黃東晨，任曉亮，馬小民，黃 鋮，王 飛，蒲哨峰，傅松玲

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036；2. 舒城縣棠樹鄉(xiāng)林業(yè)站，安徽 六安 231300；3. 安徽徽寶農(nóng)林科技有限公司，安徽 六安 231300）

榧樹Torreya grandis為中國特有樹種，雌雄異株，稀同株，壽命長，抗性強(qiáng)，樹形及材性好，在安徽省皖南山區(qū)與大別山區(qū)天然分布較多，種質(zhì)資源豐富[1-3]。目前人工栽培果用的主要為榧樹的雌性優(yōu)良品種香榧Torreya grandis‘Merrillii’[4]，其在授粉期間需要大量的優(yōu)質(zhì)榧樹花粉。榧樹授粉期一般在4—5月，皖南和大別山區(qū)雨水較多，且香榧的開花時間不等，花期不遇和花粉遇水失活現(xiàn)象較為嚴(yán)重[5-6]。目前國內(nèi)對榧樹的研究多集中在表型資源[7]、基因遺傳[8]等方面，忽視了對榧樹花粉的篩選、保存貯藏方面的研究?；ǚ奂仁巧镉行У男畔鬟f，也是植物代代相傳的延續(xù)手段[9]，花粉活力的強(qiáng)弱篩選、保存貯藏對于植物尤其是類似榧樹這種雌雄異株植物的花期不遇、雜交育種、人工授粉等起到關(guān)鍵性作用[10-11]。前人研究證實不同的榧樹花粉對香榧的榧籽、榧核的形態(tài)特征存在花粉直感現(xiàn)象[12]；張輝[13]通過香榧控制授粉雜交種子理化性質(zhì)的分析證實父本榧樹、母本香榧及其交互作用對香榧種子均有顯著影響，有必要開展父本榧樹選育。那么不同表型榧樹的花粉活力檢測、短期貯藏是否存在一定的異同點？基于此，本研究利用TTC 染色法并通過隸屬函數(shù)法綜合評價得出榧樹花粉通用適宜的花粉活力檢測條件，并分析不同榧樹花粉活力隨干燥方式、溫度和貯藏時間的貯藏變化規(guī)律，為榧樹花粉的篩選、活力快速檢測、貯藏及開展人工雜交授粉、雄榧優(yōu)良單株選育等研究提供理論參考。

1 研究區(qū)概況

榧樹花粉來源于安徽省六安市舒城縣安徽徽寶農(nóng)林科技有限公司的山七鎮(zhèn)三石村（31°10′N，116°40′E）香榧扶貧基地。試驗林位于北亞熱帶濕潤氣候區(qū)，年平均氣溫16.3 ℃，極端最低溫度-12 ℃，年平均降水量780 mm，無霜期可達(dá)272 d。土壤為黃壤、黃紅壤，pH 值為5.8 ～6.5，呈微酸性。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2021年4月，采集6 株不同表型的榧樹（依據(jù)散粉期和球花大小來劃分）花粉，分別記作YC1（中早期花常規(guī)型，4.5 cm ＜花蕾橫徑＜5.5 cm）、YD2（晚期花大型，花蕾橫徑＞5.5 cm）、YX3（早期花小型，花蕾橫徑＜4.5 cm）、YD4（中晚期花大型，花蕾橫徑＞5.5 cm）、YX5（中期花小型，花蕾橫徑＜4.5 cm）、YC6（中期花常規(guī)型，4.5 cm ＜花蕾橫徑＜5.5 cm）。2022年由于疫情及過度修剪，僅采集到Y(jié)D2、YX3、YC6 這3 種榧樹的花粉。

2.2 研究方法

2.2.1 適宜花粉活力檢測方法的篩選

花粉活力檢測采用常規(guī)TTC 染色法[14]測定。2021年采用TTC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、溫度（B）、pH值（C）三因素完全區(qū)組實驗設(shè)計，研究6 個不同表型榧樹花粉活力快速檢測的適宜方法。其中TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)3個水平，分別為A1（0.2%）、A2（0.5%）、A3（0.8%）；溫度設(shè)置3個水平，分別記作B1（25 ℃）、B2（28 ℃）、B3（30 ℃）；pH 值設(shè)置C1（pH 值6.0）、C2（pH 值6.5）、C3（pH 值7.0）、C4（pH 值7.5）、C5（pH 值8.0）5 個水平；共計45 個試驗處理。每處理重復(fù)2 次，觀察時每重復(fù)制片選取3 個視野，每視野花粉總數(shù)＞100 個?；ǚ叟囵B(yǎng)6 h 后，將載玻片從培養(yǎng)箱中取出，在光學(xué)顯微鏡（Primo Star，ZEISS）低倍鏡(10×10 倍)下觀察染色花粉。其中有活力的花粉為染成紅色的花粉，淡紅色為活力較弱，無色的花粉則為無活力花粉。

