陳 超，張 雯，渠廣民，封 靜 ，趙愛麗 ，陳修毅，李大偉,

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物緩釋制劑工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 國家藥監(jiān)局藥物制劑技術(shù)研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；3. 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

伴隨高通量篩選、組合化學(xué)和藥物分子輔助設(shè)計(jì)等新技術(shù)的發(fā)展，大量具有藥物活性的新化合物被篩選發(fā)現(xiàn)。其中，約有40 %新開發(fā)的化合物有難溶性問題[1]。脂質(zhì)納米粒、納米膠束、環(huán)糊精包合技術(shù)是常見的提升藥物溶解性的方法。但這些技術(shù)往往需要借助納米載體，因此，載藥量通常不高。而納米晶技術(shù)（nanocrystal technology）無需借助載體，可將藥物顆粒尺度處理至亞微米級(jí)（100～1000 nm）甚至毫微米級(jí)（1～100 nm）[2-3]。作為提升難溶性藥物溶解度的一種藥物制劑新技術(shù)，納米晶技術(shù)可分為3類：top-down，bottom-up和此兩種方法的聯(lián)合應(yīng)用。介質(zhì)研磨作為經(jīng)典的topdown納米晶制備技術(shù)，具有工藝重現(xiàn)性好、易于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用最廣泛的納米晶制備技術(shù)之一。介質(zhì)研磨分為干法研磨和濕法研磨兩種，工業(yè)上主要采用濕法介質(zhì)研磨。濕法介質(zhì)研磨[4-5]制備的藥物納米晶體粒徑尺度小，比表面積大，可改善溶解度和溶出速率，同時(shí)其表面黏附性更大，與生物膜黏附作用時(shí)間長，有利于提高生物利用度。與傳統(tǒng)的需借助載體遞送的納米技術(shù)相比，納米晶體藥物自身即為遞送體，無需添加增溶作用的大量表面活性劑和載體輔料，有更高的安全性和載藥量，適用于生物藥物分類系統(tǒng)（BCS）中的Ⅱ和IV類藥物，特別是對(duì)高劑量難溶性藥物的成藥性開發(fā)有極大幫助[6-7]。

他克莫司（tacrolimus，又稱 FK506）是tsukubaensis鏈菌屬來源的強(qiáng)效大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，通過與細(xì)胞內(nèi)蛋白FKBP-12 結(jié)合形成復(fù)合物，抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸激酶活性，降低白介素-2的轉(zhuǎn)錄水平，抑制T淋巴細(xì)胞活化，發(fā)揮免疫抑制作用[8]。FK506可用于多種免疫介導(dǎo)的眼病治療，單獨(dú)或與激素聯(lián)用治療一些難治的眼表炎癥性疾病，如Stevens-Johnson綜合征、眼瘢痕性類天皰瘡、鞏膜炎等[9]。但FK506幾乎不溶于水，不易透過角膜等眼組織產(chǎn)生有效的藥物濃度，因此生物利用度較低。由于眼部生物溶媒較少，改善FK506的溶解度對(duì)其眼部給藥至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)以FK506為模型藥物，采用濕法介質(zhì)研磨工藝制備FK506納米混懸液，探討該工藝制備的可行性，為開發(fā)高溶解度和療效的FK506制劑提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PM100實(shí)驗(yàn)室行星式球磨儀（德國弗爾德萊馳），氧化鋯球介質(zhì)（直徑： 0.1～0.9 mm，萍鄉(xiāng)銳孚）；Zetasizer Nano ZS90納米粒度儀（英國馬爾文）；JY10002型電子天平（上海舜宇恒平）；超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器）。

1.2 試藥

他克莫司（福建科瑞藥業(yè)）；泊洛沙姆188（藥用級(jí)，德國BASF）；水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥物FK506納米混懸液的制備

稱取適量泊洛沙姆188加入純水中溶解混合。稱取適量FK506原料加至上述溶液中，超聲5 min，待藥物充分潤濕分散后，將混懸液置入100 ml研磨罐，緩慢加入一定量的氧化鋯球研磨介質(zhì)。安裝研磨罐，設(shè)定球磨儀研磨轉(zhuǎn)速和研磨時(shí)間并運(yùn)行。待設(shè)定研磨參數(shù)運(yùn)行結(jié)束后過濾研磨溶液除去研磨介質(zhì)，即得FK506納米混懸液。

