張余蓬,郭靈君,羅怡茜,張芝金,李亞均,朱 瑞,張德志,2,李前勇,2,3*

(1.西南大學 動物醫(yī)學院,重慶 榮昌 402460;2.重慶市獸醫(yī)科學工程研究中心,重慶 榮昌 402460;3.重慶市肉牛工程技術研究中心,重慶 榮昌 402460)

白酒糟是白酒釀造后剩余的產(chǎn)物,又名丟糟。資料顯示,白酒糟中粗蛋白質為(16.75±1.64)%,干物質(89.40±3.18)%,粗灰分(9.91±2.04)%,粗脂肪(4.83±2.29)%,粗纖維(28.57±3.10)%,中性洗滌纖維(53.43±5.29)%,酸性洗滌纖維(45.93±3.76)%,非蛋白氮(3.68±1.41)%,淀粉(13.68±3.32)%,鈣(0.46±0.17)%,總磷(1.55±0.66)%,Fe、Cu、Mn、Zn含量也較豐富[1],是一種傳統(tǒng)的動物飼料原料。動物飼料中補飼一定比例的白酒糟可顯著提高干物質的采食量、平均日增質量、營養(yǎng)物質的表觀消化率,進而提高生長性能,顯著降低料重比,可達到降低飼養(yǎng)成本、提高經(jīng)濟效益的作用[2-4]。近年來,隨著豆粕、玉米等大宗飼料原料價格的不斷上漲,動物生產(chǎn)尤其是牛羊養(yǎng)殖中白酒糟的使用現(xiàn)象越來越普遍,據(jù)報道,重慶地區(qū)肉牛飼養(yǎng)中酒糟的使用率達94.41%,在育肥肉牛日采食量中酒糟添喂比例在70.00%以上的牛只可占調查牛只的13.50%～14.50%,繁殖母牛采用高劑量(占日采食量的50.00%～60.00%)酒糟添喂的牛只也達9.38%～13.73%[5],高劑量酒糟飼喂現(xiàn)象在牛羊生產(chǎn)中比較常見。

然而,白酒糟中不僅富含蛋白質、粗纖維、粗脂肪、淀粉及部分礦物元素等營養(yǎng)物質,還含有各種醇類、醛類、酸類、霉菌毒素等有害物質,動物長期高劑量或突然大劑量飼喂,會引起牛、羊機體不適,導致瘤胃內環(huán)境紊亂,瘤胃發(fā)酵功能異常,進而影響牛、羊健康,誘發(fā)瘤胃黏膜及其下層組織的炎癥、酒糟中毒等疾病[6],目前國內關于牛羊酒糟中毒的病例報道較常見[7-9],但國內外對高劑量酒糟飼喂對瘤胃發(fā)酵功能及黏膜組織損傷的影響研究鮮見報道。為此,本試驗通過飼糧中添加65.00%和75.00%白酒糟,探究高劑量白酒糟對山羊瘤胃的發(fā)酵功能、菌群結構及瘤胃炎性基因的影響,旨在為白酒糟在牛、羊養(yǎng)殖的安全使用中提供部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計選用重慶榮昌本地健康雜交山羊15只(購自重慶榮昌某山羊養(yǎng)殖基地),3月齡,體質量(14.16±1.30)kg及體況相近。試驗采用單因素完全隨機試驗設計,隨機分成3組,每組5只,對照組(LC)飼喂基礎飼糧,Ⅰ組替換65%飼糧白酒糟(LM),Ⅱ組替換75%飼糧白酒糟(LH),以《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T816-2004)為參考設計日糧中能量和蛋白水平[10],試驗日糧組成和營養(yǎng)水平如表1所示。每只羊獨立圈舍,半漏縫式地板,自由飲水,分別于每日09:00和18:00喂食。預試期14 d,正式試驗期90 d。期間定期進行疫苗接種、驅蟲、環(huán)境消毒等。

1.2 樣本采集與測定

1.2.1瘤胃液采集 在試驗第90天晨飼前利用胃導管采取參試山羊瘤胃液,丟棄含有大量唾液的部分,每只羊采集50 mL,將瘤胃液經(jīng)4層無菌紗布過濾后,取5 mL瘤胃液立即測量pH,其余瘤胃液于-80℃冰箱冷凍保存,以便后續(xù)試驗。

表1 試驗日糧組成和營養(yǎng)水平 %

1.2.2瘤胃組織采集 山羊瘤胃液采集完成之后,由經(jīng)驗豐富的外科獸醫(yī)在山羊瘤胃腹側切除約10 g的瘤胃組織。采集的瘤胃組織經(jīng)生理鹽水和無水乙醇洗滌干凈,液氮冷凍0.5 h后儲存于-80℃冰箱中,用于RNA的提取。

