趙麗娜,徐 明,侯 靜

缺血性心臟病為心內(nèi)科常見的心血管疾病,以心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷為主要臨床表現(xiàn)[1]。缺血后的再灌注會(huì)產(chǎn)生多種自由基和細(xì)胞因子等物質(zhì),導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和功能受損;同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞程序性死亡,導(dǎo)致有效心肌細(xì)胞數(shù)目減少,心肌損傷進(jìn)一步加重[2-3]。因此,減少心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡是治療心肌I/R損傷的關(guān)鍵所在。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)為一類長度超過200個(gè)核苷酸的新型非編碼RNA,其在多種細(xì)胞的增殖、分化和代謝中發(fā)揮重要作用[4]。HOXA轉(zhuǎn)錄本反義RNA 1(HOXA transcript antisense RNA,myeloid-specific 1,Hotairm1)是近年發(fā)現(xiàn)的新型lncRNA,研究顯示,在心肌細(xì)胞分化及I/R心肌中l(wèi)ncRNA Hotairm1顯著上調(diào),促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,加重心肌細(xì)胞I/R損傷,但lncRNA Hotairm1在缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡中的作用機(jī)制并未明確[5-6]。因此,本研究擬探討lncRNA Hotairm1對(duì)H/R心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡的影響,并結(jié)合微小RNA-129-5p(microRNA-129-5p,miR-129-5p)探究其作用機(jī)制,以期為lncRNA Hotairm1/miR-129-5p在防治缺血性心臟病I/R損傷中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞 H9c2購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 藥品與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司;青霉素/鏈霉素雙抗溶液、胰酶購自南京森貝伽生物科技有限公司;Trizol試劑、RIPA裂解液及二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司;空載體(pcDNA)、小干擾RNA對(duì)照(si-Con)、miRNA抑制物對(duì)照(anti-miR-Con)、miRNA模擬物對(duì)照(miR-Con)、miR-129-5p模擬物(miR-129-5p mimics)及l(fā)ncRNA Hotairm1小干擾RNA(si-lncRNA Hotairm1)、lncRNA Hotairm1過表達(dá)載體(pcDNA-lncRNA Hotairm1)、miR-129-5p抑制物(anti-miR-129-5p)購自廣州銳博生物有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)增殖及Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)及活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒購自江蘇凱基生物公司;兔源β-actin抗體、兔源活化的Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購自美國Abbiotec公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Fluor Chen FC2電泳凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司;Varioskan Flash酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司;ABI 7500熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀購自美國ABI公司;2406-2型CO2培養(yǎng)箱購自美國Shellab公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國 BD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)和H/R模型的構(gòu)建 將H9c2細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇,在100 U/L青鏈霉素及15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基及37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),3 d后更換培養(yǎng)液,當(dāng)H9c2細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí),使用胰酶消化并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[7]的方法建立H/R模型,將傳代后的細(xì)胞在缺氧的細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2+95%N2)中培養(yǎng)24 h,隨后更換為新鮮培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)6 h,隨后采用熒光定量PCR法檢測(cè)H/R模型組及空白組中l(wèi)ncRNA Hotairm1及miR-129-5p的表達(dá)水平。

