陶斯陽

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是由柯薩奇病毒、?？刹《镜榷喾N病毒感染誘發(fā)的,以局限性或彌漫性炎癥改變?yōu)橹饕±肀憩F(xiàn)的感染性心肌病,為常見的心臟疾病之一[1]。病毒性心肌炎好發(fā)于40歲以下的青壯年人群,資料顯示,其在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率為0.12%～12.00%,我國發(fā)病率略高,為5%～15%,并且呈逐年上升趨勢[2]。該病起病隱匿,病情復雜,大部分可痊愈,但有研究顯示,若治療不當,10%～20%的病人可發(fā)展為擴張型心肌病[3],而8%～12%的病人會發(fā)生心源性猝死[4],嚴重威脅病人的生命健康。目前,病毒性心肌炎尚無特異性療法,西醫(yī)臨床治療以自由基清除劑為主,抗病毒藥、免疫抑制劑等及其他對癥療法為輔,療效并不理想。因此,尋找更為安全有效的藥物成為研究的熱點,而中醫(yī)藥以其獨特的優(yōu)勢日益受到關(guān)注。丹參酮ⅡA為中藥丹參活性成分之一,其注射劑治療病毒性心肌炎有顯著的臨床療效,且安全性較高[5]。本研究主要通過觀察丹參酮ⅡA對Toll樣受體4(TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號通路的影響,探討其對病毒性心肌炎小鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級4～6周齡雄性健康BALB/C小鼠75只,由第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)2017-0005,體質(zhì)量16～20(18.25±1.13)g。所有小鼠飼養(yǎng)于動物實驗室,保證環(huán)境恒溫21～23 ℃,恒濕50%～60%,有良好的通風和采光,自然光線,自由飲用滅菌純水,進食普通飼料,適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.2 實驗藥品與試劑 柯薩奇病毒B3(CVB3)Nancy病毒、人宮頸癌細胞(Hela細胞)購自美國ATCC公司。丹參酮ⅡA,CAS號:568-72-9,純度:高效液相色譜(HPLC)≥98%,規(guī)格:每瓶20 mg,購自南京道斯夫生物科技有限公司,采用0.9% NaCl配成濃度2.5 mg/mL、5.0 mg/mL的丹參酮ⅡA溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配;利巴韋林顆粒,規(guī)格:每袋0.1 g,國藥準字H10970280,生產(chǎn)批號:20190314,沈陽藥科大學制藥有限公司生產(chǎn),采用0.9% NaCl溶解配成濃度為6.7 mg/mL的利巴韋林溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。磷酸鹽緩沖液(PBS)、含吐溫的Tris緩沖鹽溶液(TBST)購自北京凱瑞基生物科技有限公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自愛必信(上海)生物科技有限公司;大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自武漢維克賽思科技有限公司;TNF-α、IL-6、IL-1β免疫組化試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司;3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司;蛋白裂解液(RIPA)購自北京百奧萊博科技有限公司;考馬斯亮藍法蛋白含量測試盒購自上?，庬嵣锟萍加邢薰?。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、電化學發(fā)生(ECL)法超敏發(fā)光液購自上海烜雅生物科技有限公司。兔抗鼠TLR4/NF-κB、肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG二抗購自北京澤平科技有限責任公司。

1.3 實驗儀器設(shè)備 2406-2型CO2培養(yǎng)箱,美國SHELLAB公司產(chǎn)品;4200型離心機,日本Kubota公司產(chǎn)品;Primo Star iLED型光學顯微鏡,蔡司Zeiss公司產(chǎn)品;TKA Teknolabo Miro型全自動酶免分析系統(tǒng),意大利TKA Teknolabo公司產(chǎn)品;Sub-Cell192型電泳槽、Trans-Blot SD 型半干轉(zhuǎn)印槽,美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.4 病毒溶液制備 采用CVB3感染Hela細胞,于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,后置于-70 ℃冰箱15 min,室溫融化,重復上述操作3 次后,1 500 r/min離心30 min,取上清液,即CVB3病毒液;稀釋病毒液,取10-10～1的10個滴度的病毒液各30 μL分別滴加到含有Hela細胞的96孔板內(nèi),每個滴度設(shè)3個復孔,連續(xù)5 d觀察細胞病變情況,其中浮起且折光性增強的細胞為病變細胞,若病變細胞比例>50%即為病變孔。采用Reed等[6]的方法測得CVB3致半數(shù)細胞感染量(TCID50)。

