何書海,張 曬 ,邢一科,成子強(qiáng)

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院 動物科技學(xué)院,河南 信陽 464000; 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院,山東 泰安 271018)

禽白血病是家禽三大腫瘤性疾病之一,該病是由禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)所誘發(fā)。其中,J亞群禽白血病病毒(subgroup J avian leukemia virus,ALV-J)侵害禽類造血前體細(xì)胞后可導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化為髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞[1]。因此ALV-J誘發(fā)的白血病又被稱之為禽髓細(xì)胞性白血病。由于受到機(jī)體內(nèi)源性ALV的干擾,以及ALV-J感染雞有間歇排毒的特點[2-3],使用ELISA檢測的S/P值有時并不能準(zhǔn)確反映實際感染情況[4-5];最近有報道提示A亞群禽白血病病毒(ALV-A)也可以引起禽髓細(xì)胞性白血病[6]。上述這些情況使得在臨床中要明確該病的類型就變得更為困難,因此需要結(jié)合病原檢查和病理形態(tài)檢查進(jìn)行綜合判斷。

ALV-J誘導(dǎo)的髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞在形態(tài)上主要是異常增殖的帶有嗜酸顆粒的中、晚幼粒細(xì)胞[7],其與正常的髓系細(xì)胞在形態(tài)上很相似。由于鳥類的髓系造血細(xì)胞經(jīng)歷多個發(fā)育階段,在形態(tài)上具有多樣性,這也增加了禽髓細(xì)胞性白血病的病理形態(tài)學(xué)診斷難度。研究中也發(fā)現(xiàn),正常雞的法氏囊和脾臟等器官中存在數(shù)量不等的中、晚幼粒細(xì)胞,但這種現(xiàn)象并未引起研究人員的注意,也未見相關(guān)研究報道。禽白血病髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞與正常髓系細(xì)胞的相似性給初涉該領(lǐng)域的獸醫(yī)病理工作者帶來不少困惑,甚至出現(xiàn)禽白血病病原檢測結(jié)果和病理形態(tài)檢查結(jié)果相矛盾的現(xiàn)象,誤診漏診現(xiàn)象時有發(fā)生。

因此,本研究結(jié)合ALV-J人工感染病例和ALV-J自然感染病例的診斷結(jié)果,系統(tǒng)觀察和分析該病毒誘導(dǎo)的髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞在各組織器官中的形態(tài)特點,并與不同分化階段的正常髓系細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)比較和鑒別;旨在明確ALV-J誘導(dǎo)的髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞的病理形態(tài)特征,并提出減少誤診或漏診本病的病理形態(tài)診斷要點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器ALV群特異性p27抗原ELISA檢測試劑盒(哈爾濱國生生物科技公司,產(chǎn)品批號:HG102200);TRIzolTM試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,產(chǎn)品批號:R0016);2720 型RT-PCR儀(美國Thermo Fisher公司);KD-3368-VI石蠟切片機(jī)(浙江省金華科迪公司);OLYMPUS CHC型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS株式會社);MD90 數(shù)碼成像裝置(廣州明美公司)。

1.2 自然感染病例部分養(yǎng)雞場送檢的不同批次ALV-J陽性肉雞、蛋雞或肉蛋兼用地方品種雞,臨床病理剖檢后采集肝臟、腎臟、脾臟、法氏囊等器官備用。

1.3 人工感染病例無特定病原體(SPF)來航雞6日齡雞胚(購自濟(jì)南斯帕法斯公司)尿囊腔內(nèi)注射100 μL(10-4TCID50/mL)ALV-J病毒(NX0101株)液;對照組雞胚注射等劑量的DMEM培養(yǎng)基。2組雞胚分別置于隔離孵化箱中孵育至出殼,孵化后ALV-J感染組(n=30)和對照組(n=30)雞置隔離罩中飼養(yǎng)。按試驗要求對各組雞進(jìn)行定期剖檢,并采肝臟、腎臟、脾臟及法氏囊等器官備用。

