黎 夢,王 奕,何家建,魏立民,陳 婷,習(xí)欠云,孫加節(jié),張 瑾,張永亮*

(1.嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 嘉興 314000;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642;3.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,海南 ?？?571100)

腸道作為機(jī)體代謝和更新最旺盛的組織,提供物理隔離、營養(yǎng)吸收和腸道屏障的作用,更是內(nèi)外環(huán)境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐,對維持仔豬的健康生長具有重要作用。其黏膜結(jié)構(gòu)受損、功能紊亂和生態(tài)失調(diào)均會影響腸道的健康。在畜牧業(yè)中,早期斷奶應(yīng)激往往會造成仔豬腸道屏障損傷,進(jìn)而導(dǎo)致腸道消化吸收功能障礙、免疫功能異常、菌群失調(diào),易引起仔豬腹瀉、生長受阻以及影響仔豬存活率[1],這也是目前我國仔豬生產(chǎn)中存在的主要問題。仔豬階段的死亡淘汰率占整個(gè)養(yǎng)豬過程的75%,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(國家統(tǒng)計(jì)局)。因此,保證腸道健康,是保障仔豬生長和提高仔豬存活率的關(guān)鍵,有利于提高畜牧生產(chǎn)水平。

現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中早已關(guān)注仔豬斷奶早期給養(yǎng)豬業(yè)帶來的影響,并推廣仔豬早期斷奶技術(shù)。由于受心理、環(huán)境和營養(yǎng)應(yīng)激等因素影響,早期斷奶仔豬仍易產(chǎn)生腹瀉,影響仔豬的存活率和生長性能[2]。FUNDERBURKE等[3]曾研究斷奶仔豬在這3種應(yīng)激下的生理和生長,發(fā)現(xiàn)其中飼料營養(yǎng)應(yīng)激的影響最大,故早期斷奶仔豬飼料的配制至關(guān)重要,關(guān)系到斷奶仔豬生長及后期生產(chǎn)性能的發(fā)揮。近年來,關(guān)于斷奶仔豬飼料營養(yǎng)素調(diào)控的研究主要集中在能量[4]、蛋白質(zhì)[5]、微量元素[6]以及維生素[7]等方面。此外,飼料形態(tài)[8]、纖維含量[9]、以及飼料中淀粉類型[10]、淀粉糊化程度也會影響斷奶仔豬對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和健康?？梢婏暳嫌绊憯嗄套胸i生長的因素很多,因此探索飼料中影響斷奶仔豬腸道健康及生長性能尤為重要。

本研究將玉米和玉米淀粉配制營養(yǎng)和能量均衡的飼料,分別飼喂斷奶仔豬,探究不同原料對斷奶仔豬腸道屏障的影響,在分子水平揭示其對仔豬腸道屏障的影響及其機(jī)制,并分析原因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料選取72只28日齡斷奶的大白豬隨機(jī)分為2組,將玉米飼料飼喂的斷奶仔豬設(shè)為玉米組,斷奶仔豬飼料中的玉米替換為同種玉米淀粉制備成淀粉飼料,并平衡2種飼料的營養(yǎng)水平和能量,玉米淀粉飼料進(jìn)行飼喂設(shè)為淀粉組。每組2個(gè)重復(fù)(雌、雄各1/2),每個(gè)重復(fù)18只,分4欄飼養(yǎng),預(yù)飼7 d,正式試驗(yàn)周期21 d,選擇濕法和自由采食進(jìn)行飼喂。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 測定指標(biāo)及方法

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)) %

1.2.2血清生化指標(biāo) 測定在試驗(yàn)結(jié)束時(shí),隨機(jī)取每組6只仔豬分別采集全血,室溫傾斜靜止1 h,室溫條件下4 000 r/min離心10 min獲取血清,-20℃ 保存。用AU5800全自動生化分析儀(美國貝克曼)及中生北控試劑盒測定血清中總蛋白(TP,雙縮脲法)、白蛋白(ALB,溴甲酚綠法)、球蛋白(GLB,溴甲酚綠法)含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT,IFCC法)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST,氧化酶法)的活性,以及總膽固醇(TC,氧化酶法)、甘油三酯(TG,酶法)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C,酶法)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C,酶法)含量。