1.2.3瘤胃液發(fā)酵參數(shù)測定 瘤胃液pH采用PHS-3E 酸度計測定,測定前用標準品對酸度計進行校準。瘤胃液VFA濃度由7890B-7000D GC-MS/MS氣相色譜儀與質譜儀聯(lián)用測定,使用氦氣作為載氣,流速為1.2 mL/min。在分離模式下進行注射,注射量為2 μL。烘箱溫度在90℃保持1 min,加熱速度為25℃/min到100℃,并且以20℃/min的速度升到150℃,保持36 s,以25℃/min的速度升至200℃,保持30 s,運行3 min后。進樣器入口和傳輸線溫度分別為200和230℃。瘤胃液組胺和LPS濃度參照羊LPS、組胺ELISA檢測試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司)說明書測定。

1.2.4瘤胃液16S rDNA測序 將合格的樣品用細菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCT-AAT-3′)擴增細菌16S rDNA基因的V3～V4區(qū)。PCR反應體系(25.0 μL):12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix、3 μL BSA(2 mg/L)、1.0 μL Forward Primer(5 μmol/L)、1.0 μL Reverse Primer(5 μmol/L)、2.0 μL DNA,最后加入5.5 μL ddH2O 補足至25.0 μL。反應參數(shù):95℃預變性5 min;95℃變性45 s,55℃退火50 s,72℃延伸45 s,28個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目的條帶大小,并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。純化后的PCR產(chǎn)物用于構建微生物多樣性測序文庫,在北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300高通量測序平臺進行Paired-end測序。

1.2.5瘤胃組織炎性基因表達量測定 各瘤胃組織RNA的提取參照RNAiso Plus(TaKaRa)說明書提取。按照TaKaRa反轉錄說明書步驟,將各樣本RNA反轉錄成cDNA。在八連管中加入10 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ,1 μL PCR Forward Primer,1 μL PCR Reverse Primer,2 μL cDNA模板,1 μL dd H2O,共20 μL。qRT-PCR擴增程序為95℃預變性30 s,1個循環(huán);95℃變性5 s,65℃延伸30 s,40個循環(huán)。各基因引物如表2所示,內參基因為β-actin。

表2 基因引物序列

2 結果

2.1 高劑量白酒糟對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響如表3所示,試驗90 d后,與對照組相比,65%白酒糟組和75%白酒糟組山羊瘤胃液pH顯著降低(P<0.05);同時隨著白酒糟飼喂量的增多,山羊瘤胃pH呈下降趨勢。與對照組比較,65%白酒糟組山羊瘤胃液乙酸和丁酸含量無顯著性變化(P>0.05),而75%白酒糟組山羊瘤胃液乙酸和丁酸含量顯著降低(P<0.05),各組間丙酸、異丁酸、異戊酸、戊酸含量均未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。 與對照組相比,65%白酒糟組乙丙比無顯著性變化,75%白酒糟組乙丙比顯著下降(P<0.05),65%和75%白酒糟組總VFA含量顯著降低(P<0.05)。與對照組比較,65%和75%白酒糟組瘤胃液組胺和LPS濃度極顯著上升(P<0.01)。

表3 高劑量白酒糟對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.2 高劑量白酒糟對山羊瘤胃微生物群落的影響

2.2.1OTU韋恩圖結果分析 如圖1所示,3組共同擁有612個OTU,LC和LH組共有196個OTU,LH和LM組共有135個OTU,LC和LM組共有83個OTU,LC組獨有300個OTU,LH組獨有97個OTU,LM組獨有83個OTU,與對照組相比,白酒糟組的OTU有所降低。

圖1 OTU韋恩圖

2.2.2Alpha多樣性分析 如圖2 A、B所示,稀釋性曲線趨于平緩,表明有合理的測序數(shù)據(jù)量,而香農(nóng)曲線趨于平緩,表明測序數(shù)據(jù)量大,足以反映樣品中的大部分微生物信息。

圖2 稀釋性曲線(A)和香農(nóng)曲線(B)

表4顯示了最低序列數(shù)最終樣本數(shù)及其Alpha指數(shù)的并列分析,Chao1、Shannon、Simpson和Observed指數(shù)在各組之間沒有顯著性差異(P>0.05),且白酒糟組Alpha指數(shù)相比對照組有所下降。各組間種群數(shù)量及結構類似,但菌群豐度較大,菌群多樣性處于較高水平。

表4 山羊瘤胃液Alpha多樣性指數(shù)

2.2.3山羊瘤胃微生物門水平比較 本試驗的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bac'teroidota),占瘤胃微生物門類90%以上(圖3)。其中,厚壁菌門和擬桿菌門在酒糟組和對照組中無顯著性差異(P>0.05),但厚壁菌門隨著白酒糟飼喂量的增多呈下降趨勢,擬桿菌門隨著白酒糟飼喂量的增多呈上升趨勢。

