張福彥,朱保磊,陳曉杰,王嘉歡,程仲杰,范家霖,張建偉

(1.河南省科學(xué)院 同位素研究所有限責(zé)任公司,河南省核農(nóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450015;2.信陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南 信陽(yáng) 464000)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)最主要的口糧作物,在國(guó)家糧食安全戰(zhàn)略中具有極其重要的地位。從近年來(lái)國(guó)家冬小麥區(qū)域試驗(yàn)品系的遺傳多樣性和產(chǎn)量結(jié)果看,當(dāng)前我國(guó)小麥育種面臨資源狹窄、模式單一等問題,嚴(yán)重制約著小麥產(chǎn)量的提高[1-2]。從糧食生產(chǎn)的發(fā)展進(jìn)程來(lái)看,糧食產(chǎn)量的每次重大突破都與一些關(guān)鍵優(yōu)異種質(zhì)資源的利用密切相關(guān),其已成為制約我國(guó)糧食增產(chǎn)潛力的關(guān)鍵因素[3]。航天誘變是利用特殊空間環(huán)境,使植物性狀發(fā)生改變,之后經(jīng)過地面人工選育出新品種、新材料以及特色基因資源的育種技術(shù),為解決目前生產(chǎn)上小麥新品種同質(zhì)化嚴(yán)重、親本資源遺傳基礎(chǔ)狹窄等問題提供了有效途徑[4-5]。

1987年,我國(guó)首次利用返回式衛(wèi)星將第1批農(nóng)作物種子帶到太空,開始進(jìn)行航天誘變育種研究,經(jīng)過幾十年的發(fā)展,我國(guó)航天育種技術(shù)研究和應(yīng)用得到迅速發(fā)展,已取得了大量突破性的成果[6-7]。目前,航天誘變研究已逐步深入到突變體基因變異、表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組變異特征等基因組學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域[8-9],但受天然異交混雜或人為混雜等因素影響,在一定程度上存在假突變體的可能性,而利用表型分析通常難以鑒定誘變后代突變體的真實(shí)性,這嚴(yán)重影響了突變體中功能基因的遺傳研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展,利用分子標(biāo)記技術(shù)可以有效鑒定誘變后代中優(yōu)異突變體的真實(shí)性[10]。

郭奕生等[11]篩選出4對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(Simple sequence repeats,SSR)核心引物用于不同水稻品種的真實(shí)性鑒定,從而為加強(qiáng)水稻品種權(quán)的保護(hù)及種子質(zhì)量監(jiān)測(cè)工作提供重要理論依據(jù)。張維宏等[12]以甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate,EMS)誘變處理小麥抗葉銹病近等基因系TcLr19的種子,共鑒定出146個(gè)M3感病突變體。為保證結(jié)果的可靠性,同時(shí)利用Lr19的分子標(biāo)記對(duì)突變體進(jìn)行分子篩選,鑒定出M36-2、M333-8、M333-9、M333-11、M344-4和M396-8等6個(gè)遺傳穩(wěn)定率達(dá)70%以上的M3感病突變材料,可用于抗病基因功能和機(jī)制研究。馬超等[13]以EMS誘變小麥-西爾斯山羊草Pm57易位系為材料,利用Pm57基因特異分子標(biāo)記和小麥全國(guó)區(qū)試品系進(jìn)行特異性、一致性和穩(wěn)定性(Distinctness,uniformity and stability,DUS)測(cè)試所用的42對(duì)SSR核心引物,鑒定篩選出70個(gè)Pm57基因白粉病抗性喪失的真實(shí)突變體。王春語(yǔ)等[14]利用擴(kuò)增目標(biāo)條帶較單一、多態(tài)性豐富的30個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)高粱EMS誘變突變體的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)篩選的≥3 bp重復(fù)的30個(gè)SSR分子標(biāo)記完全可以用于鑒定EMS誘變高粱突變體的真?zhèn)?。以上說明,采用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)水稻、小麥、高粱等誘變突變體真實(shí)性鑒定是完全可行的。但SSR標(biāo)記受位點(diǎn)數(shù)量和方法的限制,無(wú)法從全基因組水平上對(duì)突變體進(jìn)行高通量真實(shí)性鑒定。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是普遍存在于生物基因組中的一種新型分子標(biāo)記,是在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,具有在基因組中分布密度高、代表性強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定性高、易實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化檢測(cè)和分析等優(yōu)點(diǎn)[15-16]。耿皆飛等[17]利用90K SNP芯片對(duì)小麥品系H261及其EMS突變體進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)突變體與其親本的相同SNP位點(diǎn)的一致性高達(dá)99.2%以上,且二者之間沒有發(fā)現(xiàn)純合差異SNP,認(rèn)為突變體與親本H261的遺傳背景高度一致,是經(jīng)過EMS誘變的后代,可以進(jìn)行后續(xù)的功能基因遺傳研究。楊麗娟等[18]采用15K SNP芯片數(shù)據(jù)分析了15份黑、紫色小麥種質(zhì)資源的遺傳差異,共獲得7 116個(gè)有效SNP位點(diǎn),SNP多態(tài)性比率為77.12%,每條染色體上有128～682個(gè)SNP位點(diǎn),且在A、B、D染色體組中不均勻分布,SNP標(biāo)記的數(shù)量表現(xiàn)為B組>A組>D組,15份小麥種質(zhì)資源之間的遺傳相似度為44.58%～99.94%,可見SNP芯片技術(shù)可以準(zhǔn)確鑒定出不同小麥材料的遺傳相似度。