1.5 造模及給藥方法[7]將所有小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組,每組15只。模型組、丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組分別給予100的TCID50病毒液0.1 mL腹腔注射,對照組給予不含病毒的Eagle′s氏液0.1 mL腹腔注射。病毒接種30 min后,模型組和對照組分別給予0.9% NaCl溶液10 mL/kg灌胃,每日1次;丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組分別給予2.5 mg/mL、5.0 mg/mL丹參酮ⅡA溶液10 mL/kg灌胃,每日1次;陽性對照組給予6.7 mg/mL利巴韋林溶液灌胃,每日1次。各組小鼠均連續(xù)給藥14 d。

1.6 標本采集與處理[8]末次給藥后,每組選取13只小鼠,稱量體質(zhì)量(BM)后摘眼球采血1 mL,室溫靜置60 min,用低溫離心機3 000 r/min離心15 min,分離血清,保存于-20 ℃冰箱備檢。處死小鼠,完整取出心臟,吸凈表面血液后稱量心臟重量(HM),沿左心室長軸分為兩部分,其中一部分心肌組織置于10%甲醛內(nèi)固定24 h,常規(guī)經(jīng)上行梯度乙醇逐級脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,制成厚度為4 μm的切片,60 ℃烤片30 min,保存于4 ℃冰箱內(nèi),用于HE染色、免疫組化染色;另一部分心肌組織保存于-80 ℃冰箱,用于蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 心臟指數(shù)計算 計算公式為:心臟指數(shù)=HM/BM。

1.7.2 HE染色法觀察小鼠心肌組織病理變化 將心肌組織切片取出,經(jīng)二甲苯脫蠟、下行梯度乙醇(100%→95%→90%→80%→70%)水化后,參照文獻[9]以及HE染色試劑盒說明書進行HE染色,之后常規(guī)上行梯度乙醇逐級脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在×400光學顯微鏡下觀察心肌組織變化,每張切片隨機采集5個不重復視野的圖像,計算心肌病理積分并取平均值,評分標準[10]:無組織壞死或炎性浸潤,計0分;組織壞死或炎性浸潤面積<25%,計1分;組織壞死或炎性浸潤面積為25%～50%,計2分;組織壞死或炎性浸潤面積為51%～75%,計3分;組織壞死或炎性浸潤面積>75%,計4分。

1.7.3 ELISA法檢測小鼠血清心肌損傷指標及炎性因子水平 將血清恢復至室溫,依據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書中的步驟進行操作,采用TKA Teknolabo Miro型全自動酶免分析系統(tǒng)測定血清CK-MB、cTnT、TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.7.4 免疫組化染色觀察小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平 心肌組織切片脫蠟、水化后,置于枸櫞酸鹽緩沖液進行微波抗原修復,按照免疫組化試劑盒的說明書進行染色,分別依次采用1∶50稀釋的TNF-α、IL-6、IL-1β一抗4 ℃孵育16 h、生物素化二抗37 ℃孵育30 min,然后采用DAB試劑盒顯色,蘇木精復染,結(jié)束后常規(guī)脫水、透明、封片。在×400倍光學顯微鏡下觀察染色情況,陽性細胞被染成棕褐色或棕黃色,每張切片隨機采集5個不重復視野的圖像,采用IPP 6.0軟件分析TNF-α、IL-6、IL-1β表達的積分光密度值(IOD),并取平均值。