1.2.3消化道pH值的測定 試驗(yàn)結(jié)束后頸動脈放血處死并迅速打開腹腔,縱向剖開腸道,收集內(nèi)容物至平皿中混勻,吸取少量上清液檢測pH值。

1.2.4HE染色 取新鮮的十二指腸組織固定在10%的中性緩沖甲醛中,用石蠟進(jìn)行包埋,并將石蠟切成厚度為6 mm的水平切片,用標(biāo)準(zhǔn)的蘇木精和伊紅對切片進(jìn)行染色。在顯微鏡(尼康)下以100和200倍放大觀察絨毛結(jié)構(gòu)。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)縱向剖開腸道,沖凈殘余內(nèi)容物,用破片小心刮取十二指腸黏膜,收集1 mL獲取腸道黏膜組織于液氮保存。利用TRIzol(15596018,Thermo Fisher)裂解法提取動物RNA。參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RRO-47A)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,采用qRT-PCR方法檢測腸黏膜尾型同源盒基因(CDX2)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、閉鎖蛋白(OCLN)、閉合蛋白(CLDN1)、黏蛋白(MUC2)和腫瘤壞死因子(TNFα)、Wnt家族成員10b(Wnt10b)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、原癌基因(C-myc)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和β肌動蛋白(β-actin)mRNA相對表達(dá)量,在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(stratagene mx3005p,Agilent)中進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng),反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 2 min預(yù)變性;95℃ 15 s 變性,15 s退火,72℃ 40 s延伸,反應(yīng)40個(gè)循環(huán);最后95℃ 1 min,30 s退火,95℃ 30 s,繪制相應(yīng)的熔解曲線,反應(yīng)設(shè)立無模板反轉(zhuǎn)錄樣品為陰性對照(NTC)。以β-actin為內(nèi)參基因,按照2-△△Ct法計(jì)算各基因mRNA相對表達(dá)量,引物信息見表2。

表2 qRT-PCR特異性引物

1.2.6Western blot檢測 蛋白含量使用含有1 mmol/L PMSF的RIPA緩沖液裂解腸道黏膜提取TP,并通過BCATP檢測試劑盒(Thermo Fisher,Waltham,美國)進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)懸浮液(20 μg)用蛋白上樣緩沖液稀釋并煮沸10 min。然后用5%和10%的SDS-PAGE對蛋白樣品進(jìn)行解析,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。Wnt10b、β-catenin、Cyclin D1、C-myc和PCNA蛋白的檢測一抗分別使用兔源的anti-human Wnt10b(1∶500,D162612,上海生工,中國)、anti-human β-catenin(1∶500,D260137,上海生工,中國)、anti-human Cyclin D1(1∶2 000,2922,Cell Signalling Technology,美國)和anti-human C-MYC(1∶1 000,D199941,上海生工,中國),然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔源IgG二抗(1∶50 000,BS10002/3,Bioworld Technology,美國)。β-actin(1∶5 000,BS6007M,Bioworld Technology,美國)作為內(nèi)參。用Image J測量條帶灰度,并將用β-actin作為內(nèi)參計(jì)算相對蛋白灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析本試驗(yàn)2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(t-test)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用GraphPad 6.0制圖,以P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn),P<0.01為極顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 玉米和玉米淀粉對斷奶仔豬生長性能的影響與玉米組相比,淀粉組仔豬體質(zhì)量增重在第10天顯著受到抑制(P<0.05),試驗(yàn)結(jié)束時(shí)差異極顯著(圖1A,P<0.01),平均日增質(zhì)量極顯著下調(diào)(圖1B,P<0.01);淀粉組仔豬的平均日采食量減少,隨著飼喂時(shí)間的增加減少幅度增大(圖1C)。結(jié)果表明,玉米淀粉飼料抑制仔豬的采食量和增質(zhì)量。

