劉 鏊，馬丁允，陀海欣，李 靜，王超男，孫銘飛，林栩慧，齊 萌

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

大腸桿菌（Escherichia coli）是人和動(dòng)物常見的病原菌之一，感染后可引起宿主消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病［1］。大腸桿菌可通過污染的環(huán)境、水源或食物等多種途徑進(jìn)行傳播。隨著抗菌藥物的長期廣泛使用，致病性大腸桿菌呈現(xiàn)多重耐藥性，其耐藥因子可在人和動(dòng)物之間進(jìn)行傳播，給公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來較大威脅［2］。馬感染大腸桿菌后，可出現(xiàn)腹瀉、腹痛、脫水等癥狀，排出腥臭味糞便，部分馬匹表現(xiàn)出肌肉震顫，感染嚴(yán)重時(shí)會(huì)死亡。李宏博［3］調(diào)查發(fā)現(xiàn)新疆維吾爾自治區(qū)昭蘇縣散養(yǎng)牧馬肛拭子中大腸桿菌分離率較高，為91.30%（42/46）；左勇等［4］報(bào)道新疆維吾爾自治區(qū)某草場散養(yǎng)牧馬感染大腸桿菌后死亡率較高，為21.11%（19/90），造成較大經(jīng)濟(jì)損失；Kennedy 等［5］從愛爾蘭某馬術(shù)俱樂部患有腸炎的馬駒腹瀉糞便樣本和常規(guī)檢查的糞便樣本中分離出83 株大腸桿菌，其中，血清型為O19A、O40、O101 和O153 的大腸桿菌均可以感染人，提示馬源大腸桿菌具有潛在的人獸共患風(fēng)險(xiǎn)。隨著我國賽馬業(yè)和其他馬術(shù)運(yùn)動(dòng)的蓬勃發(fā)展，賽馬養(yǎng)殖數(shù)量不斷增加，有關(guān)賽馬源大腸桿菌分離株毒力基因檢測和耐藥性研究的數(shù)據(jù)較少。該研究旨在了解廣州市某馬術(shù)俱樂部賽馬源大腸桿菌的攜帶情況，分析其毒力基因流行情況和耐藥性，為我國馬大腸桿菌病的臨床防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 賽馬糞便樣本的收集

從廣州市某馬術(shù)俱樂部選取外觀健康的20匹4 歲以上成年雌性賽馬，用一次性無菌手套經(jīng)直腸收集糞便樣本，每份樣本30～50 g，分別裝入潔凈采樣袋，置于帶有冰塊的泡沫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，隨后進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭染色液參考《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》［6］配制；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、Easy Taq Mix 酶和DL 2 000 DNA Marker 購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀購自Bio-Rad 公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離純化和形態(tài)學(xué)觀察

取0.5 g 賽馬糞便樣本，使用無菌接種環(huán)挑取轉(zhuǎn)移至5 mL 滅菌后的TSB 肉湯中，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)。使用無菌接種環(huán)蘸取菌液，劃線接種于EMB 平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，肉眼觀察菌落形態(tài)，挑取帶有黑色金屬光澤的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增和序列分析

按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒操作步驟提取分離菌株的基因組DNA，參照文獻(xiàn)［7］設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rDNA 通用引物，上游引物序列為：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3＇，下游引物序列為：5＇-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3＇，目的片段大小為1 500 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系為25 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。以ddH2O 作為陰性對照，PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察，將成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序和拼接。所獲序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 搜索，下載相似參考序列，根據(jù)比對結(jié)果鑒定細(xì)菌種類。

1.2.3 大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育群鑒定

參照Clermont 等［8］報(bào)道的方法，設(shè)計(jì)大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群基因特異性引物，chuA 基因上游引 物 序 列 為：5＇-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3＇，下游引物序列為：5＇-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3＇，目的片段為279 bp；yjaA 基因上游引物序 列 為：5＇-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3＇，下游 引 物 序 列 為：5＇-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3＇，目的片段為211 bp；TspE4.C2 基因上游引 物 序 列 為：5＇-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3＇，下游引物序列為：5＇-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3＇，目的片段為152 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系為25 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，上、下 游 引 物 各0.8 μL，DNA 模 板1 μL，ddH2O 9.9 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。以ddH2O 作為陰性對照，PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察。

1.2.4 大腸桿菌毒力基因和耐藥基因檢測

參照文獻(xiàn)［9-11］設(shè)計(jì)大腸桿菌10 種毒力基因和11 種耐藥基因特異性引物，引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系為25 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。毒力基因和耐藥基因PCR擴(kuò)增程序均為35 個(gè)循環(huán)，退火溫度和目的片段大小見表1 和表2。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察。

表1 大腸桿菌毒力基因PCR 擴(kuò)增引物信息

表2 大腸桿菌耐藥基因PCR 擴(kuò)增引物信息

1.2.5 大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)

