李昱劍，闞璇

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科，天津 300070）

支氣管哮喘簡稱哮喘，是臨床最常見的慢性氣道炎癥性疾病之一。哮喘復(fù)雜的發(fā)病機制和多樣化的臨床表現(xiàn)既增加了臨床醫(yī)生的診治難度，也使患者在日常生活中飽受痛苦[1]。目前全球至少有3 億哮喘患者，且哮喘的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)仍呈上升趨勢[2]。雖然隨著醫(yī)學(xué)進步，既往統(tǒng)計的哮喘死亡率已經(jīng)有所下降，但從2006 年開始其下降趨勢就出現(xiàn)了急剎車，表明現(xiàn)有治療手段已經(jīng)遇到了瓶頸[3]。

越來越多疾病的診治從蛋白質(zhì)水平進入到了轉(zhuǎn)錄和調(diào)控水平，其中非編碼RNA 發(fā)揮著不可替代的作用[4]。研究表明，與健康人相比，哮喘患者外周血樣本中l(wèi)ncRNA 的數(shù)量和表達存在差異[5]。與傳統(tǒng)的線性RNA 不同，circRNA 呈現(xiàn)封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使其表達更加穩(wěn)定。circRNA 可以通過與哮喘等疾病相關(guān)的miRNA 相互作用，從而對哮喘等疾病的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用[6]。轉(zhuǎn)錄因子是一組蛋白質(zhì)分子，能使目標基因在特定的時間和空間上以特定的強度進行表達。一些研究也指出，轉(zhuǎn)錄因子可以參與哮喘的氣道炎癥、氣道重塑和免疫調(diào)節(jié)[7]。

近年來，有關(guān)miRNA 與哮喘關(guān)系的研究層出不窮，對哮喘的診治起到了積極的推動作用，但關(guān)于lncRNA、circRNA、轉(zhuǎn)錄因子等非編碼RNA 與哮喘關(guān)系的研究仍有較多空白。本研究將使用上述方法篩選哮喘的DEGs，并構(gòu)建miRNA、lncRNA、circRNA、轉(zhuǎn)錄因子和靶向藥物與哮喘靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對哮喘相關(guān)的遺傳物質(zhì)、功能、通路和靶向藥物的探索，可以為哮喘生物標志物挖掘和精準醫(yī)療提供參考。

1 材料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù) 本研究使用檢索式：（′asthma′[MeSH Terms] OR ′asthma′[All Fields]）AND（′Homo sapiens′[Organism]AND′Expression profiling by array′[Filter]）從GEO[8]（https：//www．ncbi．nlm．nih．gov/geo/）數(shù)據(jù)庫中篩選出了GSE43696 和GSE64913 這兩個數(shù)據(jù)集，并從中提取了相應(yīng)的臨床信息。GSE43696來源于GPL6480 平臺（Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F），包含88 例哮喘患者的支氣管上皮細胞樣本和20 名健康人體樣本[9]。GSE64913 來源于GPL570 平臺（[HG-U133_P lus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array），包含15 例哮喘患者的支氣管上皮細胞樣本和19 名健康人體樣本[10]。

1.2 識別差異表達基因 通過核對兩個數(shù)據(jù)集的信息來平均或刪除沒有相應(yīng)基因符號的探針組和有多個探針組的基因。使用R 軟件的Limma 包（版本：3．40．2）去除批次效應(yīng)并識別DEGs。以“P＜0．05 and/Fold Change/＞1．5”作為篩選DEGs 的閾值。

1.3 GO 和KEGG 富集分析 R 軟件中的Cluster－Profiler 包（版本：4．0）被用于GO 和KEGG 富集分析。箱式圖由ggplot2 包繪制；PCA 圖由ggord 包繪制；熱圖由pheatmap 包繪制。上述所有分析方法和R 軟件包均由R 軟件（2020）4．0．3 版完成。

1.4 Metascape 使用Metascape[11]（http：//metascape．org/）對得到的DEGs 再次進行GO 和KEGG 富集分析，與ClusterProfiler 包分析得到的結(jié)果進行對比驗證和互相補充，使最終結(jié)果更加真實可靠。篩選條件：Min Enrichment=1．5，P＜0．01 and Min overlap=3。