A.仔豬體質(zhì)量;B.仔豬平均日增質(zhì)量;C.仔豬平均日采食量;*.P<0.05,**.P<0.01。下同

2.2 玉米和玉米淀粉對仔豬血液生化指標(biāo)的影響如圖2～4所示,與玉米組相比,淀粉組血清ALB和TP含量及AST、γ-GT和LDH活性顯著下降(P<0.05),提示淀粉組仔豬肝臟功能和蛋白質(zhì)等代謝活動下降;淀粉組仔豬血清HDL-C和TC含量極顯著下降(P<0.01),TG含量顯著下降(P<0.05),即玉米淀粉飼料抑制仔豬血脂水平。這些結(jié)果提示玉米淀粉飼料可能抑制機(jī)體代謝。

2.3 玉米和玉米淀粉對腸道pH值絨毛的影響檢測胃腸消化道的酸堿環(huán)境,如圖5A所示,與玉米組相比,淀粉組十二指腸pH值極顯著增加(P<0.01),胃、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸pH值都維持正常的生理水平。同時(shí)通過十二指腸的腸道切片觀察腸道的絨毛形態(tài),結(jié)果顯示,相對于玉米組,淀粉組的腸道絨毛密度與細(xì)胞細(xì)胞密度明顯減少(圖5B)。

A.仔豬血清TP含量;B.仔豬血清ALB含量;C.仔豬血清GLB含量;D.仔豬血清ALB和TP比值

A.仔豬血清谷ALT活性;B.仔豬血清AST活性;C.仔豬血清谷ALT活性和AST活性比值;D.仔豬血清γ-GT活性;E.仔豬血清LDH活性差異

A.仔豬血清LDL-C含量;B.仔豬血清HDL-C含量;C.仔豬血清TG含量;D.仔豬血清TC含量

2.4 玉米和玉米淀粉對仔豬腸道黏膜相關(guān)基因表達(dá)的影響通過qRT-PCR檢測CDX2、PCNA、OCLN、CLDN1、MUC2和TNFα mRNA水平。結(jié)果顯示,與玉米組相比,CDX2和TNFα mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),PCNA、OCLN和CLDN1表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01),MUC2 mRNA表達(dá)量不變(圖6)。結(jié)果提示玉米淀粉飼料可能抑制腸黏膜細(xì)胞的分化、增殖、物理屏障和免疫屏障等,對化學(xué)屏障無影響。

圖6 玉米和玉米淀粉對仔豬十二指腸屏障相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5 玉米和玉米淀粉對仔豬腸道黏膜Wnt信號通路的影響通過qRT-PCR和Western blot檢測2種飼料對十二指腸黏膜關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號通路Wnt/β-catenin的活性。如圖7所示,淀粉組Wnt10b、β-catenin及Cyclin D1 mRNA表達(dá)量均極顯著下調(diào)(P<0.01)。檢測蛋白水平結(jié)果顯示,淀粉組Wnt10b和C-myc蛋白表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01),β-catenin和Cyclin D1明顯受到抑制(圖7B、C)。結(jié)果提示玉米淀粉飼料抑制腸道Wnt信號通路的活性。