1.4 ALV群特異性p27抗原ELISA檢測采集被檢雞泄殖腔棉拭子樣本,反復(fù)凍融后,800 ×g離心10 min后取上清,ELISA方法檢測ALV的p27抗原。檢測方法按照ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 血涂片制備與染色翼下靜脈采血,推制成厚薄適宜的血涂片。血涂片在空氣中干燥后,用瑞氏染液染色1 min,再加等量的緩沖液與染液混合再染5 min。蒸餾水沖洗多余染液后自然干燥、鏡檢并攝片。

1.6 ALV-J RT-PCR檢測根據(jù) GenBank 中登錄的HPRS103 (Z46390.1)的基因序列,設(shè)計ALV-J檢測引物。引物堿基序列: F:GGATGAGGTGACTAAGAAAG;R:GAACCAAAGGTAACA-CGT,引物由華大基因公司合成。RT-PCR步驟如下:首先取被檢雞的肝臟,按TRIzolTM試劑盒的說明書提取肝臟組織的總RNA;在分光光度計測定 RNA的濃度及純度符合要求之后,再將所提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;然后以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系為25.0 μL:RT-PCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板DNA 1.0 μL,ddH2O補足25.0 μL。ALV-J的反應(yīng)程序:95℃ 5 min,95℃ 30 s,51℃ 30 s,72℃ 30 s,30個循環(huán);72℃ 10 min 后置 4℃保存);最后對RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.7 病理組織形態(tài)學(xué)檢查將RT-PCR檢測結(jié)果呈陽性的臨床送檢雞、ALV-J人工感染雞以及正常未感染雞的肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊等器官置于4%多聚甲醛中固定,然后按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟組織切片制片及HE染色。染色后鏡檢并攝片。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測結(jié)果ELISA檢測結(jié)果顯示人工感染的ALV-J感染雞體內(nèi)ALV p27抗原陽性,對照組雞體內(nèi)病毒p27抗原陰性(圖1)。另外,在對臨床送檢病例進(jìn)行ALV p27抗原ELISA檢測時發(fā)現(xiàn)部分雞泄殖腔棉拭子樣本p27檢測結(jié)果呈陽性。

圖1 p27抗原ELISA檢測結(jié)果

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果RT-PCR檢測結(jié)果顯示,在人工感染雞的肝臟中均有ALV-J的存在(圖2)。另外,在臨床送檢病例中,均以ALV-J的RT-PCR產(chǎn)物陽性結(jié)果判定為感染該病毒。

M.DL2000 DNA Marker;1～8.8個被檢樣本;P.陽性對照;N.陰性對照

2.3 ALV-J人工感染雞髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞與正常雞髓系細(xì)胞的形態(tài)特征

2.3.1石蠟組織切片中髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞形態(tài)特征 從雞胚發(fā)育第16天開始,連續(xù)觀察了ALV-J人工感染雞臟器中髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果顯示,在人工感染ALV-J病例中,最早可在20日齡雞的肝臟及腎臟觀察到髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞(圖3A、B)。髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞直徑為8～10 μm,胞核約占細(xì)胞體積的1/2、偏在、未分葉,瘤細(xì)胞胞質(zhì)中充滿粗大的嗜酸顆粒(圖3A M),可見病理核分裂象;并可見少數(shù)早幼粒細(xì)胞,細(xì)胞核約占細(xì)胞體積的2/3;胞漿內(nèi)無顆粒(圖3A Pr)。