花粉活力=（視野內(nèi)染色花粉數(shù)/視野內(nèi)花粉總數(shù)）×100%。

2.2.2 短期貯藏與干燥方式

2022年采集新鮮的花粉，選擇室內(nèi)陰干干燥（W1）、烘箱28 ℃干燥（W2）和硅膠常溫干燥（W3）3 種不同的干燥方式對其進(jìn)行干燥24 h，同時以新鮮花粉作為對照處理。檢測干燥后的花粉活力，每個處理進(jìn)行4 次重復(fù)，每重復(fù)制片選取3 個視野。

花粉短期貯藏活力仍用TTC 染色法檢驗，由于新鮮花粉在自然條件下7 d 內(nèi)花粉失活現(xiàn)象嚴(yán)重，故試驗過程中僅比較不同干燥方式條件（W1、W2、W3）下的花粉短期貯藏活力。干燥后裝入離心管中，用醫(yī)用注射器抽真空，將不同榧樹的花粉分別置于室溫28、4、0、-18 ℃進(jìn)行貯藏，每隔7 d 檢測一次花粉活力，每處理重復(fù)3 次，每重復(fù)制片選取2 個視野。

2.3 數(shù)據(jù)處理

運用ImageJ 軟件進(jìn)行花粉統(tǒng)計計數(shù)，用Microsoft Office Excel 2016 軟件錄入數(shù)據(jù)， 用SPSS 23.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）、三因素方差分析和多重比較（LSD 法，P＜0.05）；采用隸屬函數(shù)法[15]對不同因素處理組不同表現(xiàn)型榧樹花粉活力進(jìn)行綜合評價。采用SigmaPlot 14.0 軟件作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 花粉活力檢測

3.1.1 不同TTC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溫度、pH 值對花粉活力檢測效果的影響

不同表型的榧樹花粉隨染色條件的不同而呈現(xiàn)不同的染色結(jié)果（圖1）。所有表型單株的花粉活力表現(xiàn)在0.8%TTC 下花粉活力與0.2%、0.5%TTC 下花粉活力差異顯著（圖1）。表型YX3、YC6 花粉在TTC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時平均花粉活力達(dá)到最高，分別為（67.45±2.67）%和（85.00±0.58）%。在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，TTC 染料更易沉積在花粉中，相比較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)染色效果較差，更易造成視覺誤差。在3 個溫度條件下，YC1、YX5、YC6 的花粉活力值接近，未達(dá)到差異顯著水平（圖1）。YD2、YX3 與YD4 在28 ℃時平均花粉活力達(dá)到最高，染色表現(xiàn)較好。在偏酸性環(huán)境（pH 值6.0、6.5）下，單株的花粉活力最低，染色效果較差（圖1）。而在中性環(huán)境（pH值7.0）下和偏堿性環(huán)境（pH 值7.5、8.0）下，除YD2、YX3 在中性環(huán)境染色效果不明顯外，各單株平均花粉活力均大于70%，染色效果較偏酸性明顯。

圖1 不同處理對不同榧樹花粉活力的影響Fig. 1 Effects of different TTC concentrations on the pollen viability of Torreya grandis

3.1.2 最適花粉活力染色組合的篩選

TTC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH 值、溫度以及交互作用對花粉活力檢測均有差異顯著影響（表1）。采用隸屬函數(shù)法進(jìn)行最適花粉活力染色組合的篩選，對各單株的45 個處理的平均隸屬函數(shù)值按照從大到小的順序進(jìn)行排序，結(jié)果見表2。表2 表明，各單株隸屬函數(shù)排名前10 組的處理組合各不相同，其中不同的TTC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)中A2水平出現(xiàn)了26 次，占總組合的43.33%；不同的溫度處理中B2和B3水平均占35.00%，其次是B1水平，占30.00%；不同的pH 值中C5水平占據(jù)了25.00%，其次是C2和C4，分別占總組合的23.33%和20.00%。統(tǒng)計所有的因素組合發(fā)現(xiàn)A2B2C5、A3B1C5、A2B3C1這3個組合在各單株隸屬函數(shù)排名前10的占比最高，為6.67%，結(jié)合前面各水平出現(xiàn)的頻率和呈現(xiàn)的花粉染色效果、花粉活力情況，綜合得出A2B2C5為最適花粉活力染色組合，且更適用于較早期或較晚期散粉類型。

表2 不同因素組合對不同榧樹單株的隸屬函數(shù)評價?Table 2 Membership function evaluation of different combinations of factors on different Torreya grandis individuals