1.7.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法測定小鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達水平[11]取出心肌組織100 mg,加入RIPA裂解液(含苯甲基磺酰氟)1 mL,于冰上研磨并裂解30 min,4 ℃、15 000 r/min離心15 min,上清液采用考馬斯亮藍試劑盒測定總蛋白濃度;根據(jù)測定結(jié)果加入相應(yīng)體積4×蛋白上樣緩沖液,95 ℃加熱變性10 min;采用試劑盒制備SDS-PAGE凝膠固定在電泳槽上,加樣后,以恒壓50 V開始電泳,至目的蛋白剛跑出分離膠停止,用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至100%甲醇處理過的PVDF膜上,置于封閉液內(nèi)室溫搖床封閉2 h,然后將PVDF膜置于1∶500稀釋的TLR4、NF-κB及內(nèi)參β-actin一抗工作液內(nèi),4 ℃搖床反應(yīng)過夜,取出后用TBST洗滌10 min×3次,將PVDF膜置于1∶3 000稀釋的二抗工作液內(nèi),室溫搖床反應(yīng)90 min,再次用TBST洗滌10 min×3次,將配制好的ECL超敏發(fā)光液鋪于暗盒內(nèi)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜表面,曝光、顯影、定影。采集蛋白條帶圖像,采用Image J軟件分析TLR4、NF-κB及β-actin蛋白條帶灰度值,并分別計算TLR4、NF-κB相對內(nèi)參β-actin的表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心肌組織病理觀察結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示,對照組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)、纖維排列無異常,未見炎性細胞浸潤或組織壞死(見圖1A);模型組小鼠心肌組織存在心肌纖維溶解,大片組織壞死,大量巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤(見圖1B);丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠心肌組織壞死和炎性細胞浸潤較模型組不同程度緩解,其中丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組改善更為明顯(見圖1D、圖1E)。

圖1 各組小鼠心肌組織病理變化(HE染色,×400)(A為對照組;B為模型組;C為丹參酮ⅡA低濃度組;D為丹參酮ⅡA高濃度組;E為陽性對照組)

半定量分析顯示,與對照組比較,模型組小鼠心肌組織病理積分明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠心肌組織病理積分降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與丹參酮ⅡA低濃度組比較,丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組小鼠心肌組織病理積分降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠心肌組織病理積分比較(±s) 單位:分

2.2 各組小鼠心臟指數(shù)及血清心肌損傷指標比較 與對照組比較,模型組小鼠心臟指數(shù)及血清CK-MB、cTnT水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠心臟指數(shù)及血清CK-MB、cTnT水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與丹參酮ⅡA低濃度組比較,丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組小鼠心臟指數(shù)及血清CK-MB、cTnT水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠心臟指數(shù)及血清CK-MB、cTnT水平比較(±s)

2.3 各組小鼠血清炎性細胞因子水平比較 與對照組比較,模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與丹參酮ⅡA低濃度組比較,丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較(±s)

2.4 各組小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平比較 與對照組比較,模型組小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與丹參酮ⅡA低濃度組比較,丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4、圖2～圖4。

表4 各組小鼠心肌組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平比較(±s) 單位:×102IOD值

圖2 各組小鼠心肌組織TNF-α表達結(jié)果(免疫組化染色,×400)(A為對照組;B為模型組;C為丹參酮ⅡA低濃度組;D為丹參酮ⅡA高濃度組;E為陽性對照組)

圖3 各組小鼠心肌組織IL-6表達結(jié)果(免疫組化染色,×400)(A為對照組;B為模型組;C為丹參酮ⅡA低濃度組;D為丹參酮ⅡA高濃度組;E為陽性對照組)

圖4 各組小鼠心肌組織IL-1β表達結(jié)果(免疫組化染色,×400)(A為對照組;B為模型組;C為丹參酮ⅡA低濃度組;D為丹參酮ⅡA高濃度組;E為陽性對照組)

2.5 各組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達水平比較 與對照組比較,模型組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與丹參酮ⅡA低濃度組比較,丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB表達水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表5、圖5。

表5 各組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達水平比較(±s)

圖5 各組小鼠心肌組織TLR4、NF-κB蛋白表達條帶圖(A為對照組;B為模型組;C為丹參酮ⅡA低濃度組;D為丹參酮ⅡA高濃度組;E為陽性對照組)