小麥籽粒發(fā)育狀況決定著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì),因此,籽粒遺傳發(fā)育機(jī)制一直是小麥研究的熱點(diǎn)之一。優(yōu)異籽粒突變體是小麥高產(chǎn)育種的重要親本資源,也是研究小麥籽粒發(fā)育機(jī)制和相關(guān)基因克隆的重要材料。小麥產(chǎn)量性狀突變體的鑒定對(duì)于解析小麥籽粒發(fā)育和產(chǎn)量形成均具有重要意義。Wu等[19]利用誘變技術(shù)獲得產(chǎn)量性狀相關(guān)突變體Meh0239,與野生型相比,該突變體從苗期開始表現(xiàn)出明顯的表型差異,包括株高降低,葉片變寬變短,穗、小穗和籽粒縮短以及小穗分布更加緊密等,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),由于小麥7DS染色體上的一個(gè)隱性突變(Yt1)致使小麥植株體內(nèi)脫落酸、吲哚-3-乙酸等內(nèi)源性激素水平的改變,從而導(dǎo)致該突變體產(chǎn)量相關(guān)性狀表現(xiàn)明顯差異。Zhang等[20]從利用EMS誘變小麥品種煙農(nóng)15產(chǎn)生的突變體庫(kù)中獲得大粒突變體M8008,構(gòu)建其F2及其衍生的F2:3群體,并對(duì)控制籽粒大小相關(guān)基因進(jìn)行精細(xì)定位、克隆以及功能分析等,發(fā)現(xiàn)大粒親本M8008在2D染色體上控制粒寬和千粒質(zhì)量的QTL(QGw和QTgw)具有減少粒寬和降低千粒質(zhì)量的作用。截至目前,國(guó)內(nèi)外研究人員基于各種需求已構(gòu)建多個(gè)小麥突變?nèi)后w或突變體庫(kù),并對(duì)單個(gè)突變性狀進(jìn)行評(píng)估,但同時(shí)利用SSR標(biāo)記和SNP芯片對(duì)航天誘變小麥突變體進(jìn)行真實(shí)性鑒定的研究尚無(wú)報(bào)道。本研究以河南省科學(xué)院同位素研究所前期利用實(shí)踐十號(hào)衛(wèi)星搭載創(chuàng)制周麥18 SP5籽粒突變?nèi)后w為材料,對(duì)其籽粒表型進(jìn)行分析,同時(shí)利用SSR標(biāo)記和55K SNP基因芯片技術(shù)對(duì)籽粒表型差異較為顯著突變體材料的真實(shí)性進(jìn)行鑒定,旨在為進(jìn)一步利用籽粒突變體進(jìn)行小麥遺傳改良、功能基因克隆、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等后續(xù)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

