趙國連 雷倩 王佩 任云霞 關(guān)靖

結(jié)核性胸膜炎是由結(jié)核分枝桿菌直接感染胸膜或結(jié)核分枝桿菌菌體成分引起胸膜發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)引起,被劃歸為第5型肺結(jié)核,在我國結(jié)核病患者中約占6.5%～8.7%[1-2]。結(jié)核性胸膜炎的早期癥狀與肺結(jié)核相似,常規(guī)實驗室檢查方法的特異度較低,診斷難度較高。目前,結(jié)核性胸膜炎的診斷標準為胸腔積液或胸膜活檢標本培養(yǎng)陽性,菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌,或胸膜活檢組織符合結(jié)核病改變[3]。由于胸膜穿刺活檢創(chuàng)傷大,胸腔積液含菌量低且培養(yǎng)時間長,使得結(jié)核性胸膜炎的診斷尤其是早期診斷仍然具有挑戰(zhàn)性。近年來,分子生物學檢測技術(shù)為結(jié)核性胸膜炎的快速診斷提供了新的思路[4]。據(jù)報道,恒溫擴增技術(shù)檢測痰液中結(jié)核分枝桿菌DNA無需溫度變化,擴增效率高,反應(yīng)時間短,且其反應(yīng)受抑制物的影響較小[5-6],但該檢測技術(shù)在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用還鮮有報道。筆者探索了胸腔積液DNA實時熒光恒溫擴增法(簡稱“恒溫擴增法”)對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值,以及聯(lián)合常規(guī)快速檢測中的腺苷脫氨酶(adenosine deaminase,ADA)和外周血結(jié)核感染 T 細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測的診斷價值,以期在不增加患者經(jīng)濟負擔的前提下加快診斷速度,以盡早開展治療。

對象和方法

一、研究對象遴選

1.研究對象:采用回顧性研究方法,選取2020年1月至2021年12月西安市胸科醫(yī)院收治的不明原因胸腔積液患者427例作為研究對象,其中,男性294例(68.9%),女性133例(31.1%),年齡范圍為3～99歲,年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為56(34,70)歲。收集研究對象的人口學特征和實驗室數(shù)據(jù),實驗室數(shù)據(jù)包括恒溫擴增法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、ADA、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、C反應(yīng)蛋白、外周血T-SPOT.TB、胸膜組織活檢等檢測結(jié)果。

2.納入和排除標準:(1)納入標準:研究對象于入院后3 d內(nèi)進行了外周血T-SPOT.TB、胸部CT掃描或胸部超聲檢查,并抽取胸腔積液進行恒溫擴增法檢測、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、胸腔積液常規(guī)檢測及生化檢測;(2)排除標準:檢查結(jié)果缺失、HIV陽性、免疫抑制、非結(jié)核分枝桿菌感染患者。

3.診斷標準:(1)患者有發(fā)熱、咳嗽、乏力、盜汗等癥狀,影像學表現(xiàn)為胸腔積液,或抗結(jié)核藥物治療后胸腔積液明顯吸收;(2)胸腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性;(3)胸腔積液結(jié)核分枝桿菌分子生物學檢測陽性;(4)胸膜組織活檢結(jié)核分枝桿菌陽性[7]。符合(1)且滿足(2)～(4)之一者,診斷為結(jié)核性胸膜炎。其他原因引起的胸腔積液為非結(jié)核性胸膜炎,包括感染性胸腔積液和惡性胸腔積液等。

二、研究方法

(一)儀器與試劑

恒溫擴增試劑購自廣州迪澳生物科技有限公司,ADA、LDH、C反應(yīng)蛋白檢測試劑購自寧波瑞源生物科技有限公司,MPB64蛋白單克隆抗體試劑購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司,T-SPOT.TB試劑購自廣東希格生物科技有限公司。Deaou-308C恒溫熒光PCR快速檢測系統(tǒng)購自廣州迪澳生物科技有限公司,BACTEC MGIT 960系統(tǒng)購自美國BD公司,ADVIA 2400全自動生化分析儀購自德國西門子公司。胸膜組織全自動活檢槍及配套活檢針購自美國巴德公司。

(二)檢測方法

1.恒溫擴增法:將胸腔積液用氫氧化鈉處理,按照說明書加入DNA實時熒光恒溫擴增試劑,在Deaou-308C恒溫熒光PCR快速檢測系統(tǒng)中檢測結(jié)核分枝桿菌DNA特異性片段(插入序列IS6110)的熒光信號。儀器捕獲熒光產(chǎn)生的樣本曲線與閾值線(閾值線設(shè)置為超過正常陰性對照擴增曲線的最高點)交點橫坐標讀數(shù)即為探測時間(detection time,dt;1 dt=1 min),dt<40判斷為陽性,dt≥40或無結(jié)果判斷為陰性。