1.5 WEB－based GEneSeTAnaLysis Toolkit（WebGestalt）數(shù)據(jù)庫和Reactome Pathway 數(shù)據(jù)庫 使用WebGestalt[12]（http：//www．webgestalt．org/）和Reactome[13]（https：//reactome．org/）數(shù)據(jù)庫對DEGs 從另一種算法角度進行GO 和KEGG 富集分析，從而補充單一算法的不足。WebGestalt 數(shù)據(jù)庫的篩選標準是Number of IDs in the category：5－2000，F(xiàn)DR Method：BH，and Significance Level：FDR＜0．05。Analysis Tools是Reactome 數(shù)據(jù)庫中的一個分析工具，被用于通路研究。

1.6 蛋白－蛋白交互網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與靶基因篩選 使用STRING[14]（https：//string－db．org/）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEGs的蛋白－蛋白交互網(wǎng)絡(luò)，minimum required interaction score=0．4 被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Cytoscape 對蛋白－蛋白交互網(wǎng)絡(luò)進行可視化[15]，并使用Cytoscape 的插件Cytohubba 篩選出最重要的9個核心基因。

1.7 lncRNA－miRNA－靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析在Tarbase[16]（http：//carolina． imis．a(chǎn)thena－innovation．gr/diana_tools/web/index．php?r=tarbasev8%2Findex）和TargetScan[17]（http：//www．targetscan．org/vert_80/）數(shù)據(jù)庫中，使用評分最高的4 個核心基因預(yù)測可能的miRNA，并通過取交集的方法降低結(jié)果的偶然性，從而得到可靠性最高的miRNA。使用ENCORI[18]（https：//starbase．sysu．edu．cn/）預(yù)測與miRNA 相匹配的lncRNA，并使用LncBase[19]（http：//carolina．imis．a(chǎn)thena－innovation．gr/diana_tools/web/index．php?r=lncbasev2%2Findex－experimental）進行驗證，從而構(gòu)建出最可靠的lncRNA－miRNA－靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.8 circRNA－miRNA－靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 使用與1．7 相同的方法預(yù)測篩選可以與9 個靶基因相匹配的miRNA。使用ENCORI 數(shù)據(jù)庫預(yù)測與miRNA 匹配的circRNA，并使用circad 數(shù)據(jù)庫[20]（https：//clingen．igib．res．in/circad/）進行臨床驗證。

1.9 轉(zhuǎn)錄因子－miRNA－靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 使用AnimalTFDB[21]（http：//bioinfo．life．hust．edu．cn/AnimalTFDB/）預(yù)測得分最高的4 個基因所對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，并使用JASPAR[22]（https：//jaspar．genereg．net/）對得到的轉(zhuǎn)錄因子進行二次驗證，以提高結(jié)果的可靠性。最終，每個靶基因篩選出了2 個評分最高的轉(zhuǎn)錄因子，篩選標準：Strand：+，P-value＜0．05 and Q-value ＜0．05。

1.10 The Drug Gene Interaction（DGIdb）數(shù)據(jù)庫 DGIdb[23]（http s：//www．dgidb．org/）被用于預(yù)測9 個靶基因的潛在靶向藥物。篩選標準：Source Databases=22，Gene Categories=43，Interaction Types=31。

1.11 臨床意義驗證 提取GSE41649 數(shù)據(jù)集中的臨床信息后，分別借助pROC 包和ggplot2 分析評分最高的4 個核心基因?qū)ο募膊☆A(yù)測能力和差異表達情況。

2 結(jié)果

2.1 哮喘差異表達基因的識別 使用R 軟件的Limma 包（版本：3．40．2）對GSE43696 和GSE64913數(shù)據(jù)集的信息進行標準化和去批次效應(yīng)后，共得到76 個DEGs，其中44 個基因上調(diào)，32 個基因下調(diào)（P＜0．05 &/Fold Change/＞1．5）。數(shù)據(jù)標準化后的箱式圖、去批次前/后的PCA 圖、DEGs 的火山圖、熱圖及DEGs 中的特定基因如圖1 所示。

