,CK葉部Cd含量超標(biāo);葉面噴施后,除mSi處理葉部Cd含量超標(biāo)以外,其余處理可食部位Cd含量顯著降低(降幅達(dá)10.51%～45.09%,P<0.05),均低于GB 2762—2017限量值;高濃度的Zn、Si葉面阻控劑降Cd效果均顯著優(yōu)于低濃度的葉面阻控劑。在萵筍莖部,Zn能顯著降低莖部Cd含量 22.94%～45.09%(P<0.05);60 和30 mmol·L-1的Si阻控劑能使莖部Cd含量分別降低31.11%和22.91%(P<0.05),Zn阻控劑對Cd積累的抑制效果明顯優(yōu)于Si阻控劑,2種Zn阻控劑之間差異不顯著。在萵筍葉部,Zn能使Cd含量顯著降低10.51%～25.48%(P<0.05),高濃度Si阻控劑使葉部Cd含量顯著降低30.66%(P<0.05),低濃度Si阻控劑對葉部Cd含量無顯著影響。不同處理比較而言,萵筍莖葉部Cd積累量為MSi

2.1.2Cd轉(zhuǎn)運系數(shù)的動態(tài)變化

CK處理下TF根-莖、TF根-葉隨萵筍生育期延長逐漸增大(圖2),即根部吸收的Cd持續(xù)向地上部轉(zhuǎn)移,而且轉(zhuǎn)移能力持續(xù)增大。葉面噴施的降Cd幅度表現(xiàn)為莖部大于葉部,所以葉面噴施后TF莖-葉較CK處理有所提升,但TF根-莖、TF根-葉顯著降低,且噴施同一種阻控劑時,高濃度處理的各器官轉(zhuǎn)移系數(shù)均小于低濃度。施Zn使TF根-莖、TF根-葉分別降低58.47%～73.39%、47.71%～62.22%,施Si使TF根-莖和TF根-葉分別降低47.55%～55.36%、54.53%～59.63%,EDTA-Zn的降低效果優(yōu)于ZnSO4和SiO2。Zn、Si葉面阻控劑有效降低了Cd向萵筍可食部位的轉(zhuǎn)運,高濃度的葉面阻控劑能將更多Cd阻留在植物根部。

葉面噴施處理后,萵筍根、莖、葉的轉(zhuǎn)運系數(shù)呈下降趨勢,均在10～15 d內(nèi)下降幅度達(dá)最大,即葉面噴施的作用效果在此階段最為明顯(圖2),因此該研究主要分析了噴施后15 d時萵筍體內(nèi)Cd的亞細(xì)胞分布和形態(tài)轉(zhuǎn)化情況,探究葉面噴施Zn、Si后的作用機制。

植物地上部Cd累積主要受根部吸收和根向地上部轉(zhuǎn)運2個過程的控制[16]。根部Cd凈吸收量為植株整體Cd累積量與根系干重的比值,能準(zhǔn)確反映植物根系對Cd的吸收能力[17]。轉(zhuǎn)運系數(shù)越大,表明蔬菜該器官對重金屬的轉(zhuǎn)運能力越強。由表3可知,莖葉部Cd含量分別與TF根-莖、TF根-葉、根部Cd凈吸收量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。因此,該研究中Zn、Si處理降低萵筍地上部Cd含量,均是由降低根部對Cd的吸收和抑制Cd從根部向地上部轉(zhuǎn)運2個過程引起的。葉部Zn與Cd、莖部Zn與Cd含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),這可能是因為植物可以利用相同的轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)行Cd、Zn的吸收和運輸,如Zn轉(zhuǎn)運蛋白OsZNT1及重金屬ATP酶OsHMA2等[18],外源Zn可以促進(jìn)植物對Zn的吸收,一方面Zn會與Cd競爭這些轉(zhuǎn)運蛋白上的重金屬結(jié)合位點,抑制Cd的跨膜運輸[19];另一方面也會調(diào)控這些轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達(dá)和蛋白合成[20],最終抑制植物根系對Cd的吸收和Cd在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運。與施Zn相似,莖部Cd與TF根-莖、TF根-葉和根部Cd凈吸收量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01);葉部Cd含量分別與TF根-葉、TF莖-葉、根部Cd凈吸收量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。由此可知,噴施Si降低萵筍地上部Cd含量是由抑制根部對Cd的吸收及從根部向地上部的轉(zhuǎn)運所致。莖葉部Cd含量與根部Zn含量均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),而根部Cd凈吸收量與根部Zn含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),說明Zn通過葉面噴施富集在莖葉部,對Cd有明顯的拮抗作用,若是聚集在根部反而會增加萵筍可食部位Cd的累積。OLIVER等[21]的研究也證明,葉面噴施ZnSO4可降低水稻對Cd的吸收,其效果優(yōu)于土壤施用處理,即葉面噴施Zn、Si阻控劑具有推廣運用于蔬菜的可行性。

