王少敏，秦子為，段米芳，謝天晨，朱詠華，卓睿

(湖南大學(xué)生物學(xué)院植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410082)

農(nóng)藥是防治農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害和控制雜草的化學(xué)藥品，也是控制某些昆蟲(chóng)(如蚊、蠅等)的重要藥劑[1]。環(huán)丙氟蟲(chóng)胺(cyproflanilide)，分子式C28H17BrF12N2O2，是由南通泰禾化工股份有限公司以雙酰胺類殺蟲(chóng)劑為先導(dǎo)將環(huán)溴蟲(chóng)酰胺結(jié)構(gòu)中環(huán)甲基引入間二酰胺的骨架中合成的一種間二酰胺類殺蟲(chóng)劑[2]，于2019 年獲得中國(guó)專利授權(quán)(專利號(hào)ZL201811555432.3)，開(kāi)發(fā)代號(hào)CAC-I-785，CAS 登錄號(hào)為2375110-88-4，結(jié)構(gòu)式如圖1 所示[3]。該藥劑作用機(jī)制新穎、殺蟲(chóng)譜廣，對(duì)鱗翅目二化螟、稻縱卷葉螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、草地貪夜蛾、鞘翅目跳甲和部分薊馬防效優(yōu)異，尤其對(duì)水稻二化螟具有杰出的防效[3-4]。其用藥量低，對(duì)環(huán)境安全，但不當(dāng)使用該殺蟲(chóng)劑對(duì)生態(tài)系統(tǒng)具有潛在風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)于環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的微生物降解尚未有研究報(bào)道，因此本研究圍繞環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的微生物降解展開(kāi)探索。

圖1 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的合成路線

土壤中的細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類等都具有降解農(nóng)藥的功效[5]。放線菌(actinobacteria)是一類具有絲狀結(jié)構(gòu)、以孢子繁殖的革蘭氏陽(yáng)性菌，在自然界中分布廣泛，種類繁多，且孢子抗逆性強(qiáng)，多存在于土壤和根際中[6]。研究發(fā)現(xiàn)某些放線菌具有降解有機(jī)物的能力，如余臣磊等[7]從農(nóng)藥污染場(chǎng)地中分離得到一株對(duì)敵百蟲(chóng)具有降解特性的鏈霉菌屬的菌株Lin F-1，此外研究發(fā)現(xiàn)該菌株具有較強(qiáng)的廣譜降解特性，可降解有機(jī)磷和菊酯類農(nóng)藥、部分有機(jī)氯農(nóng)藥。細(xì)菌由于其基因突變性較強(qiáng)，容易誘導(dǎo)多種突變菌株從而有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此被廣泛運(yùn)用于農(nóng)藥降解[8]。研究顯示，細(xì)菌降解有機(jī)物表現(xiàn)優(yōu)異，如Demequina salsinemorusBJ1 和Pseudomonassp.strain GJY 分別對(duì)蒽和HBCD 降解率高達(dá)92.00%和85.38%[9-11]。真菌是一類具備較強(qiáng)環(huán)境應(yīng)用潛力的微生物資源，以白腐真菌為例，其具備強(qiáng)大的生物降解能力，可以分泌一系列木質(zhì)素分解酶和細(xì)胞內(nèi)酶，以進(jìn)行復(fù)雜木質(zhì)素大分子和異生素的降解和轉(zhuǎn)化[12]。由于白腐真菌特色降解酶系的底物廣譜性和環(huán)境友好性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)廢水[13-14]、多環(huán)芳烴[15]、農(nóng)藥抗生素[16]、有機(jī)污染物的降解修復(fù)領(lǐng)域。

本文以環(huán)丙氟蟲(chóng)胺為研究對(duì)象，首先探究了實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有放線菌、細(xì)菌和真菌對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解作用，然后通過(guò)平板分離技術(shù)，篩選環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的耐藥和降解菌。研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌株對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺有一定的降解效果，此外成功篩選出對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺有耐受以及降解能力的微生物菌株，最終證明環(huán)境微生物具備對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解能力。這將為環(huán)丙氟蟲(chóng)胺防治水稻等農(nóng)作物上的蟲(chóng)害以及水稻等農(nóng)作物的保產(chǎn)和增產(chǎn)提供保障，減少該類殺蟲(chóng)劑對(duì)環(huán)境的不良影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