圖1 哮喘差異表達基因的識別Fig 1 Identification of differentially expressed genes in asthma

2.2 GO 和KEGG 富集分析 使用R 軟件的ClusterProfiler 包（版本：4．0）以及Metascape、WebGestalt 和Reactome 對DEGs 進行GO 和KEGG 富集分析并可視化（圖2、3）。GO 富集分析顯示，DEGs在淋巴細胞趨化、器官或組織特異性免疫反應(yīng)、有機羥基化合物運輸、細胞殺傷、黏膜免疫反應(yīng)、抗菌體液反應(yīng)、內(nèi)吞調(diào)節(jié)等方面明顯富集。KEGG 富集分析表明，DEGs 主要參與白細胞介素－17 信號通路、抑制一氧化氮產(chǎn)生、激活C3 和C5、果糖和甘露糖代謝等方面。

圖2 上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因的GO 和KEGG 富集分析Fig 2 Gene Ontology（GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）enrichment analysis of up-regulated genes and downregulated genes

圖3 差異表達基因的GO 和KEGG 富集分析Fig 3 Gene Ontology（GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 蛋白－蛋白交互網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與靶基因篩選 使用Cytoscape 對STRING 構(gòu)建的蛋白－蛋白交互網(wǎng)絡(luò)進行可視化，共有43 個節(jié)點和54 條邊（圖4A）。通過Cytohubba 使用11 種方法來識別DEGs 中的核心基因，MCC 展現(xiàn)出了更好的比較性能。最終得到了9個評分最高的DEGs，它們分別是CLCA1、POSTN、CPA3、LTF、PIP、FKBP5、CCL26、SERPINB2 和 KIT（圖4B）。在這9 個核心基因中，LTF 和PIP 在哮喘患者中低表達，其余基因均為高表達。

圖4 蛋白-蛋白交互網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Protein-protein interaction network

2.4 lncRNA－miRNA－靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 評分最高的4 個核心基因分別是CLCA1、POSTN、CPA3 和LTF。Tarbase 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到了67 個miRNA，其中hsa-miR-19b-3p 是兩個數(shù)據(jù)庫取交集后的公共結(jié)果。使用ENCORI 預(yù)測可能與hsa-miR-19b-3p 相互作用的lncRNA，并通過LncBase 驗證結(jié)果。最終共得到7 個最可靠的lncRNA（ENSG00000272264、ENSG00000270087、ENSG00000245532、ENSG00000275764、ENSG0000-0263753、ENSG00000229807 和ENSG00000230590），并通過Cytoscape 對結(jié)果進行了可視化（圖5A）。

圖5 lncRNA/circRNA-miRNA-靶基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 5 The lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA interaction network

2.5 circRNA-miRNA-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 共有158 個miRNA 被預(yù)測到，最終篩選保留了2 個最可靠的miRNA（hsa-miR-19b-3p 和hsa-miR-218-5p）。使用ENCORI 預(yù)測可能與以上2 個miRNA相互作用的circRNA，共得到1 314 個circRNA。借助Circad 數(shù)據(jù)庫驗證預(yù)測得到的circRNA 的臨床信息，最終確認SNX13 是與哮喘相關(guān)的circRNA（圖5B）。

2.6 轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 用AnimalTFDB 預(yù)測評分最高的4 個核心基因所對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，用JASPAR 對結(jié)果進行驗證。最終，每個核心基因篩選出了2 個最可靠的轉(zhuǎn)錄因子。它們分別是SPI1、RREB1、AR、BCL6、IRF5、ZNF143、MAZ 和PAX5。轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖6A。

圖6 轉(zhuǎn)錄因子-靶基因-miRNA 的相互作用網(wǎng)絡(luò)與藥物-靶基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 6 Transcription factor-mRNA-miRNA interaction network and drug-mRNA interaction network