2.結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng):將胸腔積液用氫氧化鈉處理,離心后,將上清液加入BACTEC MGIT 960系統(tǒng)進行分枝桿菌液體培養(yǎng),培養(yǎng)出的陽性菌株先用萋-尼抗酸桿菌染色法進行涂片鏡檢,再用膠體金標記的MPB64蛋白單克隆抗體試劑進行抗原檢測,均為陽性的樣本則為結(jié)核分枝桿菌陽性。

3.ADA和LDH檢測:將胸腔積液離心后加入緩沖液和ADA過氧化物酶試劑、LDH乳酸底物試劑,在ADVIA 2400全自動生化分析儀中測定ADA和LDH活性。

4.T-SPOT.TB檢測:參照說明書,將外周血經(jīng)培養(yǎng)液處理后,使用Ficoll淋巴分離液分離出淋巴細胞,用AIM-V培養(yǎng)基重懸細胞,加入特異性抗原反應(yīng)檢測孔培養(yǎng)20～22 h,隨后加入顯色液顯色,計數(shù)斑點數(shù)。

5.C反應(yīng)蛋白檢測:在血清中加入氯化銨緩沖液,混勻孵育1～5 min,加入抗人C反應(yīng)蛋白抗體乳膠顆粒,混勻后讀取吸光度值。

6.胸膜組織活檢:采用超聲引導下的胸膜穿刺活檢術(shù)取出胸膜組織,將組織用福爾馬林液固定后,從顯微鏡下觀測組織是否有結(jié)核結(jié)節(jié)以及干酪樣壞死。

三、判斷標準

各檢測指標中有一項陽性即判斷為并聯(lián)檢測陽性;各診斷指標均為陽性即判斷為串聯(lián)陽性。成本-效果由成本與效果的比值表示(C/E),C/E越小性價比越高。本研究用各種檢測方法的約登指數(shù)(敏感度+特異度-1)表示其對結(jié)核性胸膜炎和非結(jié)核性胸膜炎的識別能力[8]。使用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)評估胸腔積液ADA的最佳診斷臨界值,以及各檢測方法的診斷效能。

四、統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析。計量資料非正態(tài)分布,以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]”描述,組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗,相關(guān)性檢驗采用Spearman相關(guān)性分析;計數(shù)資料以“頻數(shù)和百分率(%)”描述,組間差異的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、基本情況

427例研究對象中,279例(65.3%)確診為結(jié)核性胸膜炎(結(jié)核性胸膜炎組),其中,胸腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性者有84例(30.1%),胸腔積液恒溫擴增檢測陽性88例(31.5%),合并肺結(jié)核者占88.2%(246/279)。427例研究對象中有30例參與了胸膜組織活檢,結(jié)核分枝桿菌陽性者占46.7%(14/30)。

148例確診為非結(jié)核性胸膜炎(非結(jié)核性胸膜炎組),其中,肺炎旁胸腔積液者110例(74.3%),惡性胸腔積液者37例(25.0%),合并肺結(jié)核者22例(14.9%)。37例惡性胸腔積液患者最終診斷為肺腺癌13例、肺鱗癌6例、肺小細胞癌4例、乳腺癌伴胸膜轉(zhuǎn)移瘤3例、胸膜間皮瘤2例、淋巴癌1例、胸椎腫瘤1例、黏液纖維肉瘤1例、胸膜腺癌1例;另有5例未最終確診。

兩組患者實驗室檢測結(jié)果中,恒溫擴增結(jié)果、ADA水平、LDH水平、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果、外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)果,以及外周血C反應(yīng)蛋白水平差異均有統(tǒng)計學意義(表1)。ADA和LDH有明顯相關(guān)性(r=0.709,P<0.001)。結(jié)核性胸膜炎患者、肺炎旁胸腔積液患者、惡性胸腔積液患者出現(xiàn)胸腔積液滲出液的比例分別為97.5%(272/279)、80.0%(88/110)、81.1%(30/37),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=35.687,P<0.001);出現(xiàn)血性胸腔積液的比例分別為7.9%(22/279)、6.4%(7/110)、43.2%(16/37),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=30.012,P<0.001)。

