蔡科羽 馮成玉 許紹懌 孫玚 婁倩 孫俊明 陳紅武

(西北農(nóng)林科技大學(xué),楊凌,712100)

植物花香是植物花朵釋放的次生代謝產(chǎn)物,由花朵釋放的一系列小分子量的易揮發(fā)化合物混合而成[1]。植物花香是植物重要的觀賞性狀之一,在觀賞植物中具有重要的感官意義與美學(xué)價(jià)值,也具有吸引昆蟲(chóng)保障授粉、結(jié)實(shí)的作用。當(dāng)植物在遭遇外來(lái)生物入侵時(shí),花香特征可應(yīng)用于吸引天敵等植物的自身防御[2]。已被發(fā)現(xiàn)的花香化合物中以萜烯類(lèi)居多,其余還有脂肪族化合物、芳香族化合物、含氮化合物、含硫化合物等。

鳶尾屬植物(Iris)在我國(guó)主要分布于西北、西南、東北地區(qū),目前我國(guó)鳶尾屬植物約有64個(gè)種[3],占全球鳶尾種的五分之一。我國(guó)對(duì)鳶尾屬植物的研究大多數(shù)是針對(duì)于其根莖的化學(xué)成分、藥理活性研究,對(duì)于其花朵的揮發(fā)性物質(zhì)成分分析的研究較少。目前,僅有土耳其鳶尾種的花、根、莖揮發(fā)性物質(zhì)[4]與有髯鳶尾的花香成分[5]被研究測(cè)定,且在有髯鳶尾中,揮發(fā)性物質(zhì)以醇類(lèi)、醛類(lèi)、萜烯、酚類(lèi)居多,具有較高的利用開(kāi)發(fā)價(jià)值。此外,也有學(xué)者[6]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)與動(dòng)態(tài)頂空法測(cè)定,并分析了鳶尾花對(duì)于傳粉昆蟲(chóng)的吸引作用。已有學(xué)者在研究不同花色月季花香成分時(shí),發(fā)現(xiàn)了植物花香與花色之間存在明顯的相關(guān)性[7],但鳶尾的花色變化與花香之間的相關(guān)性尚未有人涉足。

單花鳶尾(IrisunifloraPall.ex Link)主要產(chǎn)于我國(guó)東北地區(qū),目前已知其可作為地被植物或盆栽觀賞[8]。眾所周知,鳶尾屬植物可以治療炎癥、感染甚至癌癥等多種疾病[9],但單花鳶尾的具體藥物活性成分等醫(yī)用、藥用價(jià)值,以及花香物質(zhì)成分、釋香規(guī)律等其他領(lǐng)域用途的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

為了填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外單花鳶尾花香研究領(lǐng)域的空白,本研究以單花鳶尾野生種為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)電子鼻、頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定其花蕾期、盛開(kāi)期、衰敗期的揮發(fā)性物質(zhì)成分,結(jié)合主成分分析法、線性判別分析方法、傳感器區(qū)分貢獻(xiàn)率分析、碳標(biāo)法、譜庫(kù)檢索法等分析其不同花期的花香物質(zhì)及變化規(guī)律,為揭示鳶尾屬植物在遺傳與進(jìn)化的統(tǒng)一性、花香形成機(jī)理、花香與花色之間的關(guān)系成因等研究提供參考依據(jù),也為提高鳶尾屬植物的綜合效益提供參考。

1 研究方法

試驗(yàn)所用的單花鳶尾野生種采集于陜西楊凌的西北農(nóng)林科技大學(xué)曹新莊試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng),屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候,平均海拔為530 m,年平均氣溫為12.9 ℃,四季氣候分明,日照條件充足。