在正常組,雞胚發(fā)育第16天即可在法氏囊和脾臟中觀察到處于不同發(fā)育階段的髓系細(xì)胞。這些細(xì)胞一部分是由來源于骨髓的造血祖細(xì)胞(圖3C H)定植于法氏囊上皮芽中發(fā)育而來的,最終定植于法氏囊間質(zhì)結(jié)締組織中逐漸分化為髓系粒細(xì)胞(圖3C G);這些細(xì)胞多為晚幼粒細(xì)胞,胞核較小,約為細(xì)胞的1/3大小,嗜酸顆粒較為細(xì)小。另一部分造血祖細(xì)胞會逐步分化為淋巴細(xì)胞,并形成法氏囊濾泡(圖3E Fo)。同時,來源于骨髓的造血祖細(xì)胞隨血道遷移至脾臟中,最終分化為淋巴細(xì)胞與髓系粒細(xì)胞(圖3D)。在孵化后36 d,正常雞的法氏囊和脾臟中依然存在大量成熟的嗜酸粒細(xì)胞和少量晚幼粒細(xì)胞,其大小為5～8 μm(圖3E、F)。

2.3.2血涂片中髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞形態(tài)特征 因制作石蠟組織切片會造成細(xì)胞體積收縮,為明確髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞的實際大小,進(jìn)一步開展了血涂片檢測。血涂片結(jié)果顯示,上述20日齡ALV-J陽性雞血液中存在大量的髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞,髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞直徑12～14 μm,外觀與早幼粒細(xì)胞細(xì)和中幼粒細(xì)胞相似(圖4A M)。胞核占細(xì)胞體積的2/3～1/2、核偏在、未分葉。部分瘤細(xì)胞胞質(zhì)中充滿粗大嗜酸圓形顆粒;另一部分瘤細(xì)胞處于分化早期,胞漿內(nèi)無肉眼可見的顆粒。在對照組正常雞血液中不存在早幼粒細(xì)胞或中幼粒細(xì)胞,只有少量的異嗜粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,大小7～9 μm(圖4B He、Ly)。

2.3.3臨床檢測病雞體內(nèi)髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞形態(tài)特征 病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示,在送檢自然感染病例中,RT-PCR檢測結(jié)果呈ALV-J陽性的部分病雞體內(nèi)存在典型的髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞。這些瘤細(xì)胞直徑約10 μm,細(xì)胞核約占細(xì)胞1/2大小、未分葉、偏在,瘤細(xì)胞胞質(zhì)中充滿粗大嗜酸圓形顆粒(圖5A、B),且可見病理核分裂象。

A.20日齡ALV-J陽性雞肝臟髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞;B.20日齡ALV-J陽性雞腎臟髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞;C.16日齡正常雞胚法氏囊髓系細(xì)胞;D.16日齡正常雞胚脾臟髓系細(xì)胞;E.28日齡正常雞法氏囊髓系細(xì)胞;F.28日齡正常雞脾臟髓系細(xì)胞;圖中M.髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞;Pr.早幼粒細(xì)胞;H.造血祖細(xì)胞;G.成熟粒細(xì)胞;Fo.法氏囊濾泡

A.20日齡ALV-J陽性雞血液髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞;B.20日齡正常雞血細(xì)胞;圖中M.髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞;He.異嗜性粒細(xì)胞;Th.凝血細(xì)胞;Ly.大淋巴細(xì)胞

在臨床檢查中發(fā)現(xiàn),ALV-J和ALV-A的病雞組織器官中存在一些易與髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞混淆的細(xì)胞群體。為了與髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞相區(qū)別,在此一并描述這些細(xì)胞的形態(tài)特征。如圖5C所示,在肝臟匯管區(qū)血管內(nèi)外可見多數(shù)晚幼粒細(xì)胞,直徑約7 μm,胞核較小、多分葉,胞漿內(nèi)充滿大量嗜酸顆粒。如圖5D所示,在腎臟可見大量變性壞死的腎小管上皮細(xì)胞,直徑為8～10 μm,胞漿深染,胞核濃縮呈深藍(lán)色。如圖5E所示,在腸組織固有層與黏膜層交界處散在大量的晚幼粒細(xì)胞,直徑約7 μm,胞核較小、多分葉,胞漿內(nèi)充滿大量的嗜酸顆粒。如圖5F所示,在腎臟間質(zhì)血管中存在大量的晚幼紅細(xì)胞,直徑約6 μm;細(xì)胞呈圓形或橢圓形,胞漿均質(zhì)紅染;胞核居中或偏在,呈圓形或橢圓形。