2.7 哮喘的靶向藥物 使用DGIdb 預(yù)測9 個靶基因的潛在靶向藥物，共得到了91 種藥物，這些藥物有可能干預(yù)哮喘DEGs 的表達（圖6B）。評分最高的4 個核心基因中有2 個預(yù)測到了潛在的靶向藥物或分子化合物。CLCA1 的靶向藥物是他尼氟酯，LTF的潛在靶向藥物或分子化合物分別是α-苯丙氨酸轉(zhuǎn)鐵蛋白、帕瑞昔布、巴比妥珠和雷瑟平。此外，相互作用評分最高的藥物——尿激酶被發(fā)現(xiàn)與SERPINB2 存在相互作用。預(yù)測到靶向藥物或分子化合物最多的靶基因是KIT，它共有72 種靶向藥物或分子化合物。

2.8 臨床意義驗證 ROC 曲線顯示，評分最高的4 個hub 基因中，CLCA1、POSTN 和LTF 對哮喘均具有較高的疾病預(yù)測能力，而CPA3 同樣具有中等的疾病預(yù)測能力（圖7A~7D）。分組比較圖顯示CLCA1、POSTN 和LTF 在新的臨床數(shù)據(jù)中同樣存在表達差異，其中CLCA1 和POSTN 在哮喘中高表達，LTF 在哮喘中低表達（圖7E~7H）。

圖7 核心基因的ROC 曲線和分組比較圖Fig 7 ROC curves and grouping comparison plots for hub genes

3 討論

哮喘的發(fā)病機制復(fù)雜，在診斷和精準醫(yī)療方面仍存在諸多不足。傳統(tǒng)治療藥物如糖皮質(zhì)激素等的治療周期長、依從性差，治療效果并不足夠理想，而奧馬珠單克隆抗體等生物制劑的安全性和經(jīng)濟負擔(dān)讓很多患者及家屬感到擔(dān)憂[24]。本研究構(gòu)建了miRNA、lncRNA、circRNA、轉(zhuǎn)錄因子、靶向藥物和靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而為哮喘相關(guān)生物標志物的探索提供一定的參考依據(jù)，對哮喘患者和有潛在風(fēng)險者的早期識別、早期診斷和早期治療有一定的臨床價值。

本研究通過對GSE43696 和GSE64913 這2 個數(shù)據(jù)集的分析，得到了44 個在哮喘中高表達的DEGs 和32 個低表達的DEGs。GO 分析顯示DEGs 的功能主要富集在先天免疫、獲得性免疫和炎癥的發(fā)生、發(fā)展上，尤其是細胞殺傷、內(nèi)吞作用的調(diào)節(jié)和淋巴細胞趨化作用等方面。既往研究表明，一些哮喘相關(guān)基因可以促進氣道炎癥，并在炎癥體的幫助下誘發(fā)哮喘的發(fā)生。此外，既往感染引起過敏原特異性免疫功能的過早表達，對哮喘的發(fā)生、發(fā)展也有一定作用[25]，這與本研究的結(jié)論一致。通路富集的結(jié)果顯示，趨化因子信號通路、激素和有機物代謝通路和免疫調(diào)節(jié)通路在DEGs 中具有較好的富集結(jié)果，說明哮喘的發(fā)生發(fā)展與免疫、微生物、炎癥以及有機物代謝密切相關(guān)，提示可以從這些角度對哮喘的診斷和治療進行早期干預(yù)。

在構(gòu)建DEGs 的蛋白-蛋白交互網(wǎng)絡(luò)后，共篩選出了9 個靶基因，其中LTF 和PIP 在哮喘患者中低表達，其余為高表達。4 個核心基因，即CLCA1、POSTN、CPA3 和LTF 的篩選評分最高。CLCA1 的全稱是氯通道附屬物1，可以調(diào)節(jié)鈣激活的氯離子傳導(dǎo)，產(chǎn)生分泌蛋白和膜相關(guān)蛋白，這些蛋白可以增加白細胞浸潤和氣道高反應(yīng)性，從而增加哮喘的易感性[26]。POSTN 是骨膜蛋白，它在轉(zhuǎn)化生長因子-β 和白細胞介素-13 的作用下產(chǎn)生。據(jù)報道，在哮喘患者的呼氣冷凝物中可以檢測到骨膜蛋白，且POSTN 高表達的患者肺功能相應(yīng)下降，表明POSTN 有被用作生物標志物的可能性[27]。CPA3 的全稱是羧肽酶A3，有報道稱該基因與哮喘、冠心病、COVID-19 等有關(guān)，原因可能是該酶可參與巨噬細胞的激活和促炎癥細胞因子的上調(diào)，從而直接或間接參與炎癥和免疫調(diào)節(jié)[28]。LTF（乳鐵蛋白）是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族基因的一員，其蛋白產(chǎn)物是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，然而遺憾的是目前還沒有發(fā)現(xiàn)這個基因與哮喘發(fā)生和發(fā)展之間的具體關(guān)系。本研究篩選得到的這些基因具有作為哮喘診治靶基因的巨大潛力。