本試驗(yàn)選用花蕾期、盛開(kāi)期、衰敗期這3個(gè)時(shí)期的單花鳶尾花朵,作為樣本測(cè)定花香物質(zhì)成分。取樣方法:于晴朗條件下,每日上午08:00—10:00進(jìn)行采集。試驗(yàn)員佩戴丁腈手套,用剪刀剪取花序,將其分時(shí)期裝入液氮提前預(yù)冷的50 mL無(wú)菌透明塑料離心管中,用錫紙封口,擰緊瓶蓋并做好標(biāo)記,放入液氮中暫存,并盡快移入冰箱內(nèi)-80 ℃冷凍保存。

試驗(yàn)儀器:ISQ&TRACE ISQ氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀、德國(guó)AirsensePEN3電子鼻、分析天平、手動(dòng)頂空進(jìn)樣器、色譜柱為Rtx-1MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 mm)、15 mL頂空進(jìn)樣瓶、錫箔紙、離心管等。

電子鼻:試驗(yàn)前確保實(shí)驗(yàn)室空氣干凈無(wú)異味、人員較少。進(jìn)樣之前,先進(jìn)行洗氣,直至10個(gè)傳感器的響應(yīng)值都為1,即雷達(dá)圖近似圓形時(shí),取出裝有各花期單花鳶尾的離心管,靜置30 min使樣品頂部空間揮發(fā)物達(dá)到平衡狀態(tài),用電子鼻進(jìn)樣針和補(bǔ)氣針同時(shí)透過(guò)錫紙,插入到頂空瓶中進(jìn)行頂空取樣檢測(cè)。每一次測(cè)試均包括洗氣歸零與進(jìn)樣。電子鼻測(cè)定條件:氣體流量400 mL·min-1,洗氣時(shí)間60 s,調(diào)零時(shí)間5 s,準(zhǔn)備時(shí)間5 s,測(cè)定時(shí)間120 s,取115～117 s的值用于數(shù)據(jù)分析。進(jìn)樣時(shí)流速150 mL·min-1。清洗時(shí)以潔凈空氣作為載氣,載氣流量、進(jìn)樣流量均為200 mL·min-1[10]。不同類(lèi)型化合物對(duì)電子鼻傳感器的影響見(jiàn)表1。

表1 PEN3型電子鼻各傳感器特征

頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用:取各花期樣品1 g左右,分別置于15 mL的頂空固相微萃瓶中,瓶底部貼壁加入2-壬酮(0.008 μL·mL-1)10 μL,用錫箔紙封住瓶口蓋上瓶蓋。45 ℃平衡10 min后插入手動(dòng)頂空進(jìn)樣器,進(jìn)樣器插入進(jìn)樣瓶的頂空部分,萃取30 min。每個(gè)樣品重復(fù)試驗(yàn)4次。將手動(dòng)頂空進(jìn)樣器插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的進(jìn)樣口中。250 ℃解析2.5 min,使香氣成分完全釋放于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中[11]。

色譜條件:色譜柱為HP-5MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管,采用不分流模式,進(jìn)樣口溫度250 ℃,樣品解析時(shí)間3 min,載氣為氦氣,流速1.0 mL·min-1,柱溫設(shè)定為升降溫程序:起始溫度40 ℃,保持時(shí)間3 min,先以5 ℃·min-1的速率升溫至150 ℃,再以10 ℃·min-1的速率升溫至220 ℃,保持10 min。

質(zhì)譜條件:采用全掃描模式,電離模式EI(電子電離),發(fā)射電流10 Ua,電子能70 Ev,離子源溫度220 ℃,傳輸源溫度220 ℃,質(zhì)量掃描范圍為35～450 amu。

氣質(zhì)聯(lián)用定性方法:根據(jù)離子峰圖從第1個(gè)穩(wěn)定峰開(kāi)始查看,穩(wěn)定峰對(duì)應(yīng)同一RT(保留時(shí)間)值下多種物質(zhì)首選排序第1位,對(duì)比4次基礎(chǔ)生物學(xué)重復(fù)中,選中物質(zhì)要在同一RT值下出現(xiàn),且排名最前的。