1.2.2 H9c2細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 收集處于生長對(duì)數(shù)期的H9c2細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為(1～2)×104個(gè)/mL,隨后接種于96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。參考文獻(xiàn)[8],嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000試劑說明書操作,將si-Con、si-lncRNA Hotairm1、miR-Con、miR-129-5p轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞48 h,參考上述方法進(jìn)行H/R處理,隨后分為對(duì)照(無H/R處理)組、H/R組、空白轉(zhuǎn)染組、Hotairm1干擾組、miRNA模擬對(duì)照組、miR-129-5p模擬組。為證實(shí)lncRNA Hotairm1靶向作用于miR-129-5p影響H/R大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡,將si-lncRNA Hotairm1分別與anti-miR-129-5p、anti-miR-Con共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞,進(jìn)行H/R處理后,分為H/R+si-lncRNA Hotairm1+anti-miR-Con組與H/R+si-lncRNA Hotairm1+anti-miR-129-5p組。將上述各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3 熒光定量PCR法檢測(cè)H9c2細(xì)胞中l(wèi)ncRNA Hotairm1及miR-129-5p基因的表達(dá) 取上述各組生長狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞,參考文獻(xiàn)[9]的方法,Trizol試劑提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以制成的cDNA為模板,按照SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說明書對(duì)lncRNA Hotairm1及miR-129-5p進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列,①miR-129-5p正向引物:5′-CTTTTTGCGGTCTGGGCTTG-3′,反向引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;②Hotairm1正向引物:5′-GAACTGGCGAGAGGACGAAT-3′,反向引物:5′-GTGGGGACTATGGCTGGTTT-3′。PCR反應(yīng):95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算lncRNA Hotairm1及miR-129-5p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 MTT法檢測(cè)H9c2細(xì)胞存活率 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組H9c2細(xì)胞接種到96孔板,1×104個(gè)/孔,200 μL/孔,參考文獻(xiàn)[10]的方法,分別培養(yǎng)48 h,每孔加入20 μL的MTT溶液繼續(xù)避光孵育4 h,吸去上清,加入200 μL DMSO溶解,37 ℃孵育10 min。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長處的光密度(OD)值,并計(jì)算細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率=OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白組)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組H9c2細(xì)胞接種至96孔板,參考文獻(xiàn)[11]的方法,培養(yǎng)72 h后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,洗滌細(xì)胞,1 000×g離心后棄上清,放入流式管中,加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,隨后依次加入5 μL Annexin V-FITC染色10 min和5 μL PI染色5 min,1 h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.6 H9c2細(xì)胞中MDA含量、ROS水平以及LDH活性檢測(cè) 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組H9c2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后,參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行后續(xù)操作:①收集上清液,按照LDH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH活性;②丟棄細(xì)胞培養(yǎng)液后,依據(jù)ROS檢測(cè)試劑盒操作方法,采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度;③1 000×g離心后丟棄上清,加入提取液超聲破碎細(xì)胞,8 000×g離心后收集上清液,按照MDA試劑盒檢測(cè)上清液中MDA含量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用LncBase(www.Microrna.gr/LncBase)軟件預(yù)測(cè)出Hotairm1與miR-129-5p存在部分連續(xù)結(jié)合的核苷酸序列,采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證lncRNA Hotairm1與miR-129-5p的靶向結(jié)合關(guān)系。構(gòu)建含有miR-129-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(WT-lncRNA Hotairm1)及含有miR-129-5p結(jié)合位點(diǎn)突變序列的突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(MUT-lncRNA Hotairm1)。將WT-lncRNA Hotairm1、MUT-lncRNA Hotairm1分別與miR-Con、miR-129-5p共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞,在培養(yǎng)48 h后測(cè)定細(xì)胞熒光素酶的活性。為驗(yàn)證lncRNA Hotairm1對(duì)miR-129-5p的靶向調(diào)控作用,將pcDNA、pcDNA-lncRNA Hotairm1、si-Con、si-lncRNA Hotairm1分別轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞,48 h后裂解細(xì)胞,參考1.2.3的方法測(cè)定上述細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)凋亡關(guān)鍵蛋白Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的表達(dá) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組H9c2細(xì)胞,參考文獻(xiàn)[13]的方法,加入RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白,BCA法定量蛋白濃度和純度,將各組蛋白樣品濃度調(diào)整到同一水平,取50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),含5%脫脂牛奶的0.1% TBST室溫封閉2 h,分別添加β-actin(1∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1∶500)、Cleaved Caspase-9(1∶500)一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗滌加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育,以β-actin為內(nèi)參,以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光顯影,經(jīng)Leica QWin圖像分析軟件分析Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 H/R對(duì)心肌細(xì)胞lncRNA Hotairm1及miR-129-5p基因表達(dá)的影響 熒光定量PCR檢測(cè)顯示,當(dāng)正常H9c2細(xì)胞經(jīng)H/R處理后,H9c2細(xì)胞lncRNA Hotairm1的基因表達(dá)明顯增加,miR-129-5p的基因表達(dá)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明H/R的處理影響了心肌細(xì)胞lncRNA Hotairm1及miR-129-5p的表達(dá)。詳見表1。

