邱明憲

(河北省衡水市第四人民醫(yī)院骨科,河北 衡水 053000)

骨肉瘤是一種常發(fā)于兒童或青少年的惡性腫瘤之一［1］,近年來(lái)雖然對(duì)骨肉瘤的治療方法已有一定改進(jìn),但現(xiàn)階段骨肉瘤的治療效果和預(yù)后仍不夠理想［2］,其具體發(fā)病分子機(jī)制也未得到充分的探討。因此尋找新的特異性靶向因子顯得尤為重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種長(zhǎng)度>200的內(nèi)源性非編碼RNA［3］,已證實(shí)lncRNAs參與調(diào)控多種生物學(xué)進(jìn)程［4］,且可能在惡性癌癥早篩以及治療中具有巨大潛能［5］。如?；撬嵘险{(diào)基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)在骨肉瘤組織中的表達(dá)升高,過(guò)表達(dá)/敲除TUG1分別增加/減少骨肉瘤細(xì)胞的活力、遷移以及侵襲［6］;另外一項(xiàng)研究顯示lncRNA CBR3-AS1在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中高表達(dá),并與Enneking分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級(jí)相關(guān)［7］。LncRNA-ATB是一種主要由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)激活的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,多項(xiàng)報(bào)道［8-9］顯示其參與了人類(lèi)疾病的特定生理和病理過(guò)程,可作為癌基因在多項(xiàng)惡性腫瘤中異常高表達(dá),有作為癌癥的生物標(biāo)志物潛力,Huang等［10］研究顯示LncRNA-ATB在喉癌組織樣本中異常高表達(dá),與T分級(jí)和臨床分期有關(guān),并且lncRNA-ATB高表達(dá)患者的總生存率明顯低于低表達(dá)組;Tang等［11］研究顯示在膠質(zhì)瘤中,lncRNA-ATB可通過(guò)核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和P38/MAPK通路促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。然而迄今為止lncRNA-ATB在骨肉瘤中的工作機(jī)制暫未闡明,本研究旨在通過(guò)體內(nèi)、體外兩方面深入探究lncRNA-ATB在骨肉瘤中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 研究中所有組織樣本取自2020年1月—2021年1月衡水市第四人民醫(yī)院經(jīng)病理確診的28例患者手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本,其中男性19例、女性9例,平均年齡(17±5)歲,病理分析采用第8版骨肉瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn),其中早期(Ⅰ～Ⅱ)20例,晚期(Ⅲ)8例。病例納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理組織學(xué)確診為骨肉瘤;②術(shù)前未接受化療、放療、分子靶向治療及生物治療;③患者未有感染性或系統(tǒng)性重大疾病者。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［(2020)倫審第(53)號(hào)］,并已取得了患者的知情同意。

1.2主要試劑 人骨肉瘤細(xì)胞HOS、Saos-2和U2OS細(xì)胞株及正常人成骨細(xì)胞株NHOst購(gòu)自美國(guó)ATCC,DMEM培養(yǎng)基;lncRNA-ATB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及其陰性對(duì)照、lncRNA-ATB表達(dá)抑制質(zhì)粒以及其陰性對(duì)照質(zhì)粒、實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantity polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒、TRIzol試劑盒均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,Transwell小室購(gòu)自美國(guó)密理博公司,一抗與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自Abcam公司。Tunel凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人骨肉瘤細(xì)胞HOS、Saos-2和U2OS細(xì)胞株及正常人成骨細(xì)胞株NHOst使用含10%胎牛血清,100 mg/L青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640做為細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)條件為37 ℃含95%空氣和5% CO2。轉(zhuǎn)染前24 h將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Saos-2細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于6孔板,按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000 試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將Saos-2細(xì)胞分為ATB組、NC組、siATB組以及siNC組,分別轉(zhuǎn)染ATB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及其陰性對(duì)照;ATB表達(dá)抑制質(zhì)粒以及其陰性對(duì)照質(zhì)粒。