表1 各實驗室檢測結(jié)果在結(jié)核性胸膜炎和非結(jié)核性胸膜炎患者中的分布情況

二、胸腔積液ADA最佳診斷臨界值

結(jié)核性胸膜炎組ADA水平明顯高于非結(jié)核性胸膜炎組,差異有統(tǒng)計學意義。根據(jù)ROC曲線,兩組ADA水平的最佳分界值為19.5 U/L,敏感度為74.9%,特異度為87.8%(圖1)。根據(jù)最佳分界值,胸腔積液ADA水平>19.5 U/L的為ADA陽性,≤19.5 U/L為ADA陰性,結(jié)核性胸膜炎組ADA陽性者有209例(74.9%),非結(jié)核性胸膜炎組ADA陽性者有19例 (12.8%),兩組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=149.729,P<0.001)。

圖1 胸腔積液腺苷脫氨酶水平診斷結(jié)核性胸膜炎效能的受試者工作特征曲線

三、不同檢測方法的診斷價值

1.單獨檢測:恒溫擴增法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的特異度均為100%,敏感度分別為31.54%和30.11%。ADA和外周血T-SPOT.TB的敏感度較高,分別為74.91%和84.95%,特異度分別為87.16%和74.91%。ADA和外周血T-SPOT.TB的ROC曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.81和0.78,比恒溫擴增法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法高(分別為0.66和0.65)。4種檢測方法對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值見表2,ROC曲線見圖2。

圖2 不同方法診斷結(jié)核性胸膜炎效能的受試者工作特征曲線

表2 不同檢測方案用于結(jié)核性胸膜炎檢測的成本-效果比較

2.聯(lián)合檢測: 恒溫擴增法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、ADA,以及外周血T-SPOT.TB檢測可以通過并聯(lián)或串聯(lián)的方式組成多種聯(lián)合檢測方案。本研究根據(jù)敏感度、特異度、臨床適用性等最終選取了4種聯(lián)合檢測方案,分別是:(1)ADA+T-SPOT.TB檢測并聯(lián);(2)ADA+T-SPOT.TB檢測串聯(lián);(3)恒溫擴增法+ADA+T-SPOT.TB檢測并聯(lián);(4)恒溫擴增法+結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)+ADA+T-SPOT.TB檢測并聯(lián)。其中,ADA+T-SPOT.TB串聯(lián)、恒溫擴增法+ADA+T-SPOT.TB檢測并聯(lián)、恒溫擴增法+結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)+ADA+T-SPOT.TB檢測并聯(lián)的敏感度較高,分別為94.27%、94.98%、94.98%;ADA+T-SPOT.TB檢測串聯(lián)的特異度為100.00%。方案(3)和(4)的各項指標均一致。具體見圖3。

圖3 不同方法聯(lián)合診斷結(jié)核性胸膜炎效能的受試者工作特征曲線

四、不同檢測方案成本比較

4種檢測方法和4種聯(lián)合檢測方法的成本-效果(C/E)比較,其中,單種檢測方法中ADA檢測的C/E最小(16.13),性價比最高。聯(lián)合檢測方法中ADA+T-SPOT.TB檢測串聯(lián)性價比最高,C/E為669.23(表2)。恒溫擴增法+ADA+T-SPOT.TB并聯(lián)檢測有利于結(jié)核性胸膜炎早期診斷,且不會增加患者負擔。

討 論

結(jié)核性胸膜炎臨床癥狀與肺結(jié)核不易區(qū)分,許多結(jié)核性胸膜炎繼發(fā)于肺結(jié)核,通過臨床特征、影像學、結(jié)核抗體等常規(guī)檢查手段很難確診結(jié)核性胸膜炎[9]。結(jié)核性胸膜炎常伴有胸腔積液,其診斷的金標準除了胸膜組織活檢陽性,還包括從胸腔積液中找到結(jié)核分枝桿菌,采用如抗酸桿菌染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、分子生物學檢測等方法。但是很多結(jié)核性胸膜炎患者是由少量的結(jié)核分枝桿菌及其菌體成分引起的胸膜變態(tài)反應(yīng),胸腔積液中的含菌量非常低,僅通過以上檢測方法容易導致漏診[1,10]。

傳統(tǒng)分離培養(yǎng)需要約21～30 d才能獲得結(jié)果,延誤診斷時間。隨著分子生物學的快速發(fā)展,快速檢測標本中結(jié)核分枝桿菌的RNA和DNA有利于早期診斷肺結(jié)核[4,11-12]。目前,PCR-熒光探針法檢測胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌DNA(TB-DNA)和恒溫擴增檢測技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌RNA在臨床已有應(yīng)用,但其檢測陽性率不足20%,且價格較高,臨床適用性不強[10-11]。恒溫擴增法檢測胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌DNA的應(yīng)用少有報道。本研究發(fā)現(xiàn)恒溫擴增法與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的檢測陽性率相當(超過30%),且特異度均為100%,未發(fā)現(xiàn)假陽性,檢測速度快(僅需3 h)。另外,GeneXpert MTB/RIF和胸腔積液游離核酸檢測(cell-freeMycobacteriumtuberculosisDNA test,CF.TB)可明顯提高結(jié)核性胸膜炎診斷的敏感度[13-16],但由于GeneXpert MTB/RIF 檢測價格昂貴及CF.TB還未有成熟的商品化試劑等因素,筆者所在醫(yī)院檢測患者較少,難以對照,因此沒有納入研究。