定量方法:內(nèi)標(biāo)法,選用2-壬酮為內(nèi)標(biāo)物質(zhì),密度為0.82 g·mL-1,對(duì)鳶尾樣品中各種香氣組分進(jìn)行定量,4次生物學(xué)重復(fù)后取平均值,公式(1)。

Mi=(C0×V0×Ai)/(A0×M)。

(1)

式中:Mi為各香氣組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/g);C0為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度(g/L);V0為內(nèi)標(biāo)體積(μL);Ai、A0分別為所求香氣組分峰面積及內(nèi)標(biāo)峰面積;M為樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單花鳶尾不同時(shí)期揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)電子鼻的影響

圖1為不同花期單花鳶尾揮發(fā)物的特征雷達(dá)圖。不同花期10個(gè)傳感器的電阻比值明顯不一致?；ɡ倨赪5S、W1S、W1W、W2W傳感器的G/G0(相對(duì)電導(dǎo)率)值比其他傳感器電阻比值高,說(shuō)明該花期揮發(fā)物中主要含氮氧化合物、無(wú)機(jī)硫化物、甲基類(lèi)化合物、有機(jī)硫化物等物質(zhì);盛開(kāi)期W5C、W1W、W2S、W2W、W3S傳感器G/G0值比其他傳感器電阻比值高,說(shuō)明該時(shí)期揮發(fā)物中主要含短鏈烷烴、醇類(lèi)、無(wú)機(jī)硫化物、有機(jī)硫化物、長(zhǎng)鏈烷烴等物質(zhì);衰敗期W5S、W1S、W1W、W2S、W2W、W3S傳感器G/G0值比其他傳感器電阻比值高,說(shuō)明該時(shí)期揮發(fā)物中含氮氧化合物、甲基類(lèi)化合物、醇類(lèi)、無(wú)機(jī)硫化物、有機(jī)硫化物、長(zhǎng)鏈烷烴等物質(zhì)。

A為花蕾期電子鼻雷達(dá)圖;B為盛開(kāi)期電子鼻雷達(dá)圖;C為衰敗期電子鼻雷達(dá)圖。1為W1C傳感器;2為W5S傳感器;3為W3C傳感器;4為W6S傳感器;5為W5C傳感器;6為W1S傳感器;7為W1W傳感器;8為W2S傳感器;9為W2W傳感器;10為W3S傳感器。

2.2 主成分分析區(qū)分單花鳶尾不同時(shí)期花香

單花鳶尾花蕾期、盛開(kāi)期、衰敗期的主成分分析(PCA)結(jié)果見(jiàn)圖2,第一主成分貢獻(xiàn)率為98.556%,第二主成分貢獻(xiàn)率為1.304%,2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.86%,故這2個(gè)主成分基本代表了樣品的主要信息特征。由圖2可知,3個(gè)時(shí)期的單花鳶尾使用主成分分析法并不能被顯著區(qū)分。原因在于花蕾期與盛開(kāi)期的花香氣味較為接近。

圖2 不同花期單花鳶尾的主成分分析

2.3 影響單花鳶尾不同時(shí)期花香差異的主要揮發(fā)性物質(zhì)貢獻(xiàn)率判別

電子鼻載荷(Loadings)分析是傳感器對(duì)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分的一種研究方法,主要考察樣品中何種氣體物質(zhì)起主要區(qū)分作用,并判別其貢獻(xiàn)率大小[12]。各花期的電子鼻載荷分析結(jié)果見(jiàn)圖3,傳感器W1W(對(duì)硫化物、萜烯敏感)、傳感器W2W(對(duì)有機(jī)硫化物、芳香族敏感)、傳感器W1S(對(duì)甲烷敏感)、傳感器W5S(對(duì)氮氧化合物敏感)、傳感器W2S(對(duì)醇類(lèi)、部分芳香族敏感)的位點(diǎn)距離原點(diǎn)較遠(yuǎn),是區(qū)分各花期花香變化的主要傳感器[13]?？梢酝茰y(cè),W1W、W2W、W1S、W5S、W2S這5個(gè)傳感器對(duì)單花鳶尾不同花期花朵的識(shí)別度最為敏感,起主要區(qū)分作用。說(shuō)明單花鳶尾不同花期的花香成分差異主要與硫化物、萜烯、有機(jī)硫化物類(lèi)、芳香族化合物、甲烷、氮氧化合物、醇類(lèi)等揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān)。