2.2 納米晶混懸液粒徑評(píng)價(jià)指標(biāo)

按照動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定所制備納米混懸液樣品中藥物晶體粒徑。取適量納米混懸液樣品，純水稀釋至適宜濃度，采用馬爾文納米粒徑儀測(cè)定藥物晶體的平均粒徑（Z-Ave）及多分散度指數(shù)（PDI），設(shè)定介質(zhì)系數(shù)1.333，測(cè)定溫度為25 ℃，平行測(cè)定3次，取其平均值。

2.3 納米晶混懸液制備工藝參數(shù)篩選研究

運(yùn)用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以Z-Ave和PDI為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察研磨轉(zhuǎn)速、研磨時(shí)間、藥物濃度、穩(wěn)定劑用量、研磨介質(zhì)規(guī)格對(duì)藥物晶體粒徑的影響，篩選較優(yōu)納米晶制備工藝參數(shù)。

2.3.1 研磨轉(zhuǎn)速考察 固定研磨時(shí)間為3 h，藥物濃度為1 %，穩(wěn)定劑泊洛沙姆188用量為1 %，研磨介質(zhì)規(guī)格為0.5 mm，考察濕法介質(zhì)研磨轉(zhuǎn)速，分別采用400，500，600 r/min研磨轉(zhuǎn)速制備納米混懸液。所得納米混懸液藥物晶體Z-Ave和PDI，結(jié)果見圖1。由圖1可見，F(xiàn)K506的Z-Ave隨研磨轉(zhuǎn)速增加，呈減小趨勢(shì)。在轉(zhuǎn)速500和600 r/min時(shí)，粒徑雖略有減小，但無顯著變化。高轉(zhuǎn)速機(jī)械運(yùn)動(dòng)下，藥物顆粒之間、研磨介質(zhì)與藥物顆粒之間碰撞更劇烈，產(chǎn)熱現(xiàn)象嚴(yán)重，混懸液溫度過高，對(duì)于藥物粒徑穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響，且高速運(yùn)轉(zhuǎn)加速損耗了球磨設(shè)備的使用壽命。因此，優(yōu)選研磨轉(zhuǎn)速為500 r/min。

圖1 不同研磨轉(zhuǎn)速制備納米混懸液Z-Ave和PDI測(cè)定結(jié)果

2.3.2 研磨時(shí)間考察 固定研磨轉(zhuǎn)速500 r/min，藥物濃度1 %，穩(wěn)定劑泊洛沙姆188用量1 %，采用規(guī)格0.5 mm研磨介質(zhì)，分別于研磨60，120，180，240 min取樣，測(cè)定混懸液中藥物Z-Ave和PDI，結(jié)果見圖2。由圖2可見，在一定研磨時(shí)間（180 min）內(nèi)，藥物Z-Ave隨研磨時(shí)間增加，呈減小趨勢(shì)，且與研磨時(shí)間呈正相關(guān)，藥物粒徑從微米級(jí)逐漸減小至納米級(jí)別。繼續(xù)延長研磨時(shí)間，藥物Z-Ave反而增加，原因可能是長時(shí)間研磨增大能量輸入，使小粒徑顆粒聚集增長以維持穩(wěn)定。研磨時(shí)間并非越長越好，優(yōu)選研磨時(shí)間為180 min。