3.2 花粉短期貯藏

3.2.1 不同干燥方式對花粉活力的影響

干燥一定程度上能降低榧樹花粉的活力（圖2）。表型YX3 和YC6 榧樹在烘箱28 ℃干燥24 h條件下花粉活力達(dá)到最高，分別為（93.42±0.89）%、（90.48±0.67）%，與其他2 種干燥方式均達(dá)到差異顯著水平。表型YD2 單株則呈現(xiàn)出不同的趨勢，室內(nèi)陰干干燥（W1）24 h 條件下花粉活力最高，與烘箱28 ℃干燥（W2）、硅膠常溫干燥（W3）2種方式差異顯著，烘箱28 ℃干燥情況下花粉的活力比室內(nèi)陰干干燥花粉降低了16.50%，硅膠常溫干燥條件下比室內(nèi)陰干干燥花粉降低了36.93%。

圖2 不同干燥方式干燥后的單株花粉活力Fig. 2 The pollen viability of the single plant after drying by different drying methods

3.2.2 不同貯藏條件下榧樹花粉活力的變化趨勢

表3 表明，除干燥方式與時間的交互作用未達(dá)到差異顯著水平外，干燥方式、時間、溫度以及交互作用對不同表型榧樹的花粉活力影響均達(dá)到極顯著差異水平，綜合表明3 個因素對榧樹的花粉貯藏活力均有較大影響?；ǚ刍盍﹄S著貯藏天數(shù)的增加而不斷降低（圖3）。表型YD2 單株同其他兩株相比花粉活力整體偏低，在3 種干燥方式下，僅烘箱28 ℃干燥條件下貯藏21 d 以上花粉活力能保持在20%～30%范圍，且不同溫度間差異顯著（圖3B），室內(nèi)陰干干燥（W1）14 d 能維持在40%左右（圖3A），硅膠常溫干燥（W3）不利于短期貯藏（圖3C）。表型YX3 和YC6 單株在不同的干燥方式下隨著貯藏天數(shù)的增加其花粉活力降低趨勢明顯，室內(nèi)陰干干燥條件下常溫保存效果較差，-18 ℃貯藏35 d 花粉活力仍能保持35%以上（圖3D、G）；烘箱28 ℃干燥（W2）條件下常溫和4 ℃開始能維持較高水平，但在7 ～14 d 后花粉活力驟降為零，0 ℃與-18 ℃下花粉活力貯藏效果明顯，尤其是YC6 貯藏35 d 仍能維持40%以上（圖3E、H）；硅膠常溫干燥條件下YX3 在4 ℃下花粉活力貯藏35 d 內(nèi)效果較佳（圖3F），YC6 在室溫與0 ℃下花粉活力貯藏35 d 能維持25%以上（圖3I）。

表3 不同貯藏條件下榧樹花粉活力的方差分析Table 3 Analysis of variance of the pollen viability of Torreya grandis under different storage conditions

圖3 3 個榧樹花粉活力的變化趨勢Fig. 3 Trends in the pollen viability of three Torreya grandis

4 討 論

榧樹作為裸子植物，其花粉在離體萌發(fā)時速度緩慢，條件要求嚴(yán)格，通過預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)效果不顯著，36 h 內(nèi)無明顯萌發(fā)現(xiàn)象，故在研究時采用TTC 染色法。經(jīng)染色發(fā)現(xiàn)榧樹能夠呈現(xiàn)較好的染色效果，可能是由于榧樹個體花粉外壁厚度適宜和人工營造的環(huán)境便于染色劑進(jìn)入的緣故[16]。適宜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)能產(chǎn)生較好的染色效果，本研究發(fā)現(xiàn)不同榧樹在進(jìn)行快速檢測時以TTC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%染色效果較佳，這點同任文玲等[17]的研究結(jié)果一致。溫度是影響花粉活力的關(guān)鍵因素，適宜的溫度有利于花粉的交流與傳遞，有研究發(fā)現(xiàn)杏Prunus armeniaca花粉功能對環(huán)境條件高度敏感，花粉萌發(fā)等生殖性狀可能更適合與低溫共存，這也符合杏是早花型樹種的特性[18]。本研究中溫度在30 ℃時的榧樹花粉染色效果明顯不及28 ℃，可能是由于溫度較高時會影響榧樹花粉的酶活性，呼吸作用減弱，染色效果不明顯，也可能與榧樹的花期多在4月有關(guān)。不同植株花粉對于不同的pH 值環(huán)境適應(yīng)性不同，有研究表示pH值水平與杉木Cunnighamia lanceolata花粉的萌發(fā)和花粉管生長呈正相關(guān)關(guān)系[19]。任少華等[20]研究香榧花粉活體檢測認(rèn)為pH 值偏高，易在載玻片上出現(xiàn)染料沉積的現(xiàn)象進(jìn)而影響測試結(jié)果，可以選擇30 ℃、pH 值7.0 快速得出鑒定結(jié)果，與本研究結(jié)果不太一致，可能是由于不同的榧樹花粉活力的適宜測定方式不同，但綜合來看，0.5%TTC、28 ℃與pH 值8.0 為比較通用適宜的檢測方式，3 種因素及其交互作用對花粉活力的測定結(jié)果均具有顯著影響。榧樹在微堿性環(huán)境下染色效果較佳，沒有明顯的染料沉積，便于區(qū)分，對于晚期花粉更為明顯，可能是由于榧樹花粉本身和不同地理環(huán)境的差異[21]，或是由于與質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溫度相互影響的結(jié)果。