除了結(jié)核性胸膜炎,炎癥、惡性腫瘤、自身免疫性疾病也常伴有胸腔積液,可以使用具有一定特異性的生物標志物進行鑒別診斷。不同研究中利用胸腔積液ADA檢測診斷結(jié)核性胸膜炎的界值差異較大,還未有定論[17-18]。ADA檢測還會受到免疫狀態(tài)、年齡、吸煙史、結(jié)核性胸膜炎發(fā)展階段等因素的影響[19-20]。本研究初步確定了利用ADA診斷結(jié)核性胸膜炎的最佳分界值,可為后續(xù)研究提供參考。另外,雖然胸腔積液T-SPOT.TB的診斷效果明顯高于外周血,較少受到肺結(jié)核伴胸腔積液的干擾[21],但是在實際臨床應(yīng)用中,不明原因胸腔積液的患者在初期篩查時,尤其在綜合醫(yī)院就診時通常會檢測外周血T-SPOT.TB,轉(zhuǎn)入?？漆t(yī)院后為了節(jié)約費用不會再做胸腔積液T-SPOT.TB檢測。因此,本研究僅收集了外周血T-SPOT.TB檢測數(shù)據(jù)。經(jīng)過對比分析,胸腔積液ADA和外周血T-SPOT.TB檢測并聯(lián)的檢測敏感度較高(94.27%),串聯(lián)的特異度較高(99.32%)。可見,合理利用胸腔積液ADA和外周血T-SPOT.TB聯(lián)合檢測的結(jié)果可以提高結(jié)核性胸膜炎的診斷效能。

本研究顯示,恒溫擴增法+ADA+T-SPOT.TB并聯(lián)和恒溫擴增法+結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)+ADA+T-SPOT.TB并聯(lián)的檢測效能完全一致。在實際臨床應(yīng)用中,可以通過胸腔積液ADA<19.5 U/L且T-SPOT.TB檢測結(jié)果陰性排除結(jié)核性胸膜炎,用任意胸腔積液ADA≥19.5 U/L、T-SPOT.TB檢測結(jié)果陽性、恒溫擴增檢測結(jié)果陽性確診結(jié)核性胸膜炎。雖然這3項檢查結(jié)果分別為生化、免疫、病原學指標,但是均為快速檢測方法,有助于早期診斷和治療。且ADA和T-SPOT.TB為結(jié)核性胸膜炎疑似患者的常規(guī)檢查,并不會額外增加患者負擔。

根據(jù)各檢測方案的成本比較,獨立檢驗中胸腔積液ADA檢測的成本-效果比最低,方案最為經(jīng)濟,但其敏感度和特異度不足90%,且影響因素較多,不宜作為單獨診斷方案。對于結(jié)核性胸膜炎早期診斷,使用恒溫擴增法獲得病原學診斷依據(jù),同時可以聯(lián)合ADA、T-SPOT.TB檢測獲得較高的性價比。

本研究的不足之處在于未能納入檢測效能更高的GeneXpert MTB/RIF、CF.TB等方法作為對照。另外,本研究為回顧性分析和單中心研究,結(jié)果有局限性,還需進一步驗證。

綜上所述,胸腔積液結(jié)核分枝桿菌DNA恒溫擴增法在結(jié)核性胸膜炎的臨床診斷中具有較好的臨床應(yīng)用價值和經(jīng)濟價值,與ADA、T-SPOT.TB等快速檢測方案并聯(lián)可以在患者就診早期診斷結(jié)核性胸膜炎。靈活運用以上幾種檢測的聯(lián)合方案可以獲得較高的性價比,減輕患者經(jīng)濟負擔。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻趙國連:醞釀和設(shè)計實驗、采集數(shù)據(jù)、獲取研究經(jīng)費;雷倩:醞釀和設(shè)計實驗、統(tǒng)計分析、起草文章;王佩和任云霞:采集、分析/解釋數(shù)據(jù)、行政、技術(shù)或材料支持;關(guān)靖:醞釀和設(shè)計實驗、分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析