圖2 不同研磨時(shí)間制備納米混懸液Z-Ave和PDI測(cè)定結(jié)果

2.3.3 穩(wěn)定劑用量的考察 固定研磨轉(zhuǎn)速500 r/min，研磨時(shí)間為3 h，藥物濃度1 %，研磨介質(zhì)規(guī)格0.5 mm，選取泊洛沙姆188為穩(wěn)定劑，分別配制泊洛沙姆188：FK506濃度處方比例為1:2，1:1，2:1的混懸液，即泊洛沙姆188濃度分別為0.5 %，1 %，2 %，考察不同穩(wěn)定劑用量（以泊洛沙姆188:FK506比例計(jì)）對(duì)混懸液粒徑的影響。測(cè)定納米混懸液中藥物晶體Z-Ave和PdI，結(jié)果見圖3。由圖3可見，固定其它研磨工藝參數(shù)，不同穩(wěn)定劑用量下，藥物Z-Ave隨穩(wěn)定劑用量的增加而增加，但增加幅度較小，差異無顯著性。隨穩(wěn)定劑用量增加，混懸液PDI值呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，結(jié)果表明，低用量泊洛沙姆188下，混懸液中納米晶粒徑分布相對(duì)更窄，研磨效果更優(yōu)。泊洛沙姆188在研磨過程中易產(chǎn)生泡沫，用量越大，產(chǎn)生泡沫量越大，對(duì)后續(xù)過濾操作有不利影響。因此，優(yōu)選穩(wěn)定劑泊洛沙姆188:FK506濃度處方比例為1:2。

圖3 不同穩(wěn)定劑用量（泊洛沙姆188:FK506）混懸液Z-Ave和PDI測(cè)定結(jié)果

2.3.4 藥物濃度考察 固定研磨轉(zhuǎn)速500 r/min，研磨時(shí)間為3 h，穩(wěn)定劑用量泊洛沙姆188:FK506為1:2，研磨介質(zhì)規(guī)格0.5 mm，分別配制藥物濃度為0.2 %，1 %和5 %的混懸液進(jìn)行制備考察，研磨結(jié)束測(cè)定混懸液中藥物Z-Ave和PDI，結(jié)果見圖4。由圖4可見，隨藥物濃度增加，混懸液中藥物Z-Ave先減小后增加。藥物濃度較小時(shí)，研磨效率較低，粒徑較大。藥物濃度過高，藥物顆粒間碰撞增加，小粒徑顆粒聚集增長。因此優(yōu)選研磨混懸液藥物濃度為1 %。

圖4 不同藥物濃度混懸液Z-Ave和PDI測(cè)定結(jié)果

2.3.5 研磨介質(zhì)規(guī)格考察 固定研磨轉(zhuǎn)速500 r/min，研磨時(shí)間為3 h，穩(wěn)定劑用量泊洛沙姆188:FK506為1:2，藥物濃度1 %，以氧化鋯球?yàn)檠心ソ橘|(zhì)，分別選用規(guī)格為0.1，0.3，0.5和0.9 mm的研磨介質(zhì)制備納米混懸液。測(cè)定混懸液中藥物晶體Z-Ave和PDI，結(jié)果見圖5。由圖5可見，隨研磨介質(zhì)規(guī)格增大，藥物Z-Ave變化趨勢(shì)呈先減小后增加。研磨介質(zhì)規(guī)格越小，可研磨接觸的比表面積越大，研磨效率越高，得到的顆粒粒徑越小。但同時(shí)在相同介質(zhì)用量下，研磨介質(zhì)規(guī)格越小，研磨介質(zhì)間、研磨介質(zhì)與研磨腔室間碰撞也增加，研磨能量損耗亦增加，研磨效率降低，介質(zhì)磨損和剝落風(fēng)險(xiǎn)也增加。因此優(yōu)選研磨介質(zhì)規(guī)格為0.3 mm。

圖5 不同研磨介質(zhì)規(guī)格制備混懸液Z-Ave和PDI測(cè)定結(jié)果

2.4 納米混懸液制備優(yōu)選工藝參數(shù)重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)K506納米混懸液制備優(yōu)選工藝參數(shù)為：研磨轉(zhuǎn)速500 r/min、研磨時(shí)間180 min、藥物濃度1 %、穩(wěn)定劑泊洛沙姆188濃度0.5 %、研磨介質(zhì)規(guī)格0.3 mm。采用以上優(yōu)選制備工藝參數(shù)進(jìn)行3批試驗(yàn)驗(yàn)證重復(fù)性，Z-Ave和PDI測(cè)定結(jié)果見表1。不同批間混懸液中藥物晶體Z-Ave為464.6±21.71 nm，PDI為0.252±0.01。