表1 H/R對(duì)心肌細(xì)胞lncRNA Hotairm1及miR-129-5p表達(dá)的影響(±s)

2.2 沉默lncRNA Hotairm1對(duì)H/R心肌細(xì)胞存活和凋亡的影響 與對(duì)照組比較,H/R模型組細(xì)胞的lncRNA Hotairm1的基因表達(dá)量、凋亡蛋白Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率明顯增加,細(xì)胞存活率明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與空白轉(zhuǎn)染組比較,Hotairm1干擾組的lncRNA Hotairm1的基因表達(dá)量、凋亡蛋白Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率明顯降低,細(xì)胞存活率明顯增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。表明沉默lncRNA Hotairm1能夠抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞存活率。詳見表2。

表2 沉默lncRNA Hotairm1對(duì)H/R心肌細(xì)胞存活和凋亡的影響(±s)

2.3 沉默lncRNA Hotairm1對(duì)H/R心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響 與對(duì)照組比較,H/R模型組細(xì)胞中MDA含量和ROS水平明顯升高,細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與空白轉(zhuǎn)染組比較,Hotairm1干擾組MDA含量和ROS水平明顯降低,細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯減小,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。表明沉默lncRNA Hotairm1能夠抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,減少心肌細(xì)胞凋亡。詳見表3。

表3 沉默lncRNA Hotairm1對(duì)H/R心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響(±s)

2.4 lncRNA Hotairm1靶向miR-129-5p調(diào)控其表達(dá) LncBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-129-5p和lncRNA Hotairm1之間存在部分連續(xù)結(jié)合的核苷酸序列(見圖1)。在H9c2心肌細(xì)胞中進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,上調(diào)miR-129-5p表達(dá)可降低轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-lncRNA Hotairm1熒光素酶相對(duì)活性(P<0.05),但對(duì)MUT-lncRNA Hotairm1熒光素酶相對(duì)活性無明顯影響(P>0.05),詳見表4。與pcDNA組比較,pcDNA-lncRNA Hotairm1組細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與si-Con組比較,si-lncRNA Hotairm1組細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見表5。表明lncRNA Hotairm1靶向miR-129-5p并負(fù)調(diào)控miR-129-5p表達(dá)。

圖1 lncRNA Hotairm1靶向miR-129-5p結(jié)合位點(diǎn)示意圖

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s)

表5 lncRNA Hotairm1靶向調(diào)控miR-129-5p表達(dá)(±s)

2.5 過表達(dá)miR-129-5p對(duì)H/R心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡的影響 與miRNA模擬對(duì)照組比較,miR-129-5p模擬組H9c2細(xì)胞miR-129-5p的表達(dá)量明顯增加,細(xì)胞存活率明顯提高,細(xì)胞凋亡率、MDA含量、ROS水平、LDH活性明顯降低,凋亡蛋白Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的表達(dá)量明顯減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。表明過表達(dá)miR-129-5p能夠抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,減少心肌細(xì)胞凋亡。詳見表6。

表6 過表達(dá)miR-129-5p對(duì)H/R心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡的影響(±s)

2.6 抑制miR-129-5p對(duì)沉默lncRNA Hotairm1后H/R心肌細(xì)胞存活、凋亡及氧化應(yīng)激損傷的影響 與H/R+si-lncRNA Hotairm1+anti-miR-Con組比較,H/R+si-lncRNA Hotairm1+anti-miR-129-5p組H9c2細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)量、細(xì)胞存活率明顯降低,細(xì)胞凋亡率、MDA含量、ROS水平明顯增加、LDH活性明顯升高,凋亡蛋白Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的表達(dá)量明顯增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。表明抑制miR-129-5p表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA Hotairm1對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。詳見表7。