圖3 單花鳶尾不同花期的電子鼻載荷分析

2.4 線性判別分析區(qū)分單花鳶尾不同時(shí)期花香

不同花期的單花鳶尾線性判別(LDA)分析結(jié)果見(jiàn)圖4,第一線性判別因子(LD1)貢獻(xiàn)率為98.625%,第二線性判別因子(LD2)貢獻(xiàn)率為1.026%,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)99.651%。這說(shuō)明線性判別分析可以將各花期的花香物質(zhì)完全區(qū)分。相較于主成分分析,線性判別分析處理的分布區(qū)域更為集中,且其區(qū)分效果顯著高于主成分分析。

圖4 不同花期的單花鳶尾線性判別分析

2.5 單花鳶尾不同時(shí)期揮發(fā)物成分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),在單花鳶尾各時(shí)期共檢測(cè)出57種花香物質(zhì)。其中花蕾期22種,盛開(kāi)期33種,衰敗期29種。這些揮發(fā)性成分可分為9大類(lèi):萜烯類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)、芳香烴、醇類(lèi)、酯類(lèi)、酚類(lèi)、醛類(lèi)、烷烴、酮類(lèi)。不同花期單花鳶尾的揮發(fā)性成分類(lèi)別見(jiàn)表2。

表2 不同花期單花鳶尾的揮發(fā)性成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表2可知,單花鳶尾各花期的揮發(fā)性成分差異較大。其中,醇類(lèi)、醛類(lèi)物質(zhì)在各花期中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大,是花香成分的主要類(lèi)別。醛類(lèi)物質(zhì)在盛開(kāi)期質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,達(dá)到77.80%,其次是衰敗期,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49.90%,花蕾期則為43.17%;萜烯類(lèi)物質(zhì)在盛開(kāi)期質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,達(dá)到4.09%;酚類(lèi)物質(zhì)在花蕾期中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,達(dá)到9.89%。在花蕾期與盛開(kāi)期中,除了芳香烴之外的各類(lèi)物質(zhì)均被檢測(cè)到;而在衰敗期中,檢測(cè)到除了雜環(huán)類(lèi)以外的各類(lèi)物質(zhì)。此結(jié)果與先前的電子鼻雷達(dá)圖在很大程度上相吻合。

在單花鳶尾不同花期共檢測(cè)出57種主要花香成分。從表3可以看出,不同時(shí)期的單花鳶尾檢測(cè)出的揮發(fā)性成分有明顯差別。2-己烯醛、3-己烯-1-醇這2種物質(zhì)在各花期質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較高。

表3 不同花期單花鳶尾的主要揮發(fā)性成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

各花期質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%的揮發(fā)性物質(zhì)見(jiàn)表4。其中,2-己烯醛、3-己烯-1-醇、正己醇、壬醛為各個(gè)時(shí)期均檢測(cè)到的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%的物質(zhì)。有些揮發(fā)性成分在某花期質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大,但在另一花期中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低,甚至未能檢測(cè)到。例如,2-甲基-4-戊醛在盛開(kāi)期中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.68%,但在花蕾期、衰敗期中均未能檢測(cè)到;3-己烯醛在衰敗期中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.10%,但在花蕾期、盛開(kāi)期中未能檢測(cè)到。萜烯類(lèi)是大量品種觀賞花卉的主要呈香物質(zhì),幾乎在所有的植物花香成分中都能被檢測(cè)到[14],如具有甜香味的羅勒烯、具有清新草味的α-蒎烯等[15]。但本研究并沒(méi)有在單花鳶尾花蕾期檢測(cè)到任何質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%的萜烯類(lèi),而羅勒烯等萜烯類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在盛開(kāi)期、衰敗期較為豐富。