Has-miR-19b-3p 和hsa-miR-218-5p 是通過不同的數(shù)據(jù)庫和算法最終篩選得到的2 個miRNA。既往研究顯示，hsa-miR-19b-3p 可能在哮喘的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮潛在作用[29]。Hsa-miR-218-5p 是由KIT 預(yù)測得到的，同樣有文獻表明它可能在嗜酸性粒細胞氣道炎癥中起到保護作用[30]。在miRNA 的基礎(chǔ)上，共篩選得到了7 個lncRNA 和1 個circRNA，最終構(gòu)建了miRNA、lncRNA、circRNA 和靶基因的表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為哮喘診斷的進一步研究和精準醫(yī)療提供了依據(jù)。

共篩選得到了8 個轉(zhuǎn)錄因子，它們在炎癥、細胞增殖和分化、免疫調(diào)節(jié)、生長發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[31-32]，有被用作哮喘治療標志物的可能性。此外，靶向藥物的預(yù)測顯示CLCA1 的靶向藥物他尼氟酯是一種非甾體類抗炎藥，可用于纖維囊腫和哮喘的輔助治療[33]。LTF 的潛在靶向藥物或分子化合物分別是α-苯丙氨酸轉(zhuǎn)鐵蛋白、帕瑞昔布、巴比妥珠和雷瑟平，它們在治療哮喘方面的作用尚不清楚。交互得分最高的靶向藥物尿激酶主要作用于內(nèi)源性纖維蛋白溶解系統(tǒng)，它也可能與哮喘的治療有關(guān)[34]。此外，靶基因KIT 共預(yù)測到了72 種靶向藥物，這些藥物同樣可能為哮喘的治療提供一個新的方向，所以值得進一步研究和探索。

本研究使用了2 個去批次效應(yīng)后的數(shù)據(jù)集來增加樣本量，并使用了1 個新的數(shù)據(jù)集驗證最終的結(jié)果，從而使本文結(jié)論更加可靠。此外，本研究還預(yù)測了與哮喘有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和藥物，這使本研究比以往的研究更加全面和廣泛。本研究同樣存在一些局限性。首先，雖然使用了多個數(shù)據(jù)庫和不同算法取交集的方法來提高結(jié)果的可靠性，但仍缺少體內(nèi)體外實驗對通路和機制進行進一步驗證，后續(xù)可以從實驗驗證等方面對本文的研究結(jié)果進行更加深入的分析研究。此外，本研究的數(shù)據(jù)來自于公共數(shù)據(jù)庫，缺少外部數(shù)據(jù)進行驗證，因此存在假陽性的可能性，后續(xù)可以使用更高質(zhì)量的外部數(shù)據(jù)進行前瞻性研究與本文結(jié)果進行互相佐證從而降低假陽性率。

綜上所述，本研究共識別出了76 個DEGs，并從中篩選出了9 個靶基因。細胞殺傷、調(diào)節(jié)內(nèi)吞作用、淋巴細胞趨化等生物功能和趨化因子信號通路、免疫調(diào)節(jié)通路等通路都在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中起到一定的作用。SNX13 和7 個lncRNA 通過hsa-miR-19b-3p 和hsa-miR-218-5p 參與哮喘相關(guān)基因的表達和調(diào)控。此外SPI1 等轉(zhuǎn)錄因子和他尼氟酯等藥物同樣可能會干預(yù)哮喘相關(guān)基因的表達調(diào)控。