1.3.2qRT-PCR檢測(cè)骨肉瘤組織和細(xì)胞株lncRNA-ATB表達(dá) 使用Trizol從細(xì)胞系或組織中提取總RNA,紫外分光光度法測(cè)定RNA的含量,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA合成cDNA,按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng),qRT-PCR結(jié)果以2-△△CT值形式得到,每個(gè)樣本重復(fù)3次。引物序列如下:lncRNA ATB-F:5′-CTTCACCAGCACCCA-GAGA-3′,lncRNA ATB-R:5′-AAGACAGAAAA-ACAGTTCCGAGTC-3′;GAPDH-F:5′-GGTGAA-GGTCGGAGTCAACG-3′,GAPDH-R:5′-CAAA-GTTGTCATGGATGHACC-3′。

1.3.3CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Saos-2細(xì)胞增殖能力 Saos-2細(xì)胞按接種于96孔板,每孔200 μL細(xì)胞懸液,使用CCK-8試劑盒,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(optical density,OD)值。

1.3.4流式細(xì)胞法檢測(cè)Saos-2細(xì)胞細(xì)胞周期 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Saos-2細(xì)胞收集于5 mL離心管中,用0.01%胰蛋白酶消化30 min。用普通離心機(jī)100×g離心5 min后棄上清,再用預(yù)冷的PBS洗滌1次,100×g離心5 min后棄上清,收集細(xì)胞于同一5 mL流式離心管中,然后用4 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞1 h。去除乙醇后用PBS洗滌1次,用細(xì)胞染色液重懸細(xì)胞,并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.3.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Saos-2細(xì)胞遷移能力 骨肉瘤Saos-2細(xì)胞接種用Matrigel凝膠包被的上腔進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn),將不含血清的培養(yǎng)基和含10%FBS的培養(yǎng)基分別添加到上孔和下孔中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后,小心地去除非侵襲性細(xì)胞。濾光片用90%乙醇固定,結(jié)晶紫染色。用倒置顯微鏡觀察下層細(xì)胞,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6Tunel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Saos-2細(xì)胞凋亡 Saos-2細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30～60 min,用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TUNEL染色,并根據(jù)制造商的指示用DAPI染色10 min,熒光顯微鏡下觀察Tunel陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3.7免疫組織化學(xué)檢測(cè)骨肉瘤腫瘤組織lncRNA-ATB表達(dá) 骨肉瘤腫瘤組織用4%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片厚3 μm。石蠟切片梯度脫蠟、水化后,加入3%H2O2溶液室溫孵育15 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。將切片置于檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中,進(jìn)行抗原修復(fù)。加入5%的正常羊血清封閉15 min。隨后加入1∶100比例稀釋的Ki67抗體。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔二抗(1∶200),37 ℃孵育30 min。采用3,3-二氨基聯(lián)苯胺顯色后,蘇木精室溫復(fù)染2 min,而后進(jìn)行脫水和中性樹(shù)脂封片,采用正置顯微鏡觀察切片。

1.3.8構(gòu)建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型檢測(cè)lncRNA-ATB對(duì)體內(nèi)增殖和腫瘤生長(zhǎng)情況 選取BALB/c裸鼠32只,5～9周,體重14～21 g,所有裸鼠隨機(jī)分為ATB組,siATB組及各自對(duì)照組,每組8只。Saos-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,每只裸鼠接種細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/只。21 d將裸鼠置于無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)。裸鼠接種細(xì)胞21 d后腹腔注射水合氯醛麻醉(0.01 mL/g)并引頸脫臼處死裸鼠,從皮下去除其腫瘤組織并稱(chēng)重,測(cè)量體積及甲醛固定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1骨肉瘤組織和細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA-ATB的表達(dá)水平 采用GeneCards生信軟件(https://www.genecards.org/),找到lncRNA-ATB在染色體上的位置,qRT-PCR結(jié)果顯示,28例患者組織中,骨肉瘤組織中的lncRNA-ATB表達(dá)水平(2.31±0.37)高于癌旁正常組織(1.00±0.09),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.427,P<0.001),見(jiàn)圖1。與NHOst組相比,lncRNA-ATB在HOS,Saos-2和U2OS中均升高,其中Saos-2中表達(dá)最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。因此選擇Saos-2細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 骨肉瘤細(xì)胞株中ATB相對(duì)表達(dá)Table 1 Relative expression of ATB in osteosarcoma cell lines