表7 抑制miR-129-5p對(duì)沉默lncRNA Hotairm1后H/R心肌細(xì)胞存活、凋亡及氧化應(yīng)激損傷的影響(±s)

3 討 論

LncRNA參與多種細(xì)胞的血管生成,涉及細(xì)胞增殖和凋亡過程等[14]。研究顯示,lncRNA Hotairm1與心肌梗死相關(guān),在急性心肌梗死病人血清中Hotairm1表達(dá)明顯升高[6,15]。在本研究中,在經(jīng)H/R處理后的H9c2細(xì)胞lncRNA Hotairm1的表達(dá)量增加,細(xì)胞存活率降低,凋亡率明顯增加,在沉默lncRNA Hotairm1后,心肌細(xì)胞存活率增加,凋亡率明顯下降。Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9作為參與細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶,在沉默lncRNA Hotairm1后,兩者的表達(dá)量均明顯下降。以上均說明在H/R過程中l(wèi)ncRNA Hotairm1參與了心肌細(xì)胞的增殖凋亡活動(dòng)。

心肌細(xì)胞的H/R會(huì)產(chǎn)生并積累大量的活性ROS,誘導(dǎo)膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生,致使心肌細(xì)胞受損凋亡,在此過程中會(huì)伴隨LDH的釋放,因此,LDH可作為心肌受損的標(biāo)志性指標(biāo)[16-17]。本研究結(jié)果顯示,H/R后H9c2細(xì)胞中MDA含量和ROS水平明顯升高,LDH活性明顯增加,但在沉默lncRNA Hotairm1后上述指標(biāo)均出現(xiàn)逆轉(zhuǎn),表明沉默lncRNA Hotairm1通過抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷減少了心肌細(xì)胞凋亡。

miR-129作為微小RNA家族的一員,在炎癥反應(yīng)、心血管再生和神經(jīng)發(fā)育等方面具有調(diào)控作用[18]。miR-129-5p為miR-129的主要功能型成熟產(chǎn)物,可通過調(diào)節(jié)血清骨橋蛋白水平,誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-17的聚集,參與急性冠脈綜合征的進(jìn)程,提示心肌細(xì)胞H/R過程可能伴隨著miR-129-5p的變化[19-20]。在本研究中,miR-129-5p在H/R心肌細(xì)胞中表達(dá)均下調(diào),在過表達(dá)miR-129-5p后,心肌細(xì)胞存活率明顯提高,凋亡率和凋亡蛋白Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的表達(dá)量均明顯減少,并且MDA、ROS水平及LDH活性均明顯降低,表明miR-129-5p可抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡。

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),在H9c2細(xì)胞中l(wèi)ncRNA Hotairm1靶向負(fù)調(diào)控miR-129-5p的表達(dá),進(jìn)一步揭示了lncRNA Hotairm1在心肌細(xì)胞I/R損傷中的具體機(jī)制。在本研究中,與單獨(dú)抑制lncRNA Hotairm1的H9c2細(xì)胞相比,同時(shí)抑制lncRNA Hotairm1和miR-129-5p的H9c2細(xì)胞的存活率明顯降低,凋亡率和凋亡蛋白Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的表達(dá)量均明顯增加,并且MDA、ROS水平及LDH活性均明顯升高,表明抑制miR-129-5p的表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA Hotairm1對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,提示沉默lncRNA Hotairm1通過上調(diào)miR-129-5p表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞損傷和凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述,H/R可誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞lncRNA Hotairm1的表達(dá),抑制miR-129-5p的表達(dá)。沉默lncRNA Hotairm1通過靶向miR-129-5p可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡。因此,lncRNA Hotairm1/miR-129-5p分子軸有望成為治療心肌I/R損傷的新靶點(diǎn)。