3 討論

ALV的檢測技術(shù)目前包括ELISA、IFA、PCR等,這些方法適用于不同檢測目的,各有優(yōu)缺點[8-9]。運用PCR進(jìn)行病毒核酸檢測雖然更加靈敏和可靠,但對于禽白血病這種典型的腫瘤病來說,病理形態(tài)學(xué)診斷對該病的診斷和分型依然不可或缺。因為陸續(xù)有研究顯示ALV-A除了引起經(jīng)典的禽淋巴細(xì)胞性白血病外,還可以誘發(fā)禽髓細(xì)胞性白血病[6];同樣,ALV-J不僅可以引起禽髓細(xì)胞性白血病,還可以誘發(fā)禽淋巴細(xì)胞性白血病[10]。

ALV-J誘導(dǎo)的髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞在形態(tài)上主要表現(xiàn)為含有嗜酸顆粒的中、晚幼粒細(xì)胞,需與正常雞組織器官中的髓系粒細(xì)胞相鑒別。研究已證實,ALV-J的靶細(xì)胞是前髓細(xì)胞;ALV-J感染前髓細(xì)胞后可整合到細(xì)胞基因組DNA,然后利用細(xì)胞機(jī)制復(fù)制合成子代病毒;ALV-J子代病毒可阻滯前髓細(xì)胞及髓細(xì)胞的發(fā)育,最終將其轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞,即髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞[11]。在正常雞的造血組織內(nèi),有著一定數(shù)量的髓系細(xì)胞(又稱粒系細(xì)胞)。髓系細(xì)胞在造血組織中經(jīng)過前髓細(xì)胞(包括原粒細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞)、髓細(xì)胞(中幼粒細(xì)胞)、后髓細(xì)胞(晚幼粒細(xì)胞)的演變,最終分化為成熟的粒細(xì)胞(異嗜性細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞)[12]。

本研究發(fā)現(xiàn),在雛雞的肝臟、脾臟、腎臟以及法氏囊中仍然有數(shù)量不等的晚幼粒細(xì)胞,這可能與這些器官延續(xù)了胚胎期的造血功能有關(guān)。因為雛雞的先天免疫比后天免疫更為發(fā)達(dá),且髓系細(xì)胞發(fā)揮著重要作用[13]。在形態(tài)上,這些處于不同發(fā)育分化階段的粒系細(xì)胞在形態(tài)上與髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞很相似。受制于ALV p27抗原ELISA檢測結(jié)果的不確定性,以及ALV感染雞有間歇排毒的特點,如果對雞正常髓系細(xì)胞的發(fā)育特點和形態(tài)特征認(rèn)識不足,在診斷禽髓細(xì)胞性白血病時很容易將正常髓系細(xì)胞誤診為瘤細(xì)胞。另外,在雞具有肝脾腫大等臨床特征時,也容易將某些增生的髓系細(xì)胞誤判為髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞;此時就需要綜合病毒核酸檢測結(jié)果和病理形態(tài)學(xué)結(jié)果共同鑒別診斷。在研究中,RT-PCR檢測結(jié)果與病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果間表現(xiàn)出了較高的一致性。血涂片中髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞大小最接近真實大小(13 μm左右),而石蠟組織切片中的瘤細(xì)胞稍小一些(9 μm左右),這是因為在制作組織切片時,組織細(xì)胞會有30%～40%的收縮[14]。

綜上所述,診斷禽髓細(xì)胞性白血病會受到認(rèn)識水平、ALV特性以及檢測方法等因素的影響;臨床上應(yīng)根據(jù)病原學(xué)檢查和病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析,防止誤診與漏診的發(fā)生。