2 種放線菌：Amycolatopsissp.MtRt-6(GenBank登錄號(hào)：GCA_017308975.1，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏號(hào)：CGMCC No. 23411)，以下簡(jiǎn)稱菌株為MtRt-6；Streptomycessp.CoT10(GenBank登錄號(hào)：JAIQYX000000000.1，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏號(hào)：CGMCC No.22968)，以下簡(jiǎn)稱菌株為CoT10。

2 種細(xì)菌：Sphingobacterium mizutaiiGEMB-CSS-01(GenBank 登錄號(hào)：MW832242.1)和Pseudomonas aeruginosaGEMB-CSS-02 (GenBank 登錄號(hào)：ON025930.1)，以下分別簡(jiǎn)稱菌株為CSS-01 和CSS-02。

1 種真菌：白腐真菌Pleurotus ostreatusGEMBPO1(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心編號(hào)：CCTCC NO M2023358)，以下簡(jiǎn)稱菌株為PO1。

1.2 試驗(yàn)材料

環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥(南通泰禾化工股份有限公司)。

環(huán)丙氟蟲(chóng)胺不易溶于培養(yǎng)基，因此試驗(yàn)所選用的以下培養(yǎng)基均加入1%吐溫80 助溶劑。

酵母麥芽提取物(ISP2)培養(yǎng)基：麥芽浸粉10 g，酵母浸膏4 g，葡萄糖14 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

LB 培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉18～20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

GYP 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母浸膏5 g，蛋白胨5 g，七水硫酸鎂1 g，五水硫酸銅0.002 g，去離子水1000mL，磷酸調(diào)pH5.0，115℃滅菌20min。

PDA 培養(yǎng)基：稱取200 g 馬鈴薯塊，加水煮沸20 min，紗布過(guò)濾，加入20 g 葡萄糖，使用去離子水補(bǔ)齊1 000 mL。分裝時(shí)，每100 mL 培養(yǎng)基內(nèi)加入1.5～2.0 g 瓊脂糖，121 ℃滅菌20 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 放線菌的培養(yǎng)

MtRt-6、CoT10 分別接種于ISP2 固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，收集成熟孢子制成孢子懸浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后稀釋至1.0×107CFU/mL 轉(zhuǎn)接至液體ISP2 培養(yǎng)基，置于搖床，30 ℃、170 r/min恒溫培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)菌CSS-01 和CSS-02 的培養(yǎng)

CSS-01 和CSS-02 菌株分別劃線于LB 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落再次于LB 固體培養(yǎng)基劃線活化，然后再接種至LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h 作為種子液。

1.3.3 白腐真菌PO1 的培養(yǎng)

平板種：使用無(wú)菌的接種環(huán)從4 ℃保存的種子管中挑取少量的白腐真菌菌絲于新鮮的PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)至菌絲生長(zhǎng)較快的時(shí)期(約5 d)，成為平板種。

液體種：用無(wú)菌的接種針將平板種上的菌絲和其依托的培養(yǎng)基切成小塊，取適量接種于液體的GYP 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)約7 d，成為一級(jí)液體種。用剪口無(wú)菌的槍頭從一級(jí)液體種中取1 mL 到新鮮的GYP 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)3～4 d，此時(shí)為二級(jí)液體種。

1.3.4 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解

原藥降解：將環(huán)丙氟蟲(chóng)胺(終濃度為20 mg/L)原藥添加至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期菌株的液體培養(yǎng)基中，以不接菌含20 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的空白培養(yǎng)基為對(duì)照組(即CK)，按照菌株正常生長(zhǎng)條件培養(yǎng)，定期取樣，利用高效液相色譜儀測(cè)定剩余環(huán)丙氟蟲(chóng)胺濃度。

高效液相色譜儀檢測(cè)條件：Shim-pack GIST C18柱，流動(dòng)相：甲醇∶0.1%磷酸水=75∶25(體積比)，流速：1/1.5 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm，柱溫：40℃。