3 討 論

在中醫(yī)理論中病毒性心肌炎屬“風溫”“心悸”“胸痹”“怔忡”等范疇,多因素體虧虛,溫邪趁虛而入,犯肺傷心所致,核心病機不外乎“虛”“毒”“瘀”,治療應(yīng)以補虛祛邪、活血化瘀為主[12]。丹參為臨床常用活血化瘀藥,有活血祛瘀、涼血消癰、養(yǎng)血安神之效,是中醫(yī)治療病毒性心肌炎的高頻用藥[13]。丹參酮ⅡA為提取自丹參的脂溶性非醌類衍生物成分,在丹參內(nèi)含量最高,其代謝產(chǎn)物能夠在機體內(nèi)發(fā)生多種生物化學反應(yīng)從而產(chǎn)生相應(yīng)藥理作用,研究顯示,其具有抗炎癥反應(yīng)、抗菌、抗病毒、抗脂質(zhì)過氧化、提高心功能、提高血管內(nèi)皮功能及心臟保護、抗腫瘤等多方面的藥理活性,在臨床廣泛用于心腦血管病的治療[14-15]。王德坤等[16]研究顯示,丹參酮ⅡA可能通過下調(diào)TNF-α、IL-6的表達來減輕病毒性心肌炎小鼠的心肌損傷,減少病死率,達到治療病毒性心肌炎的目的。研究發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可以通過抑制誘導型一氧化氮合酶表達,促進血管內(nèi)皮因子表達,來減輕CVB3 Nancy病毒感染小鼠引起的冠狀動脈血管內(nèi)皮損傷,并改善心肌灌流,促進受損心功能恢復[17]?？梢?丹參酮ⅡA能夠從多個途徑干預病毒性心肌炎的進展,但具體的作用機制尚未明確。本研究采用CVB3 Nancy病毒腹腔內(nèi)接種,結(jié)果顯示,模型組小鼠心臟指數(shù)、血清CK-MB、cTnT水平及心肌組織病理積分等指標均高于對照組,心肌組織病理觀察也出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常、大量炎性細胞浸潤及壞死灶,表現(xiàn)與人類病毒性心肌炎類似,成功建立了病毒性心肌炎小鼠模型。經(jīng)不同濃度的丹參酮ⅡA或利巴韋林干預后發(fā)現(xiàn),用藥組上述指標均較模型組降低(P<0.05),且具有一定的量效關(guān)系,表明丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴性地改善病毒性心肌炎小鼠心肌組織的病理變化,減輕心肌損傷,對病毒性心肌炎發(fā)揮有效的治療作用。

作為一種炎癥性心肌病,炎癥反應(yīng)貫穿病毒性心肌炎的始終,故炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路、細胞因子等也成為病毒性心肌炎發(fā)病機制及藥物治療靶點研究的重要方面。關(guān)于丹參酮ⅡA治療病毒性心肌炎的具體作用機制,本研究從TLR4/NF-κB信號通路入手進行了研究。TLR4屬于病原模式識別受體中的一員,對多種病毒抗原具有識別作用,可介導抗病毒固有免疫。研究顯示,TLR4可介導心肌組織炎癥反應(yīng),機體被CVB3等病毒感染時,分布于心肌細胞膜上的TLR4能夠?qū)Σ《净蛐募〖毎粨p傷后釋放的因子進行識別,然后將相關(guān)刺激信號傳入細胞內(nèi),誘發(fā)級聯(lián)反應(yīng),激活下游的NF-κB,NF-κB為快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,被TLR4激活后進入細胞核內(nèi),啟動相關(guān)基因表達,促進細胞因子合成釋放,產(chǎn)生免疫應(yīng)答,誘發(fā)炎癥反應(yīng)[18]。病毒性心肌炎病毒感染后NF-κB活性增強,研究發(fā)現(xiàn),NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)能夠抑制NF-κB活性,下調(diào)A型流感病毒感染導致的病毒性心肌炎小鼠心肌促炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β等表達,減輕心肌炎癥浸潤[19-23]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,丹參酮ⅡA低濃度組、丹參酮ⅡA高濃度組及陽性對照組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低,心肌組織TLR4、NF-κB表達水平也降低,且丹參酮ⅡA高濃度組和陽性對照組與模型組的差異最明顯(P<0.05),表明丹參酮ⅡA能夠有效降低病毒性心肌炎小鼠心肌TLR4/NF-κB信號通路活性,降低血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平,這可能是丹參酮ⅡA降低病毒性心肌炎小鼠炎癥反應(yīng)程度的作用機制之一。

綜上所述,丹參酮ⅡA能有效減輕病毒性心肌炎小鼠心肌損傷和炎癥反應(yīng),且呈現(xiàn)一定量效關(guān)系,其心肌保護作用可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路的活性、減少炎性細胞因子釋放有關(guān)。