各處理設(shè)計見表1。

表3 葉面噴施萵筍各器官Cd含量、轉(zhuǎn)運系數(shù)及Zn含量的相關(guān)性分析

2.2 葉面噴施對Cd在亞細(xì)胞分布的影響

從噴施后15 d時萵筍各亞細(xì)胞組分Cd占比(圖3)來看,CK處理下根、葉部Cd亞細(xì)胞組分占比表現(xiàn)為細(xì)胞壁(60%)>細(xì)胞可溶組分(20%～30%)>細(xì)胞器(15%～20%),Cd主要儲存于細(xì)胞壁中;莖部Cd亞細(xì)胞組分占比為細(xì)胞壁(40.68%)>細(xì)胞可溶組分(31.64%)>細(xì)胞器(27.68%),Cd主要儲存于細(xì)胞壁和細(xì)胞可溶組分中。在萵筍根部,噴施葉面阻控劑明顯降低了細(xì)胞器組分Cd占比,以高濃度的EDTA-Zn效果最為突出,細(xì)胞可溶組分Cd占比較CK增加200.09%,而細(xì)胞器組分Cd占比顯著降低32.14%,說明Zn主要通過將Cd隔離在細(xì)胞可溶部分進(jìn)而加強對Cd的束縛,減緩萵筍根部Cd向地上部的遷移;與CK相比,高濃度和低濃度的Si阻控劑使細(xì)胞壁Cd含量分別增加31.81%和32.30%,細(xì)胞器Cd含量分別降低25.11%和14.29%,表明施Si主要增強了萵筍根部的細(xì)胞壁沉積作用,而減緩了Cd向可食部位的轉(zhuǎn)移和毒害。

各處理設(shè)計見表1。

在萵筍莖葉部,幾種提取態(tài)的Cd含量占比變化趨勢與根部基本一致。與CK相比,葉面噴施Zn阻控劑使莖、葉細(xì)胞可溶組分Cd含量占比分別增加24.51%～67.40%、219.49%～268.40%,施Si使莖、葉細(xì)胞壁Cd含量占比分別增加21.68%～25%、8.32%～15.15%,Zn、Si這2種噴施處理使莖部細(xì)胞器組分Cd的分配比例分別降低36.84%～57.89%、47.37%～52.63%,葉部細(xì)胞器組分Cd的分配比例分別降低43.73%～59.29%、51.47%～63.93%,高濃度的阻控劑抑制Cd向細(xì)胞器分布的效果均優(yōu)于低濃度處理。和根部相比,莖葉部細(xì)胞器的Cd含量占比更低,細(xì)胞器是植物代謝活動的主要場所,降低自由態(tài)重金屬在其中的含量可有效降低Cd對植株的脅迫和毒害。由于Zn與Cd的拮抗作用,Zn在細(xì)胞壁與Cd競爭吸附點位,當(dāng)細(xì)胞壁結(jié)合位點飽和時,Cd大量轉(zhuǎn)移到可溶性組分的液泡中[22-23],重金屬與其中的各種蛋白質(zhì)、有機酸和有機堿結(jié)合,而被區(qū)隔在液泡中[24-25],從而降低了Cd的活性和遷移性。施Si通過加強萵筍細(xì)胞壁組分對Cd的沉積作用而增大細(xì)胞壁Cd占比。前人認(rèn)為,當(dāng)Si作用于水稻時,Si吸附Cd2+形成復(fù)合體,共同沉積在植物細(xì)胞壁上,減少Cd向細(xì)胞的凈流入,從而抑制重金屬Cd在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運[26-27]。