環(huán)境微生物對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解率計(jì)算：環(huán)丙氟蟲(chóng)胺終濃度與環(huán)丙氟蟲(chóng)胺初始濃度差與環(huán)丙氟蟲(chóng)胺初始濃度比值。

1.3.5 農(nóng)田土壤中環(huán)丙氟蟲(chóng)胺耐受菌的分離及其降解特性

土壤樣品采集于湖南省水稻研究所(1 號(hào)地)(28°11′52″N，113°4′42″E)和湖南春華金鼎山社區(qū)(2 號(hào)地)(28°17′42″N，113°15′52″E)，用無(wú)菌取樣勺分別采集水稻所5 個(gè)土壤樣品和金鼎山社區(qū)6 個(gè)土壤樣品，放入無(wú)菌密封袋。

在無(wú)菌條件下將土壤樣品用無(wú)菌水制備成懸液作為分離微生物源，之后梯度稀釋涂布于含有不同濃度環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的LB 平板上，篩選并分離其中對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺有較高耐藥性的菌株。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的耐藥菌培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期轉(zhuǎn)接于含環(huán)丙氟蟲(chóng)胺濃度為20 mg/L 的液體培養(yǎng)基(含1%吐溫80)中，以不接菌含20 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的空白培養(yǎng)基(含1%吐溫80)為對(duì)照組，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)，于第2 天取樣，然后采用高效液相色譜儀測(cè)定培養(yǎng)基中環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的剩余濃度。

1.3.6 土壤微生物DNA 提取和鑒定

使用DNA 提取試劑盒(EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit，Transgen)對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行基因組DNA 提取，用引物27F (5′-agagtttgatcctggctcag-3′)和1492R(5′-tacggytaccttgttacgactt-3′)擴(kuò)增其16S rRNA基因后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)和EZBioCloud (www.ezbiocloud.net/)中16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 放線菌對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解

Amycolatopsissp.MtRt-6 是實(shí)驗(yàn)室前期從經(jīng)表面消毒后的多年生紫花苜蓿的根部分離得到的一株稀有放線菌，Streptomycessp.CoT10 是實(shí)驗(yàn)室前期從湘林系列油茶的根部分離得到的油茶內(nèi)生放線菌，MtRt-6 和CoT10 對(duì)20 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的降解情況如圖2 和表1 所示。處理2 d 后，MtRt-6 和CoT10 處理中環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的檢測(cè)濃度分別為1.29、1.46 mg/L，MtRt-6 和CoT10 對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解率分別為62.28%和57.18%?？梢?jiàn)，MtRt-6和CoT10 對(duì)20 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥具有較好的降解能力。

圖2 CK、MtRt-6、CoT10 的高效液相色譜圖

表1 MtRt-6、CoT10 對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的降解

2.2 細(xì)菌CSS-01 和CSS-02 對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解

Sphingobacterium mizutaiiGEMB-CSS-01 和Pseudomonas aeruginosaGEMB-CSS-02 是實(shí)驗(yàn)室前期從長(zhǎng)沙市桃子湖底泥樣品中篩選到的能夠在含磺胺培養(yǎng)基和含雙酚A 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，CSS-01和CSS-02 對(duì)20 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的降解情況如圖3 和表2 所示。

圖3 CK、CSS-01、CSS-02 的高效液相色譜圖

表2 CSS-01 和CSS-02 對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的降解

CSS-02 對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺有明顯的降解效果，但CSS-01 未顯示出對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解效果。處理2 d 后，CSS-01 和CSS-02 處理中的環(huán)丙氟蟲(chóng)胺檢測(cè)濃度分別為5.14、1.59 mg/L，CSS-02 對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解率為69.70%?？梢?jiàn)，CSS-02 對(duì)20 mg/L環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥有較好的降解效果。

2.3 白腐真菌PO1 對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解

白腐真菌Pleurotus ostreatusGEMB-PO1 對(duì)20 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的降解如圖4 和表3 所示。處理3 d 后，白腐真菌PO1 處理中環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的檢測(cè)濃度為1.15 mg/L，對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的降解率達(dá)78.86%。可見(jiàn)，白腐真菌PO1 對(duì)20 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥有較好的降解效果。