2.2.4山羊瘤胃微生物科水平比較 在科水平上的優(yōu)勢菌為普雷沃菌科(Prevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、真桿菌科(Eubacterium)(圖4)。其中,普雷沃菌科、瘤胃菌科隨著白酒糟飼喂量的增多呈上升趨勢,而毛螺菌科呈下降趨勢,但各組間的差異均不顯著(P>0.05)。

A.優(yōu)勢菌門;B.組間優(yōu)勢菌門變化

A.優(yōu)勢菌科;B.組間優(yōu)勢菌科水平變化

2.2.5山羊瘤胃微生物屬水平比較 在屬水平上的優(yōu)勢菌為普雷沃菌屬(Prevotella)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)(圖5),但普雷沃菌屬豐度與白酒糟飼喂量呈正比例趨勢。

2.3 高劑量白酒糟對山羊瘤胃炎性基因表達的影響結果如圖6所示,與對照組相比,65%和75%白酒糟組山羊瘤胃組織中p65/COX2/VCAM1 mRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)。

A.優(yōu)勢菌屬;B.組間優(yōu)勢菌屬水平變化

*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01)

3 討論

3.1 高劑量白酒糟對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響瘤胃pH是判斷瘤胃發(fā)酵狀況及其瘤胃微生物狀態(tài)是否正常的標志性指標[11]。對瘤胃消化和代謝的主要影響是纖維物質的分解和VFA的吸收[12]。紀宇等[13]添加不同比例白酒糟飼喂育肥山羊發(fā)現(xiàn),隨著白酒糟比例的增高,瘤胃pH下降,本試驗結果與其相似,可能白酒糟中的酸性物質較多,加之谷物在瘤胃內二次發(fā)酵,瘤胃pH顯著降低。VFA是厭氧消化過程中一個重要的中間產(chǎn)物,瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸占據(jù)總VFA的95%左右[14]。本試驗中飼喂65%和75%白酒糟導致山羊瘤胃總VFA含量降低,同時,75%白酒糟組乙酸、丁酸的濃度也明顯降低。有研究發(fā)現(xiàn)[15],丁酸和乙酸可以相互轉化,從丁酸到乙酸有1個ATP生成,增加了能量供應。曹廣等[16]研究表明,飼喂2%和5%的發(fā)酵酒糟均能使牦牛瘤胃液中的丁酸濃度顯著降低,與本試驗結果類似。VFA是腸道中抑制病原微生物的重要因素,當VFA濃度升高時可抑制沙門菌的生長,瘤胃中抑制病原微生物的能力還與pH有關。由此推測,較高劑量的白酒糟飼喂,可能有導致山羊腸道致病菌感染的風險。

組胺和LPS等致炎物質可通過瘤胃屏障進入血液和淋巴液中,引發(fā)全身炎癥[17]。ASCHENBACH等[18]研究發(fā)現(xiàn),瘤胃中的大量組胺可以通過瘤胃屏障進入血液,導致全身組胺的增加,加速瘤胃的炎癥反應。此外,組胺還可作炎癥誘導劑,參與炎性細胞因子的調控和表達,進而誘導炎癥的發(fā)生、發(fā)展[19-21]。本試驗65%,75%白酒糟組山羊瘤胃液組胺含量顯著高于對照組,與SUN等[22]和CHANG等[23]研究結果類似,可能由于飼喂白酒糟會降低瘤胃液pH,造成瘤胃發(fā)酵異常,微生物結構改變,產(chǎn)生大量脫羧細菌,進而讓組氨酸脫羧形成組胺[24]。LPS是一種超強的致炎因子,一旦進入內循環(huán)發(fā)生紊亂,就會造成動物機體免疫系統(tǒng)混亂,巨噬細胞通過釋放大量的炎癥細胞因子來應對身體的免疫反應[25-26]。本試驗65%和75%白酒糟組山羊瘤胃液LPS濃度顯著高于對照組,與MIZUGUCHI等[27]和MONTERIRO等[28]研究結果一致,可能因飼喂白酒糟會顯著降低瘤胃液pH,使許多革蘭陰性菌加速破裂、溶解,細菌壁大量釋放LPS,導致LPS濃度顯著升高[29]。