表1 納米混懸液制備優(yōu)選工藝參數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.5 納米混懸液放置穩(wěn)定性考察

將采用優(yōu)選工藝參數(shù)所制備的納米混懸液于常溫下放置30 d，分別于1，3，5，10，30 d測(cè)定Z-Ave，考察藥物晶體粒徑在室溫條件下放置過程中的粒徑變化，為后續(xù)處方工藝的執(zhí)行和改進(jìn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。納米混懸液放置穩(wěn)定性試考察結(jié)果見表2。

表2 納米混懸液室溫放置穩(wěn)定性考察結(jié)果

由表2可見，該工藝制備的納米混懸液室溫放置30天，Z-Ave無顯著增長，混懸液PDI較零時(shí)有所增長。納米混懸液作為熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，納米晶顆粒在放置過程中易發(fā)生顆粒聚集和團(tuán)聚形成大顆?；虺练e結(jié)塊?；鞈乙篜DI增長，表明在放置過程中混懸液粒度分布變寬，提示混懸液中大顆粒晶體增加的風(fēng)險(xiǎn)增加，需進(jìn)一步優(yōu)化混懸液處方工藝，獲得更好的穩(wěn)定性。

3 討論

濕法介質(zhì)研磨工藝作為商業(yè)化應(yīng)用較廣泛的納米晶制備技術(shù)，利用研磨介質(zhì)、藥物顆粒、研磨腔室壁在高速離心運(yùn)動(dòng)下相互碰撞摩擦，對(duì)藥物顆粒進(jìn)行高能量剪切破碎。因此研磨轉(zhuǎn)速、研磨介質(zhì)、藥物顆粒濃度等對(duì)最終形成的藥物納米顆粒有重要影響。一般來說，研磨轉(zhuǎn)速越高，研磨腔室內(nèi)物料運(yùn)動(dòng)越快，研磨介質(zhì)、藥物顆粒及研磨腔室壁的碰撞頻率越高，研磨效率及效果越好。研磨介質(zhì)的球徑越小，比表面積越大，相比同等質(zhì)量的大球徑研磨介質(zhì)，物料間可接觸的面積越多，研磨過程中碰撞機(jī)率越高，研磨效率及研磨效果也較佳。同理，藥物濃度越高，可碰撞的粒子及接觸面積也增加，但在過高的藥物濃度下，藥物顆粒之間接觸的機(jī)率也增加，可能會(huì)引起易破碎小粒子的聚集增長，不利于納米晶的制備。同時(shí)過高的研磨轉(zhuǎn)速長時(shí)間研磨帶來的發(fā)熱影響不利于納米混懸液的穩(wěn)定。因此通常添加適宜的穩(wěn)定劑以最大限度的維持納米混懸液的穩(wěn)定性。根據(jù)Freundlich-Ostwald 方程[10]，納米混懸液作為熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，隨著放置時(shí)間延長，混懸液中藥物顆粒易發(fā)生Ostwald熟化，導(dǎo)致藥物顆粒的加速沉降，混懸液穩(wěn)定性變差。因此在制備過程中添加適量的穩(wěn)定劑是保持納米混懸液穩(wěn)定的有效措施。本研究選用非離子表面活性劑泊洛沙姆188作為穩(wěn)定劑，可有效潤濕藥物顆粒表面，吸附在藥物顆粒表面，發(fā)揮立體空間阻隔作用，提升體系的穩(wěn)定性。但當(dāng)穩(wěn)定劑用量過多時(shí)會(huì)促進(jìn)藥物顆粒間的橋接作用，反而導(dǎo)致Ostwald熟化發(fā)生。

本研究探索了濕法介質(zhì)研磨工藝制備難溶性藥物他克莫司納米混懸液的可行性。結(jié)果表明，濕法介質(zhì)研磨工藝制備納米混懸液，設(shè)備簡單易得，制備過程簡便易操作，所得產(chǎn)品粒徑分布窄，工藝重現(xiàn)性良好。