138份周麥18 SP5籽粒突變?nèi)后w是前期利用實(shí)踐十號(hào)衛(wèi)星搭載周麥18(ZM18)干種子而誘變創(chuàng)制的,且經(jīng)過連續(xù)多代自交后,各性狀已基本能夠穩(wěn)定遺傳。所有材料于2020年10月種植于河南省科學(xué)院新鄭試驗(yàn)基地,每個(gè)SP5突變體材料種植2行,且每隔20行種植2行野生型對(duì)照(CK),行長(zhǎng)2.5 m,行距0.25 m,每行播50粒種子,待出苗后每行定苗至30株左右,每個(gè)突變體株行按田間試驗(yàn)序號(hào)如ZM18-01、ZM18-02、ZM18-03等依次編號(hào)。田間管理同大田生產(chǎn),正常成熟后人工收獲,及時(shí)晾曬,儲(chǔ)藏備用。

1.2 表型測(cè)定

粒長(zhǎng)和粒寬測(cè)定:每個(gè)SP5突變體材料和野生型對(duì)照材料中均隨機(jī)取出20粒,重復(fù)3次,利用20 cm得力塑料直尺測(cè)量粒長(zhǎng)和粒寬。

千粒質(zhì)量測(cè)定:采用Contador型全自動(dòng)數(shù)粒儀(德國(guó)福弗公司)進(jìn)行種子計(jì)數(shù),每個(gè)突變體材料和野生型對(duì)照材料均取1 000粒,重復(fù)3次;并采用LT1002E型電子天平(常熟市天量?jī)x器公司)進(jìn)行稱質(zhì)量。

1.3 SSR標(biāo)記檢測(cè)

從籽粒表型差異較為顯著的突變體材料和野生型對(duì)照中各隨機(jī)選取5粒種子,混合粉碎后分別放入3個(gè)2 mL離心管中,采用SLS(十二酰肌氨酸鈉)法快速提取小麥籽粒DNA,具體操作根據(jù)Chen等[21]提取DNA的方法而改進(jìn)。

利用小麥染色體上分布均勻、多態(tài)性信息指數(shù)高、特異性和穩(wěn)定性較好的42對(duì)SSR引物[22]對(duì)部分SP5突變體及其親本進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為20 μL,主要包括10×Buffer 2.0 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4 μL,dNTP(200 μmol/L)1.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,模板DNA 2.0 μL,ddH2O 13.6 μL。在Tprofessional standard型PCR儀(Biometra)中進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55～65 ℃(依據(jù)不同引物的退火溫度改變)退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)程序結(jié)束后,取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,按照郭培國(guó)等[23]銀染方法進(jìn)行操作,用Fire Reader凝膠成像系統(tǒng)拍照,并保存至計(jì)算機(jī)以備統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 SNP芯片分析

委托北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司利用美國(guó)昂飛公司(Affymetrix,Inc.)研發(fā)的Axiom Wheat 55K 384S384 Layout芯片檢測(cè)SP5中籽粒表型差異較為顯著的突變體及其野生型對(duì)照材料的全基因組SNP,檢測(cè)方法編號(hào)AG-XN-WL01-01-2012,SNP芯片的多態(tài)性分析采用GeneChip?Operating Software(GCOS)Version 1.2軟件。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2013軟件進(jìn)行所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì),并對(duì)138份周麥18 SP5籽粒突變體材料及其野生型對(duì)照的粒長(zhǎng)、粒寬和千粒質(zhì)量等籽粒表型進(jìn)行差異顯著性分析。同時(shí)對(duì)籽粒表型差異較為顯著的4個(gè)突變體進(jìn)行SSR標(biāo)記檢測(cè)和SNP芯片分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒表型分析

野生型對(duì)照周麥18的粒長(zhǎng)、粒寬和千粒質(zhì)量分別為13.40 cm、7.00 cm和48.16 g,同等條件下,對(duì)138份周麥18 SP5突變體籽粒表型分析發(fā)現(xiàn),突變?nèi)后w的平均粒長(zhǎng)、粒寬和千粒質(zhì)量均顯著高于其野生型。突變?nèi)后w中以千粒質(zhì)量的變異最為豐富,變異系數(shù)較高,為8.30%;其次是粒長(zhǎng);而粒寬變化范圍最小,變異系數(shù)最低,僅為3.61%(表1)。