2.3 葉面噴施對萵筍Cd形態(tài)的影響

噴施后15 d時萵筍各器官提取態(tài)Cd含量如圖4所示。CK處理中,萵筍根、莖、葉部不同形態(tài)Cd均以Cd與蛋白質(zhì)結(jié)合的NaCl提取態(tài)含量最高,分別占59.78%、64.68%、60.10%,這是因為Cd與植物體內(nèi)蛋白質(zhì)及其他有機化合物中的巰基有較強的親和力。與CK相比,噴施處理萵筍各器官NaCl提取態(tài)Cd含量顯著增加,乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)組成的活性態(tài)Cd含量顯著降低。與CK相比,葉面噴施Zn、Si后,各器官NaCl提取態(tài)Cd含量占比提高至74.28%～83.34%,根部活性態(tài)Cd含量占比分別降低65.47%～75.83%、41.55%～59.10%,莖部活性態(tài)Cd含量占比分別降低40.61%～60.38%、33.27%～55.49%,葉部活性態(tài)Cd含量占比分別降低32.63%～75.42%、44.53%～80.03%?；钚詰B(tài)Cd含量占比隨施Zn濃度的增加而降低,不同濃度的Si阻控劑對活性態(tài)Cd含量影響無顯著差異;高濃度的Zn阻控劑處理下活性態(tài)Cd含量占比小于高濃度Si阻控劑處理,同一濃度的Zn阻控劑對活性態(tài)Cd含量影響無顯著差異。筆者研究中葉面噴施Zn增加了細(xì)胞可溶組分Cd占比,使得Cd與蛋白質(zhì)等有機物結(jié)合的形態(tài)——NaCl提取態(tài)增幅較大,促進(jìn)了萵筍體內(nèi)Cd由活性態(tài)向非活性態(tài)轉(zhuǎn)化,從而降低了根部Cd向地上部遷移的能力,減少了可食部位自由態(tài)Cd含量,這與前人研究結(jié)論[28-29]相似。

植株對重金屬的累積、耐性機制與重金屬在植株體內(nèi)的存在形態(tài)密切相關(guān)。研究顯示,乙醇和去離子水提取態(tài)Cd占比越高,植株地上部Cd累積量越大[7]。該試驗中,從不同形態(tài)Cd占比來看,施Zn、Si主要使萵筍根、葉NaCl提取態(tài)Cd含量增大(果膠和蛋白質(zhì)螯合Cd),其他形態(tài)Cd含量降低(水溶性Cd、無機態(tài)Cd等)。這表明Zn、Si可通過降低萵筍各器官中乙醇和去離子水提取態(tài)Cd占比、提高NaCl提取態(tài)Cd占比,促進(jìn)Cd由活性向惰性轉(zhuǎn)化,降低Cd的毒性和遷移能力。

各處理設(shè)計見表1。

3 結(jié)論

(1)葉面單獨噴施Zn、Si均顯著降低了收獲期萵筍可食部位Cd含量(10.51%～45.09%),噴施不同濃度的Zn阻控劑和60 mmol·L-1的Si阻控劑均可降低萵筍Cd含量至食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)限值以下;5 mmol·L-1的Zn阻控劑對Cd的降低效果優(yōu)于0.4 mmol·L-1Zn阻控劑,60 mmol·L-1的Si阻控劑降Cd效果優(yōu)于30 mmol·L-1Si阻控劑。

(2)Zn、Si阻控劑分別通過增強區(qū)隔Cd于萵筍根、莖、葉的細(xì)胞可溶組分和細(xì)胞壁的作用,使莖、葉細(xì)胞器的Cd含量占比較CK減少30%以上,從而降低重金屬Cd在萵筍根部的活性,阻控Cd在萵筍可食部位的積累。

(3)葉面噴施提高了萵筍各器官NaCl提取態(tài)Cd含量,使根、莖、葉乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)Cd含量較CK顯著降低60.38%～80.03%,促進(jìn)Cd由活性態(tài)向非活性態(tài)轉(zhuǎn)化。