花粉干燥主要是對花粉含水量產(chǎn)生影響，通過減少含水量從而延長花粉的貯藏時間，花粉干燥后減緩了花粉的呼吸作用，減少營養(yǎng)消耗，避免花粉暴露在外界環(huán)境下脫水死亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)早、中期榧樹花粉在烘箱干燥28 ℃條件下仍能保持較高的花粉活力，而晚期類型YD2 在3 種干燥方式下干燥效果均不佳，這可能與以下幾個原因有關(guān)：晚期花粉散粉期間外界溫度已經(jīng)較高，影響植物本身的花粉活力，晚期發(fā)展的孢子與同花期早、中期發(fā)展的孢子相比，花粉質(zhì)量較差[23]；晚期花粉內(nèi)源激素同早、晚期花粉激素含量不同，所呈現(xiàn)出的調(diào)控結(jié)果不一致，從而間接導(dǎo)致花粉活力的降低[24]；或是植株花粉在運輸過程中造成一定的損失，影響花粉得率從而導(dǎo)致花粉活力下降[7]。本研究僅探究了3 種干燥條件下的花粉活力，對于干燥時間、含水量等導(dǎo)致花粉活力變化、貯藏效果的影響仍有待進(jìn)一步研究。

花粉貯藏對于植物花期不遇、種質(zhì)資源保存等具有重大意義，不同的干燥方式、貯藏溫度與貯藏時間能夠影響花粉的貯藏活力。本研究表明，干燥方式、貯藏溫度與貯藏時間以及交互作用對花粉貯藏活力存在顯著影響，不同貯藏條件下不同榧樹的花粉活力不同，可能是由于不同表型的榧樹花粉脫水后耐性不同，也可能與本身的個體差異有關(guān)[25-26]。早期類型YX3 和中期類型YC6 短期貯藏在烘箱28 ℃干燥24 h 后在0 ℃或-18 ℃貯藏7 ～14 d，超過30 d 采取室內(nèi)干燥24 h 后在-18 ℃貯藏，花粉活力能保持在35%以上，這是由于花粉在干燥后再進(jìn)行低溫貯藏，內(nèi)在的部分水分脫去，花粉的代謝生理與呼吸作用減緩，花粉活力降低的速度減緩[27]，這點類似于果實低溫貯藏的作用機(jī)理，延緩了內(nèi)源物質(zhì)的急速下降[28]。但隨著貯藏天數(shù)的增加，長期的低溫不能較好地保持酶活性，花粉活力會隨之降低[29]，也可能是花粉內(nèi)源碳水化合物含量的降低，造成滲透外壁的糖蛋白丟失[30]。硅膠干燥花粉貯藏效果同室內(nèi)干燥差異不顯著，隨著貯藏時間的增加，其貯藏效果越差，可能是硅膠干燥并不能滿足榧樹花粉貯藏時含水量的需求范圍，以致于后期花粉貯藏過程中的生理活動較強(qiáng)，貯藏活力下降。

5 結(jié) 論

榧樹的花粉活力宜采用0.5%TTC、25 ℃、pH值8.0 的方式進(jìn)行快速測定；早、中期散粉型花粉貯藏宜采取恒溫（28 ℃）干燥24 h 后在0 ℃或-18 ℃貯藏7 ～14 d；儲藏期超過30 d 需先室內(nèi)陰干干燥24 h后置于-18 ℃貯藏；晚熟花粉不宜貯藏，應(yīng)使用新鮮花粉。實際生產(chǎn)中應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)氐幕ㄆ谠缤磉M(jìn)行花粉貯藏方式的選擇，人工授粉時宜選擇相應(yīng)時間段活力較強(qiáng)的花粉，并且在一周內(nèi)完成，避免造成不必要的損失。本研究結(jié)果對于榧樹花粉的篩選、檢測、干燥及貯藏、優(yōu)株選擇有重大意義，但關(guān)于花粉表型、物候期與花粉活力的內(nèi)在聯(lián)系仍需后期進(jìn)行研究和探討。