表1 周麥18 SP5籽粒突變體籽粒表型分析Tab.1 Analysis of grain phenotype of Zhoumai 18 SP5 grain mutants

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)籽粒表型差異較為顯著的突變體材料,從中選取4份千粒質(zhì)量差異較大的突變體ZM18-7、ZM18-26、ZM18-105和ZM18-112進(jìn)行表型分析和真實(shí)性鑒定。從圖1可知,周麥18突變型籽粒與其野生型的籽粒表型存在顯著差異(P<0.05)。大粒突變體ZM18-26和ZM18-112的千粒質(zhì)量、粒長(zhǎng)與野生型相比存在顯著性差異,小粒突變體ZM18-7和ZM18-105的千粒質(zhì)量、粒長(zhǎng)與野生型相比也均存在顯著性差異,但其粒寬與野生型相比差異不顯著。

不同小寫字母表示同一性狀變異存在顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).

2.2 突變體SSR標(biāo)記檢測(cè)

SSR標(biāo)記分子檢測(cè)結(jié)果表明,突變體ZM18-112與其野生型的差異標(biāo)記為18個(gè),多態(tài)性比例高達(dá)42.85%,而突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與其野生型的差異標(biāo)記分別為1,0,2個(gè),多態(tài)性比例分別為2.38%,0,4.76%(表2、圖2)。根據(jù)王立新等[24]提出的雜株判定標(biāo)準(zhǔn),在待測(cè)小麥品種的種子之間,比對(duì)核心SSR分子標(biāo)記位點(diǎn)的帶型,當(dāng)差異標(biāo)記≥3個(gè)位點(diǎn)的帶型不同時(shí),表示差異個(gè)體與親本之間的遺傳相似性低,存在異花授粉或機(jī)械混雜的可能性,即可判定為雜株。突變體ZM18-112與其野生型周麥18的差異標(biāo)記位點(diǎn)為18個(gè),故可以判定航天誘變突變體ZM18-112是由異花授粉或機(jī)械混雜產(chǎn)生的假突變體,而突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與其野生型周麥18的差異標(biāo)記位點(diǎn)均≤3個(gè),說明突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與野生型周麥18的遺傳背景基本一致,是經(jīng)過航天誘變而產(chǎn)生的真實(shí)突變體。

A.Barc80; B.Cfd72; C.Gwm285; D.Cfd29; E.Cfd76; F.Wmc522; G.Barc164;H.Gwm495; I.Barc345; J.Gwm44.1.ZM18-CK; 2.ZM18-112; 3.ZM18-105; 4.ZM18-26; 5.ZM18-7。

表2 周麥18 SP5突變體與野生型之間的42個(gè)SSR標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)Tab.2 Polymorphism of 42 SSR markers between SP5 mutants and wild type of Zhoumai 18

2.3 突變體SNP芯片分析

為進(jìn)一步鑒定突變體的真實(shí)性,同時(shí)分析航天誘變突變體的遺傳背景與其野生型之間的關(guān)系,利用Axiom Wheat 55K 384S384 Layout芯片的53 063個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)周麥18及其SP5中籽粒表型差異較為顯著的突變體進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3),突變體ZM18-112與野生型的差異SNP位點(diǎn)高達(dá)7 058個(gè),占SNP總數(shù)的13.301 2%,其中純合SNP位點(diǎn)多態(tài)性數(shù)量為2 609個(gè),占總數(shù)的4.9168%,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),這些差異SNP位點(diǎn)隨機(jī)分布在除1A和1D以外的染色體上;而突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與野生型的差異SNP位點(diǎn)分別為386,315,408個(gè),分別占總數(shù)的0.7274%,0.5936%,0.7689%,其中純合SNP位點(diǎn)多態(tài)性數(shù)量分別為110,63,166個(gè),分別占總數(shù)的0.2073%,0.1187%,0.3128%,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),這些差異SNP位點(diǎn)主要分布在2B和3D染色體上。上述SNP芯片分析結(jié)果從基因組水平上進(jìn)一步證實(shí)了ZM18-112與其野生型的遺傳背景差異較大,是假突變體,而ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7則為周麥18經(jīng)過航天誘變而產(chǎn)生的真實(shí)突變體,可進(jìn)行功能基因克隆、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等后續(xù)研究。