3 討論

斷奶期為仔豬生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵階段。在此期間,仔豬消化器官發(fā)育及功能還未健全,免疫力低下,容易受到飼料及其他各種因素影響而造成消化和吸收紊亂,進(jìn)而導(dǎo)致仔豬營養(yǎng)不良、生長受阻甚至死亡[1]。此時(shí)飼料的組成、形態(tài)和營養(yǎng)水平等因素尤為重要。本研究通過利用常用的能量原料玉米和玉米淀粉配制飼料飼喂斷奶仔豬,并平衡2組的能量和營養(yǎng)水平,探究兩者影響腸屏障發(fā)育的差異。研究結(jié)果顯示玉米淀粉組仔豬的生長性能降低,機(jī)體代謝受到抑制,十二指腸的pH值增加,且絨毛的生長受到抑制。分子水平研究顯示,玉米淀粉組仔豬十二指腸黏膜分化、增殖基因和屏障相關(guān)基因表達(dá)受到抑制,且Wnt/β-catenin信號通路活性降低,表明相對玉米飼料,玉米淀粉飼料可抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性抑制腸道黏膜屏障發(fā)育,進(jìn)而可能影響仔豬的健康和生長性能。比較2種飼料的營養(yǎng)水平發(fā)現(xiàn),其中淀粉組的中性洗滌纖維含量明顯較低,其可能是導(dǎo)致腸道屏障發(fā)育差異的因素之一。

A．qRT-PCR檢測仔豬十二指腸黏膜Wnt/β-catenin號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)量;B．Western blot檢測仔豬十二指腸黏膜Wnt/β-catenin信號通路蛋白條帶;C．蛋白灰度掃描結(jié)果

中性滌纖維(NDF)是植物細(xì)胞壁中大部分結(jié)構(gòu)性成分(即纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等不可溶纖維和不溶灰分),能夠較準(zhǔn)確的反映纖維的實(shí)際含量。早前已有報(bào)道指飼料中纖維對生豬養(yǎng)殖的重要性。多項(xiàng)研究表明提高飼料中纖維素比例,可提高日糧的營養(yǎng)價(jià)值和高蛋白質(zhì)消化率。利用添加小麥麩等不同纖維原料可改變食糜的水結(jié)合能力以及在消化道停留時(shí)間均會增加,影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[11]。添加5%的玉米纖維能顯著降低斷奶仔豬料肉比分、總能量、有機(jī)物、干物質(zhì)消化率,顯著增加粗纖維和磷消化率等,顯著影響仔豬生長[12]。此外,膳食纖維會使胃部分蛋白質(zhì)水解增加,回腸蛋白質(zhì)表觀消化率提高6%,糞便蛋白質(zhì)表觀消化率顯著提高5%[13];回腸淀粉酶的活性提高43%[14]。但斷奶仔豬腸道容積小,發(fā)育不成熟且由于斷奶應(yīng)激導(dǎo)致腸道損傷,對纖維素的消化能力弱,常常需要限制粗纖維的含量。而適當(dāng)?shù)睦w維有助于緩解仔豬斷奶時(shí)的不適并促進(jìn)其生長。在31日齡的斷奶仔豬飼中額外添加1%的粗纖維濃縮物可以顯著增加仔豬平均日增質(zhì)量、平均日采食量和飼料利用率,以及早期的生長激素水平,從而提高仔豬的生長[15]。同時(shí)添加可溶性纖維和不溶性纖維的日糧更有效改善血液生化指標(biāo)、營養(yǎng)物質(zhì)消化率、后腸微生物和腸道屏障功能;如同時(shí)加入0.5%可溶性纖維和0.5%不可溶性纖維能顯著上調(diào)了回腸屏障功能相關(guān)基因(OCLN、CLDN-1、MUC1和IL-10);增加了回腸食糜中的乳酸菌數(shù)量等[16]。本研究發(fā)現(xiàn)低中性洗滌纖維的淀粉飼料組斷奶仔豬的增重受到抑制,采食量減少,通過血液生化指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)機(jī)體肝臟代謝和脂肪代謝均受到抑制。推測,中性洗滌纖維可能是影響斷奶仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化率重要因素,同時(shí)也可能是影響腸道黏膜的重要因素,影響仔豬機(jī)體代謝。