組別ATB相對(duì)表達(dá)NHOst組1.00±0.09HOS組2.24±0.18*U2OS組3.11±0.28*Saos-2組3.47±0.32*#△ F值39.634 P值<0.001

*P值<0.05與NHOst組比較 #P值<0.05與HOS組比較 △P值<0.05與U2OS組比較(SNK-q檢驗(yàn))

圖1 lncRNA-ATB在染色體上的位置

2.2lncRNA-ATB對(duì) Saos-2細(xì)胞增殖、周期、遷移和凋亡的調(diào)控作用 ATB組Saos-2細(xì)胞的OD值高于NC組,ATB組Saos-2周期S期長(zhǎng)于NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siATB組Saos-2細(xì)胞OD值低于siNC組;siATB組Saos-2周期S期短于siNC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2,3。ATB組能抑制Saos-2細(xì)胞凋亡率,而siATB組后則相反增加Saos-2細(xì)胞的凋亡率,ATB組的細(xì)胞穿孔數(shù)多于NC組,siATB組少于siNC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。

表2 NC組和ATB組Saos-2細(xì)胞增殖與周期的比較Table 2 Comparison of the proliferation and cycle of Saos-2 cells between NC group and ATB group

表2 NC組和ATB組Saos-2細(xì)胞增殖與周期的比較Table 2 Comparison of the proliferation and cycle of Saos-2 cells between NC group and ATB group

組別OD值S期細(xì)胞比例(%)NC組 1.41±0.1212.37±1.25ATB組2.61±0.1817.14±1.67t值13.5874.427P值<0.0010.010

表3 siNC組和siATB組Saos-2細(xì)胞增殖與周期的比較Table 2 Comparison of Saos-2 cell proliferation and cell cycle between the SINC group and the SIATB group

表3 siNC組和siATB組Saos-2細(xì)胞增殖與周期的比較Table 2 Comparison of Saos-2 cell proliferation and cell cycle between the SINC group and the SIATB group

組別OD值S期細(xì)胞比例(%)siNC組 1.52±0.1413.85±1.31siATB組0.49±0.054.02±0.27t值16.97118.002P值<0.001<0.001

圖2 lncRNA-ATB對(duì) Saos-2細(xì)胞增殖,周期,遷移和凋亡的調(diào)控作用

2.3構(gòu)建骨肉瘤裸鼠模型檢測(cè)lncRNA-ATB對(duì)體內(nèi)腫瘤增殖和腫瘤生長(zhǎng)情況 利用Saos-2細(xì)胞構(gòu)建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型,21 d后剝離瘤體稱(chēng)重,結(jié)果顯示,ATB組(1.09±0.08)皮下腫瘤重量重于NC組(0.58±0.03),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.339,P<0.001),siATB組(0.36±0.03)皮下腫瘤重量輕于siNC組(0.71±0.06),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.037,P<0.001)。選取組織進(jìn)行切片,Ki67實(shí)驗(yàn)檢測(cè)皮,結(jié)果顯示ATB組下骨肉瘤細(xì)胞核中陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比多于NC組,siATB組下骨肉瘤細(xì)胞核中陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比少于siNC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3 。