表3 周麥18 SP5突變體與野生型之間的SNP標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)Tab.3 Polymorphism of SNP marker between SP5 mutants and wild type of Zhoumai 18

3 結(jié)論與討論

航天誘變對(duì)小麥的株高、穗長(zhǎng)、產(chǎn)量以及品質(zhì)等性狀均有重要影響,航天誘變的性狀遺傳穩(wěn)定快,有益性狀的變異頻率高。王美芳等[25]研究發(fā)現(xiàn),小麥種子經(jīng)航天誘變后能引起后代表現(xiàn)型的廣泛變異,但不同品種和不同性狀對(duì)空間環(huán)境的敏感性、誘變效果不同,SP3株高、穗長(zhǎng)、產(chǎn)量性狀、品質(zhì)性狀的變異尤為突出。本研究?jī)H對(duì)航天誘變突變體的籽粒表型進(jìn)行分析,結(jié)果表明,周麥18 SP5突變?nèi)后w中的籽粒表型變異尤為豐富,以千粒質(zhì)量的變異系數(shù)最大,粒寬變異系數(shù)最小,且該突變?nèi)后w的粒長(zhǎng)、粒寬和千粒質(zhì)量均值均顯著高于野生型。然而,對(duì)上述航天誘變獲得籽粒表型差異較為顯著的突變體進(jìn)行誘導(dǎo)突變分子機(jī)制研究時(shí),必須借助于分子標(biāo)記鑒定技術(shù)區(qū)分真實(shí)突變體和假突變體。

呂興娜等[26]采用21對(duì)核心SSR引物對(duì)航天誘變衍生系與親本進(jìn)行分子檢測(cè),并對(duì)其遺傳相似性進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)蘭天15的航天誘變衍生系與親本間差異標(biāo)記數(shù)量在4～12個(gè),且部分性狀發(fā)生嚴(yán)重分離,推測(cè)可能是由于異花授粉產(chǎn)生的假突變體,而鄭麥9023的航天誘變衍生系與親本間差異標(biāo)記數(shù)量少于3個(gè),僅有成株期抗性等少數(shù)性狀發(fā)生分離,推測(cè)其可能是航天誘變產(chǎn)生的真實(shí)突變體。耿皆飛等[17]采用相同的21對(duì)核心SSR引物對(duì)小麥品系H261及其EMS突變體進(jìn)行分子檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),H261與突變體LF2010和LF2099的差異SSR標(biāo)記數(shù)量為0個(gè),但與突變體LF2100的差異SSR標(biāo)記數(shù)量為10個(gè),多態(tài)性比例為47.62%,進(jìn)而認(rèn)為L(zhǎng)F2010和LF2099是H261經(jīng)過EMS誘變產(chǎn)生的真實(shí)突變體,而LF2100則是由于天然異交或機(jī)械混雜產(chǎn)生的假突變體。本研究利用42對(duì)SSR引物(21對(duì)核心引物和在小麥染色體上分布均勻、多態(tài)性信息指數(shù)高、特異性和穩(wěn)定性較好的21對(duì)擴(kuò)展引物)對(duì)4份千粒質(zhì)量差異較大的航天誘變突變體ZM18-7、ZM18-26、ZM18-105和ZM18-112進(jìn)行真實(shí)性鑒定,結(jié)果表明,航天誘變突變體ZM18-112與其野生型的差異標(biāo)記為18個(gè),多態(tài)性比例高達(dá)42.85%,且多數(shù)性狀發(fā)生嚴(yán)重分離,認(rèn)為ZM18-112是由于異花授粉或機(jī)械混雜產(chǎn)生的假突變體,而突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與其野生型的差異標(biāo)記均不超過3個(gè),且僅有千粒質(zhì)量等少數(shù)性狀發(fā)生分離,認(rèn)為突變體ZM18-105、ZM18-26和ZM18-7與野生型的遺傳背景基本一致,是經(jīng)過航天誘變而產(chǎn)生的真實(shí)突變體。