參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2018 年 推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B 紙片法，選取常用的8 類10 種抗菌藥物進(jìn)行藥物敏性試驗(yàn)。將藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，每株菌每種藥物設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)后測量抑菌圈直徑，判定藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

20 份賽馬糞便樣本經(jīng)TSB 液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h 后，有13 份液體培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，蘸取菌液劃線于EMB 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，生長出紫黑色、表面光滑、有金屬光澤的圓形單個(gè)菌落 （見圖1A）；挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，在普通光學(xué)顯微鏡下可見，細(xì)菌呈兩端鈍圓、散列的革蘭陰性短桿菌 （見圖1B）。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，13 株分離菌初步鑒定為大腸桿菌。

圖1 分離菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.2 分離菌株16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增及序列分析

基于細(xì)菌16S rDNA，對13 株分離菌基因組DNA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，13 份樣本均在1 500 bp 左右處出現(xiàn)條帶，與目的片段大小一致（見圖2）。根據(jù)序列比對結(jié)果，13 條16S rDNA序列中，有2 條與我國吉林省長春市大腸桿菌分離株序列（GenBank 登錄號(hào)：MK621229）同源性為100%（n=2）；1 條與挪威大腸桿菌NMBU-W13E19分離株序列（GenBank 登錄號(hào)：CP043406）同源性為100%（n=1）；1 條與我國新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市大腸桿菌分離株序列（GenBank 登錄號(hào)：MN704518.1）同源性為100%（n=1）；1 條與哈薩克斯坦酸奶樣品大腸桿菌分離株序列 （GenBank 登錄號(hào)：MT416422）同源性為100%（n=1）；1 條與日本宮崎縣大腸桿菌分離株序列（GenBank 登錄號(hào)：AP027191）同源性為100%（n=1）；1 條與我國江蘇省南京市豬源大腸桿菌分離株序列 （GenBank 登錄號(hào)：MH671454）同源性為100%（n=1）；2 條與加拿大大腸桿菌分離株序列 （GenBank 登錄號(hào)：CP092500）同源性為100%（n=2）；1 條與韓國首爾市大腸桿菌分離株序列 （GenBank 登錄號(hào)：CP082835）同源性為100%（n=1）；1 條與美國佛羅里達(dá)州大腸桿菌分離株序列 （GenBank 登錄號(hào)：CP043487）同源性為100%（n=1）；1 條與柬埔寨豬肉樣品大腸桿菌分離株序列 （GenBank 登錄號(hào)：CP044291）同源性為100%（n=1）；1 條與印度奧迪薩邦湖泊沉淀物大腸桿菌分離株序列（GenBank登錄號(hào)：MH255532）同源性為100%（n=1）。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA 序列比對結(jié)果，13 株分離菌均為大腸桿菌。該馬術(shù)俱樂部賽馬糞便樣本中大腸桿菌的分離率為65.00%（13/20）。

圖2 分離菌株16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 大腸桿菌分離株系統(tǒng)發(fā)育群鑒定結(jié)果

大腸桿菌分離株的系統(tǒng)進(jìn)化分群基因PCR檢測結(jié)果顯示（見圖3），13 株菌被分為3 個(gè)種群，其 中，A 群 占23.07%（3/13），B1 群 占61.54%（8/13），D 群占15.38%（2/13）。

2.4 大腸桿菌分離株毒力基因檢測結(jié)果

對13 株大腸桿菌分離株進(jìn)行10 種毒力基因PCR 檢測，檢出5 種毒力基因，分別為fimC（61.54%，8/13）、fyuA（7.69%，1/13）、irp2（7.69%，1/13）、stx1（15.38%，2/13）和stx2（7.69%，1/13），未檢測到其他毒力基因。

2.5 大腸桿菌分離株耐藥基因檢測結(jié)果

對13 株大腸桿菌分離株進(jìn)行11 種耐藥基因PCR 檢測，檢出9 種耐藥基因，分別為parC（100%，13/13）、gyrA（100%，13/13）、gyrB（92.31%，12/13）、sul2 （76.92%，10/13）、cmlA （30.77%，4/13）、aadA（23.07%，3/13）、tet（B）（15.38%，2/13）、blaTEM（7.69%，1/13）和blaCTX（7.69%，1/13），Aph（3＇）和floR 基因未檢出。

2.6 大腸桿菌分離株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，13 株大腸桿菌分離株對頭孢西丁、慶大霉素和環(huán)丙沙星敏感，對四環(huán)素的耐藥率為38.46%，對頭孢噻呋、阿米卡星、氨芐西林的耐藥率均為30.77%，對甲氧芐啶/磺胺異噁唑的耐藥率為23.07%，對氯霉素和亞胺培南的耐藥率均為7.69%（見表3）。