圖4 CK、PO1 的高效液相色譜圖

表3 白腐真菌PO1 對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的降解

2.4 農(nóng)田土壤中環(huán)丙氟蟲(chóng)胺耐受菌分離及其降解特性

利用平板篩選技術(shù)在無(wú)菌條件下將土壤樣品用無(wú)菌水制備成懸液作為分離微生物源，之后梯度稀釋涂布于含20、80、200 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的LB 平板上，篩選并分離其中對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺有較高耐藥性的菌株(圖5)。研究發(fā)現(xiàn)，在含200 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的平板中，依然有微生物能夠生長(zhǎng)并顯現(xiàn)出單菌落，最終成功篩選并分離得到12 株在含200 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的平板上正常生長(zhǎng)的菌株。

圖5 土壤微生物對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的耐藥平板

這12 株耐藥菌對(duì)20 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的降解如圖6 所示。不接菌對(duì)照組(CK)中環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的檢測(cè)濃度為6.00 mg/L；菌株1-21、2-6、2-16 對(duì)20 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥有明顯降解效果，處理2 d后環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的檢測(cè)濃度為分別為1.34、2.93、2.45 mg/L，降解率分別達(dá)77.67%、51.17%、59.17%。對(duì)這3 株有明顯降解效果的菌進(jìn)行DNA 提取并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI 和EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)菌株1-21 與高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)、菌株2-6 與東洋芽孢桿菌(Bacillus toyonensis)、菌株2-16 與蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)有較高的相似性。此外，已有研究報(bào)道高地芽孢桿菌可降解聚氨酯、丁草胺、木質(zhì)素、有機(jī)磷農(nóng)藥等污染物[17-20]；東洋芽孢桿菌可降解黑臭水有機(jī)污染物[21]；蠟樣芽孢桿菌可降解原油、短鏈烷烴、多環(huán)芳烴、苯酚、聚乙烯醇、有機(jī)磷農(nóng)藥等污染物[22-25]。以上研究證明存在土壤微生物對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺具有一定的降解能力。

以上研究表明，環(huán)境微生物對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺有一定的降解效果。但是，土壤微生物對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解機(jī)制、降解產(chǎn)物及其毒性分析在本研究中并未得到揭示，將是后續(xù)有價(jià)值的研究方向。

圖6 土壤微生物對(duì)20 mg/L 環(huán)丙氟蟲(chóng)胺原藥的降解

3 結(jié)論

環(huán)丙氟蟲(chóng)胺作為一種間二酰胺類殺蟲(chóng)劑，其作用機(jī)制新穎、殺蟲(chóng)譜廣，尤其對(duì)水稻二化螟具有優(yōu)異的防效。為應(yīng)對(duì)不當(dāng)使用該殺蟲(chóng)劑對(duì)生態(tài)系統(tǒng)存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)，本研究首次探究了部分在環(huán)境中廣泛分布的微生物對(duì)于環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解能力；同時(shí)，從環(huán)境樣品中篩選出了環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的耐受菌，并研究了其對(duì)于環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解能力。

研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)室已有的2 株放線菌、2 株細(xì)菌、1 株真菌和農(nóng)田環(huán)境中分離得到的3 株環(huán)境微生物均具備對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解能力且降解周期短。環(huán)境微生物對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解將有助于環(huán)丙氟蟲(chóng)胺在自然條件下的分解礦化，相關(guān)環(huán)境微生物降解環(huán)丙氟蟲(chóng)胺能力的揭示能夠?yàn)榄h(huán)丙氟蟲(chóng)胺的微生物降解、環(huán)境修復(fù)提供有價(jià)值的參考信息。但是，也必須要看到，環(huán)丙氟蟲(chóng)胺在施用過(guò)程中的殘留行為以及其在膳食、環(huán)境生態(tài)和職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)方面的安全性評(píng)價(jià)，本研究并未能揭示。同時(shí)，微生物對(duì)環(huán)丙氟蟲(chóng)胺的降解機(jī)制、降解產(chǎn)物分析和降解毒理分析，這些都將是有價(jià)值的研究方向，有待通過(guò)后續(xù)進(jìn)一步的研究加以闡明。