由于SSR與相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence related amplified polymorphism,SRAP)等標(biāo)記受位點(diǎn)數(shù)量和方法的限制,即使突變位點(diǎn)發(fā)生在SSR、SRAP等引物結(jié)合位點(diǎn),該突變位點(diǎn)也不一定能被標(biāo)記檢測(cè)出來(lái),故無(wú)法從全基因組水平上對(duì)突變體進(jìn)行高通量真實(shí)性鑒定。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,高通量測(cè)序和SNP芯片技術(shù)在水稻、煙草、小麥等作物基因研究上廣泛應(yīng)用。Cheng等[27]利用γ射線誘變水稻9311得到優(yōu)異突變體Red-1,并對(duì)其進(jìn)行全基因組重測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Red-1的14 493個(gè)基因中存在381 403個(gè)SNP、50 116個(gè)小片段插入/缺失(Insertions/deletions,Indels)、1 279個(gè)拷貝數(shù)變異(Copy number variations,CNVs)和10 026個(gè)存在/缺失變異(Presence/absence variations,PAVs),改變序列占整個(gè)基因組序列的9.19%,而點(diǎn)突變是Red-1基因組的主要變異類型。周世奇等[28]為研究煙草航天誘變機(jī)理,對(duì)航天誘變突變體進(jìn)行全基因組重測(cè)序,結(jié)果表明,突變體NC89-M和其野生型重測(cè)序后對(duì)比得到271 655個(gè)SNP,分布在8 378個(gè)基因上,23 450個(gè)Indels造成2 156個(gè)基因突變,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)航天誘變引起的煙草基因組變異以單堿基突變?yōu)橹?。耿皆飛等[17]對(duì)小麥品系H261經(jīng)EMS誘變得到的LF2099、LF2010和LF2100突變體進(jìn)行高通量SNP芯片檢測(cè)和分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在檢測(cè)的81 597個(gè)SNP中,LF2099和LF2010突變體與野生型之間的差異SNP數(shù)量分別為12,66個(gè),僅占0.0147%,0.0809%,且純合的差異SNP位點(diǎn)均為0個(gè),進(jìn)一步證實(shí)了LF2099和LF2010突變體是EMS誘變產(chǎn)生的真實(shí)突變體。Daba等[29]通過全基因組關(guān)聯(lián)研究小麥株高,利用測(cè)序基因分型產(chǎn)生的38 693個(gè)SNP標(biāo)記,進(jìn)一步結(jié)合表型分析檢測(cè)到3個(gè)與性狀關(guān)聯(lián)緊密的標(biāo)記(Marker-trait associations,MTAs),即QPLH-2D、QPLH-4B.2和QPLH-4D,能單獨(dú)解釋10%～16%的表型變異。本研究利用小麥55K基因芯片的53 063個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)周麥18及其SP5中籽粒表型差異較為顯著的突變體進(jìn)行多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)突變體ZM18-112與野生型的差異SNP位點(diǎn)所占比例高達(dá)13.301 2%,二者遺傳背景差異較大,是假突變體,而另外3個(gè)突變體與野生型的差異SNP位點(diǎn)所占比例不超過0.768 9%,說明它們之間的遺傳差異較小,是航天誘變的真實(shí)突變體。以上研究說明,利用高通量測(cè)序和SNP芯片技術(shù)可以從全基因組水平上對(duì)突變體進(jìn)行高通量真實(shí)性鑒定。

綜上,對(duì)航天誘變獲得的138份周麥18 SP5突變體籽粒表型進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變?nèi)后w的千粒質(zhì)量、粒長(zhǎng)差異顯著,其中千粒質(zhì)量的變異最為豐富,粒寬變異不顯著,且突變?nèi)后w的粒長(zhǎng)、粒寬和千粒質(zhì)量均值均顯著高于其野生型,說明航天誘變的有益突變頻率較高。同時(shí)利用SSR分子標(biāo)記和55K SNP基因芯片對(duì)籽粒表型差異較為顯著的突變體進(jìn)行真實(shí)性鑒定,結(jié)果表明,上述2種方法均能夠很好地鑒別出純合基因型與雜合基因型,可以有效鑒定航天誘變突變體的真實(shí)性。此外,SNP基因芯片鑒定方法可以在全基因組水平上對(duì)突變體進(jìn)行高通量分析,提供的遺傳信息也更為完整,為進(jìn)一步利用優(yōu)良突變體進(jìn)行遺傳改良、功能基因克隆、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等后續(xù)研究提供更為可靠的理論依據(jù)。