表4 各花期質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%的揮發(fā)性物質(zhì)

3 討論與結(jié)論

本研究以單花鳶尾各花期樣本為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用電子鼻技術(shù)、頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)探究不同花期的花香成分變化。為了探究各花期揮發(fā)性物質(zhì)能否被顯著區(qū)分,本研究利用主成分分析(PCA)、線性判別分析方法(LDA)、傳感器區(qū)分貢獻(xiàn)率分析(Loadings)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,采用主成分分析處理之后,3個(gè)花期的主成分1、2累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到99.86%,但由于花蕾期與盛開(kāi)期氣味較為接近,不可在此方法下被顯著區(qū)分;采用線性判別分析,其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到99.651%,可以完全區(qū)分各花期花香成分。采用傳感器區(qū)分貢獻(xiàn)率分析,得到W1W、W2W、W1S、W5S、W2S這5個(gè)傳感器對(duì)單花鳶尾不同花期花朵的識(shí)別度最為敏感,起主要區(qū)分作用。綜上所述,其花香氣味存在顯著差異性,且不同花期的花香成分差異主要與硫化物、萜烯、有機(jī)硫化物類(lèi)、芳香族化合物、甲烷、氮氧化合物、醇類(lèi)等物質(zhì)有關(guān)。這一結(jié)論為后續(xù)的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)與證據(jù)。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí),單花鳶尾各花期具有獨(dú)特香味的原因在于,其揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)、比例不同。其中,2-己烯醛、3-己烯-1-醇、正己醇、壬醛為各花期共有的主要呈香物質(zhì),而花蕾期中2-己炔-1-醇、2,4-二叔丁基苯酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,可用于區(qū)別另外2個(gè)花期,盛開(kāi)期的2-甲基-4-戊醛、羅勒烯、芳樟醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,衰敗期則富有3-己烯醛、羅勒烯、反-2-壬烯-1-醇。

本研究在單花鳶尾各花期檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)以醇類(lèi)、醛類(lèi)居多,萜烯、酚類(lèi)次之。比較3個(gè)花期檢測(cè)到的揮發(fā)性成分可以發(fā)現(xiàn),萜烯類(lèi)物質(zhì)在盛開(kāi)期質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(4.09%)。花蕾期中含有較為豐富的酚類(lèi)物質(zhì)(9.89%)。芳香烴類(lèi)物質(zhì)僅在衰敗期檢測(cè)到,但質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低(0.62%),推測(cè)其呈香效果并不顯著,對(duì)于衰敗期花香的特征性貢獻(xiàn)不大。

在本研究中單花鳶尾檢測(cè)到質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的2-甲基-4-戊醛,可作為藥物眠爾通與殺蟲(chóng)劑的中間體[16];3-己烯-1-醇是世界流行的清香型名貴香料,是香精生產(chǎn)過(guò)程中不可缺少的調(diào)香物質(zhì)之一[17];3-己烯醛因具有強(qiáng)烈的青草與蘋(píng)果香味而被允許作為食用香料;α-蒎烯不僅對(duì)白念珠菌有抑制作用,還可作為香皂、清潔劑的原材料[18]。由此可見(jiàn),單花鳶尾除了已知的觀賞價(jià)值之外,還具有較高的醫(yī)用、藥用、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

花香成分的種類(lèi)與質(zhì)量分?jǐn)?shù)受到基因、節(jié)律、傳粉昆蟲(chóng)等眾多因素的調(diào)控[19],鳶尾屬植物的釋香部位、晝夜節(jié)律等規(guī)律特點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。隨著鳶尾研究乃至代謝組學(xué)研究的深入,可以在本研究得出的結(jié)論之上,對(duì)鳶尾屬植物的花香成分合成機(jī)理、基因調(diào)控、感官組學(xué)等方面展開(kāi)研究。