腸道黏膜上皮細(xì)胞主要完成營養(yǎng)素的感應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收,是維持腸道自身和機(jī)體營養(yǎng)代謝的基礎(chǔ),其中杯狀細(xì)胞可分泌黏液形成黏液層[17]、潘氏細(xì)胞分泌免疫因子[18]與緊密連接一起構(gòu)筑腸道屏障,共同維持腸道的穩(wěn)態(tài)和機(jī)體正常的生長發(fā)育過程[19]。飼料中添加纖維素會刺激腸道發(fā)育,比如增加腸道絨毛細(xì)胞增殖、絨毛的生長和隱窩的加深[14]。分別給斷奶仔豬飼喂NDF水平為6.7%,7.7%,8.7%和9.7%的飼糧,其中9.7% NDF飼糧可以顯著增加仔豬小腸各段的絨毛高度和隱窩深度及改善仔豬腹瀉[9]。本研究通過腸道HE染色觀察腸絨毛形態(tài)發(fā)現(xiàn)低中性洗滌纖維淀粉飼料會導(dǎo)致腸道的絨毛變稀,細(xì)胞數(shù)量變少;基因表達(dá)水平顯示,腸道黏膜屏障相關(guān)基因CDX2、PCNA、OCLN、CLDN1和TNFα表達(dá)量顯著降低,與前期報(bào)道在飼料中添加不可容纖維[16]或較高纖維含量[9]可更有效刺激仔豬腸道絨毛發(fā)育相符,提示降低中性洗滌纖維可能會影響腸道黏膜的發(fā)育。日糧中適宜的纖維素水平,對促進(jìn)斷奶仔豬腸道微生態(tài)平衡也有積極作用[16,20]。此外,飼料中的纖維素導(dǎo)致的未消化蛋白減少,能減少腸胃微生物由于未消化蛋白和斷奶應(yīng)激造成的微生物失衡,有利于預(yù)防仔豬斷奶后腹瀉影響仔豬的生長性能[21]。本研究中玉米淀粉可顯著增加十二指腸的pH值,可能會造成十二指腸微生物失衡以及蛋白質(zhì)的消化效果不佳?？赏茰y低中性洗滌纖維不利于刺激腸道黏膜的發(fā)育,影響腸道并降低屏障功能不利于相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)的充分消化吸收和抵御外界致病因子,導(dǎo)致仔豬腹瀉。其對腸道微生物屏障的調(diào)節(jié)仍需進(jìn)一步分析。

Wnt信號通路是哺乳動物腸道分化和免疫的重要信號通路[22]。其在腸道上皮隱窩底部非?；钴S,可以促進(jìn)干細(xì)胞自我更新和分化,在維持腸道干細(xì)胞和前體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮著重要作用,同時(shí)在促進(jìn)潘氏細(xì)胞的成熟和分泌免疫因子方面非常關(guān)鍵[23],這有利于維持腸道各種屏障的完整。在小鼠活體水平和類器官水平研究表明SIRT2缺陷可促進(jìn)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)使潘氏細(xì)胞譜系增加,腸道上皮增殖增加[24]。在體外培養(yǎng)腸道類器官時(shí),Wnt3a分泌因子可與Lgr4/5配體R-spondin協(xié)同作用,誘導(dǎo)潘氏細(xì)胞的成熟[25]。其中腸道上皮潘氏細(xì)胞頂部有防御素、溶菌酶、磷脂酶A2和sIgA等多種抗菌分子,成為腸道黏膜屏障的免疫效應(yīng)分子,是宿主防御細(xì)菌、真菌、病毒或者原蟲等入侵的重要分子屏障,并影響相關(guān)部位的微生物群體的組成[26]。本研究結(jié)果顯示,淀粉飼料會導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路的活性顯著受到抑制,可能會抑制腸道黏膜細(xì)胞的分化和增殖,抑制潘氏細(xì)胞的成熟和免疫因子的分泌,影響腸道黏膜物理屏障和免疫屏障的分子機(jī)制,最終影響腸道的發(fā)育和功能。