圖3 構(gòu)建骨肉瘤裸鼠模型檢測(cè)增殖和腫瘤生長(zhǎng)情況

3 討 論

LncRNA作為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),越來(lái)越多的證據(jù)［12-13］表明其可用來(lái)評(píng)估骨肉瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。LncRNA-ATB 是近年來(lái)顯示的由TGF-β表達(dá)激活的一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA,已被證明可用于多種人類(lèi)癌癥的預(yù)后標(biāo)志物。TGF-β是促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展的重要細(xì)胞因子,有研究顯示通過(guò)抑制TGF-β1表達(dá),進(jìn)而對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲產(chǎn)生抑制作用,因而lncRNA-ATB也可能是骨肉瘤相關(guān)的重要lncRNA。但目前關(guān)于lncRNA-ATB在骨肉瘤中作用機(jī)制的研究甚少?，F(xiàn)有研究已顯示lncRNA-ATB在包括肝細(xì)胞癌、肺癌、卵巢癌在內(nèi)的多種癌癥中表達(dá)異常,Yuan等［14］學(xué)者研究顯示,lncRNA-ATB在卵巢癌中異常高表達(dá),沉默LncRNA-ATB可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;Li等［15］研究顯示lncRNA-ATB在肺癌組織中表達(dá)上調(diào),并與腫瘤大小和轉(zhuǎn)移相關(guān),另外一項(xiàng)研究［16］提示在乳腺癌中,lncRNA-ATB 表達(dá)同樣異常升高,敲低lnc-ATB顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等。本研究顯示,lncRNA-ATB在骨肉瘤組織以及HOS、Saos-2和U2OS細(xì)胞系中都呈現(xiàn)不同程度高表達(dá),提示lncRNA-ATB的異常表達(dá)可能與骨肉瘤密切相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA-ATB在骨肉瘤中的調(diào)控機(jī)制,構(gòu)建骨肉瘤裸鼠模型,通過(guò)體內(nèi)驗(yàn)證lncRNA-ATB對(duì)骨肉瘤腫瘤生長(zhǎng)的影響,顯示過(guò)表達(dá)lncRNA-ATB促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和體內(nèi)細(xì)胞增殖,而抑制lncRNA-ATB則能產(chǎn)生抗腫瘤生長(zhǎng)和抑制增殖的效應(yīng)。通過(guò)造模體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,更加確信lncRNA-ATB參與了骨肉瘤的病理進(jìn)程,與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

骨肉瘤是最具侵襲性的惡性腫瘤之一,具有較高的發(fā)病率和較低的治愈率,因此細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究lncRNA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)功能顯得至關(guān)重要。近年來(lái),研究［17］表明lncRNAs可促進(jìn)/抑制腫瘤細(xì)胞增殖等生物學(xué)行為進(jìn)而在癌癥中發(fā)揮重要作用,在骨肉瘤相關(guān)報(bào)道［18］中,通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)lncRNA-TUSC7抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,同時(shí)促進(jìn)體外細(xì)胞凋亡;Han等［19］研究顯示在骨肉瘤中,lncRNA-BCRT1表達(dá)增高可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞周期;Chen等［20］顯示LOC100129620能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移。本研究顯示lncRNA-ATB在HOS、Saos-2和U2OS多種骨肉瘤細(xì)胞系中均顯著升高,其中Saos-2中表達(dá)最高,因此選擇Saos-2細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),探究lncRNA-ATB在骨肉瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的影響。結(jié)果顯示,lncRNA-ATB可以促進(jìn)Saos-2細(xì)胞增殖,周期S期的聚集,增加細(xì)胞遷移率及抑制細(xì)胞凋亡,而采用RNA干擾技術(shù)后顯示,干擾lncRNA-ATB可以產(chǎn)生抑制增殖、周期、遷移及促進(jìn)凋亡的效果。

綜上所述,本研究充分地闡述了干擾lncRNA-ATB表達(dá)可以抑制人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖、周期、遷移及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并且抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng),但本研究也具有一定的局限性,基于lncRNA作用機(jī)制,在后續(xù)的相關(guān)研究中,將深入探究lncRNA-ATB做為ceRNA調(diào)控下游miRNA在骨肉瘤中的作用機(jī)制,為對(duì)抗骨肉瘤的調(diào)控機(jī)制作出全新的詮釋,為抗骨肉瘤早篩及治療提供新的潛在靶點(diǎn)。