表3 大腸桿菌分離株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

大腸桿菌是一種條件性致病菌。飼養(yǎng)管理?xiàng)l件差容易誘發(fā)馬匹大腸桿菌病，給馬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展帶來較大經(jīng)濟(jì)損失［12］。Clermont 等［13］利用分子生物學(xué)方法，將大腸桿菌分為7 個(gè)系統(tǒng)類群，分別為A、B1、B2、C、D、E 和F，其中，B2 群和D 群是常見的人獸共患系統(tǒng)類群。Kennedy 等［5］從愛爾蘭馬駒腹瀉糞便樣本中分離到83 株大腸桿菌，經(jīng)系統(tǒng)分群鑒定，以A 群為主要類群，所占比例為56.62%（47/83），其他類群所占比例依次為D 群（22.89%，19/83）、B1 群（14.46%，12/83）和B2 群（6.02%，5/83）。該研究發(fā)現(xiàn)廣州某馬術(shù)俱樂部賽馬源13 株大腸桿菌以B1 群為主要類群，所占比例為61.54%（8/13），A 群和D 群所占比例分別為23.07%（3/13）和15.38%（2/13），未檢出B2 群，提示不同國家和地區(qū)的馬源大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群存在一定差異，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大調(diào)查地區(qū)范圍和調(diào)查樣本數(shù)量。

該研究毒力基因檢測結(jié)果顯示，13 株賽馬源大腸桿菌分離株攜帶5 種毒力基因，fimC 基因所占比例最高，為61.54%（8/13），該基因在大腸桿菌黏附與定植過程中起著重要作用［8］；irp2 和fyuA是毒力島中重要的鐵調(diào)控基因，存在于大腸桿菌強(qiáng)致病性菌株中，與致病性密切相關(guān)；stx1 和stx2參與大腸桿菌致使宿主細(xì)胞凋亡的過程［14］。毒力基因檢測結(jié)果提示，健康賽馬腸道內(nèi)的大腸桿菌具有潛在的致病力。

Chung 等［15］對 韓 國296 株 賽 馬 源 大 腸 桿 菌進(jìn)行11 種耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)以β-內(nèi)酰胺類blaTEM基因檢出率較高，為60.13%（178/296）；江婉琳等［14］對新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)51 株奶牛糞源大腸桿菌進(jìn)行24 種耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)以β-內(nèi)酰胺類blaTEM基因檢出率最高，為100%（51/51）；佟盼盼等［16］對新疆維吾爾自治區(qū)154 株腹瀉仔豬源大腸桿菌進(jìn)行12 種耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)以四環(huán)素類tet（A）基因檢出率較高，為88.31%（136/154）。該研究耐藥基因檢測結(jié)果顯示，以喹諾酮類耐藥基因檢出率較高，其中，parC 和gyrA基因檢出率均為100%（13/13），gyrB 基因檢出率為92.31%（12/13）。上述研究結(jié)果表明，不同地區(qū)和不同養(yǎng)殖條件下，畜主對動(dòng)物臨床用藥存在差異，其流行的大腸桿菌耐藥基因不同。該研究結(jié)果提示，今后對該馬術(shù)俱樂部賽馬進(jìn)行用藥時(shí)，應(yīng)考慮更換氟喹諾酮類藥物。

Yigin［17］從阿拉伯馬糞便樣本中分離出200 株大腸桿菌，評價(jià)了分離菌株對14 種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果顯示，分離菌株對慶大霉素、氨芐西林、阿米卡星、四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑的耐藥率 分 別 為26.65% （53/200）、81.50% （163/200）、6.00%（12/200）、61.00%（122/200）和47.00%（94/200）。Reshadi 等［18］從伊朗65 匹健康馬直腸拭子中分離出65 株大腸桿菌，分析了分離菌株對7 種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果顯示，分離菌株對阿莫西林和頭孢曲松的耐藥率分別為46.15%（30/65）和38.46%（25/65）。該研究藥敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，13株賽馬糞便源大腸桿菌分離株對頭孢西丁、慶大霉素和環(huán)丙沙星敏感，對四環(huán)素、頭孢噻呋、阿米卡星、氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、氯霉素和亞胺培南表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，耐藥率在7.69%（1/13）～38.46%（5/13）。該研究結(jié)果表明，不同地區(qū)馬源大腸桿菌耐藥性存在差異，與動(dòng)物飼養(yǎng)管理和用藥情況密切相關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)馬大腸桿菌病的檢測和合理用藥。

4 結(jié)論

廣州市某馬術(shù)俱樂部賽馬源大腸桿菌種群具有多樣性，攜帶多種毒力基因和耐藥基因，呈現(xiàn)多重耐藥性，提示臨床上應(yīng)加強(qiáng)馬大腸桿菌病的防治。