3.2 高劑量白酒糟對山羊瘤胃微生物群落的影響本試驗基于山羊瘤胃微生物門水平的優(yōu)勢菌為厚壁菌門和擬桿菌門,且占瘤胃微生物門類的90%以上,與郭婷婷等[31]研究甘露寡糖對奶牛瘤胃微生物結構的影響時的結果相符,也與索效軍等[32]利用16S rDNA擴增子測序分析湖北黑頭羊瘤胃微生物多樣性結果一致。擬桿菌門主要功能是從碳水化合物和蛋白質中獲取能量,含有更多的制造維生素C、B2、B5和H的菌類,本試驗擬桿菌門隨著白酒糟飼喂的增多呈上升趨勢,提示飼喂白酒糟可使瘤胃攝取能量的能力得到適應性增加;而厚壁菌門隨著白酒糟飼喂量的增多呈下降趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)[33],肥胖者與苗條者相比,都出現(xiàn)了體內的厚壁菌門減少,擬桿菌門增多的現(xiàn)象,本試驗結果與之一致,提示飼喂白酒糟可能會增加山羊的脂肪,提升動物的生產(chǎn)性能。造成這一改變發(fā)生的原因是很寬泛的,并不是某種細菌增加或減少造成的,因為微生物多樣性在同一個體內隨時間變化不大[34]。基于科和屬水平的歸類,山羊瘤胃中的普雷沃菌占絕對優(yōu)勢,都歸屬于擬桿菌門,可分解非纖維素植物多糖,如木聚糖等,在利用果膠和分解蛋白質等方面起關鍵性作用[35-36]。本試驗中,毛螺菌科(Lachnospiraceae)隨白酒糟飼量的增加呈下降趨勢,其分類下的瘤胃球菌屬(Ruminococcus)是山羊瘤胃中的第二大菌屬,擅長消化胃腸道中的糖蛋白,含有較多的制造維生素B1和葉酸的菌類[37-38],提示了飼喂高劑量白酒糟可能會降低瘤胃的消化代謝能力。最新人類研究表明[39-40],普雷沃菌與促炎功能有關,隨著普雷沃菌豐度的增加,會減少IL-18的產(chǎn)生,從而加劇腸道炎癥,并可能導致機體自身免疫,還可能引發(fā)慢性功能性胃腸道疾病。本試驗中,普雷沃菌科和屬相對豐度均隨白酒糟飼喂量的增多呈上升趨勢,提示飼喂大量白酒糟可能會引發(fā)山羊胃腸道產(chǎn)生炎癥,引起病變。

3.3 高劑量白酒糟對山羊瘤胃炎性基因表達的影響p65/COX2/VCAM1是NF-κB信號通路中的細胞因子,在炎癥和免疫信號通路中發(fā)揮重要作用,p65是最常見的異源二聚體,也是作用最強,分布最廣,活性最強的信號分子,被激活后可參與大量的基因表達和調控[41]。在一定程度上,可以近似地認為p65的功能作用就是NF-κB的功能作用。p65可促進下游多種黏附分子、炎癥因子的表達[42]。本試驗中,65%和75%白酒糟組瘤胃液的p65 mRNA表達量顯著升高,與趙晨旭[43]研究奶牛亞急性瘤胃酸中毒結果一致,LPS和組胺可以誘發(fā)瘤胃上皮細胞炎癥,激活NF-κB炎癥通路,促進炎性細胞因子的釋放,進而誘發(fā)瘤胃上皮細胞的炎性反應。

COX2的作用機制是促進單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、血管平滑肌或內皮細胞等細胞,從而誘發(fā)后續(xù)的炎癥反應[44]。COX2在正常組織的細胞中的活性非常低,然而,當細胞受到炎癥的刺激時,它在炎癥細胞中的表達量比正常水平增加10～80倍,而且在炎癥部位的PEG2、PGI2和PGE1的水平也會升高,導致炎癥反應和組織損傷[45]。仇瑋等[46]研究胃癌病例患者時發(fā)現(xiàn),NF-κB、COX2和VEGF的表達量增高,可能與胃癌的血管生成有關,并起促進作用,本試驗65%,75%白酒糟組的COX2 mRNA表達量顯著上升,可能會誘發(fā)促炎因子釋放,造成瘤胃炎癥。

VCAM1在腫瘤轉移、炎癥、寄生蟲感染和自身免疫性疾病等病變過程當中具有不可替代的作用[47]。NF-κB可調控VCAM1基因的表達。因為NF-κB在所有細胞中廣泛存在,故此VCAM1具備特殊性的細胞表達[48]。KHACHIGIAN等[49]證實了p65可直接地調節(jié)VCAM1基因的表達。沈開慧等[50]研究VCAM1含量與神經(jīng)損傷和炎性反應的關系,發(fā)現(xiàn)VCAM1含量的多少與患者的神經(jīng)損傷和炎癥反應嚴重程度直接相關。本試驗飼喂65%和75%白酒糟導致山羊瘤胃液VCAM1 mRNA相對表達量顯著升高,可能是p65表達上調,導致VCAM1上調,進而可激活瘤胃組織的炎癥通路。