賈芯碧　潘饒　肖遙　羅莎　單楠　孫靜宇　汪生林　周慶紅　黃英金　朱強(qiáng)龍

關(guān)鍵詞：紅芽芋；荔浦芋；葉綠體基因組；SSR；SNP；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào)：S632.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

芋[Colocasia esculenta （L.） Schoott]為天南星科芋屬多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的蔬菜兼糧食作物。芋地下球莖具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，富含淀粉、蛋白質(zhì)、多糖、維生素和膳食纖維[1]，球莖中含有的豐富的粘液物質(zhì)具有抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)人體免疫力，降血糖、抗病毒等功效，其花、葉、莖均可入藥，可治口渴便秘、消癆散結(jié)等癥狀[2]，是食藥兼優(yōu)的上乘佳品。芋在我國(guó)有悠久的栽培歷史，品種類型豐富多樣，其中以多子芋和魁芋最為常見(jiàn)。多子芋主要分布在長(zhǎng)江流域，多為三倍體種（2n=3x=42），以子、孫芋為主要食用部分；魁芋主要分布于嶺南地區(qū)，為二倍體種（2n=2x=28），以食用碩大的母芋為主。江西鉛山紅芽芋為典型的多子芋類型，紅芽白肉，母芋近圓形，芋皮黃褐色，有少量須毛，子芋肥大，多而群生。鉛山紅芽芋因其肉質(zhì)細(xì)膩，口感松滑，營(yíng)養(yǎng)豐富而備受大眾喜愛(ài)，成為江西省名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品，2013 年獲批國(guó)家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品[3-4]。廣西荔浦芋又名魁芋，白芽白肉，母芋個(gè)頭碩大，呈橢圓形，芋皮棕色，芋肉具有美麗的紫色檳榔花紋[5]。荔浦芋肉質(zhì)綿甜，酥黏可口，味道芬芳，被譽(yù)為“芋中極品”，被列為廣西壯族自治區(qū)的地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[6]。紅芽芋喜濕怕澇，喜涼怕熱[7]，一般選用土層深厚肥沃，pH 在5.5～7.5 之間的沙質(zhì)土壤，進(jìn)行旱地栽培[8]；而荔浦芋喜高溫多濕的環(huán)境[9]，更適合水田種植，栽培時(shí)選用石灰性的黏質(zhì)壤土較為適宜[10]，由于它們長(zhǎng)期生長(zhǎng)環(huán)境和栽培條件不同，可能導(dǎo)致2 種芋的遺傳和性狀具有顯著的差異。

葉綠體是綠色植物細(xì)胞中參與光合作用和能量代謝最重要的細(xì)胞器之一，內(nèi)含特定的遺傳物質(zhì)。葉綠體基因組編碼了約110～134 個(gè)基因，這些基因與光合作用、葉綠體轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)及能量代謝相關(guān)。相較于核基因組，葉綠體基因組多為母系遺傳，其進(jìn)化路線獨(dú)立、進(jìn)化速率適中、核苷酸替換率較低、基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在系統(tǒng)研究方面易于提供物種進(jìn)化信息[11]。因此，葉綠體基因組廣泛應(yīng)用于植物物種鑒定及分類、系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳差異和多樣性分析等研究中[12]。目前，國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于我國(guó)特色芋種質(zhì)資源葉綠體基因組測(cè)序和比較分析的研究。此外，荔浦芋和紅芽芋雖均為芋屬芋種作物，但由于倍性不同，其生物學(xué)特性存在顯著差異，二者在葉綠體基因組方面的差異并不明確。本研究以江西鉛山紅芽芋和廣西荔浦芋為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝、注釋和繪制物理圖譜，分析其簡(jiǎn)單重復(fù)序列并開發(fā)多態(tài)性SSR 引物，將紅芽芋、荔浦芋與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的13 種植物的葉綠體基因組序列信息進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)其進(jìn)行葉綠體基因組基本特征的比較分析，通過(guò)遺傳多樣性滑窗分析鑒別15 種天南星亞科植物葉綠體基因序列的遺傳差異，并構(gòu)建進(jìn)化樹揭示芋在系統(tǒng)發(fā)育中的地位及其群體進(jìn)化關(guān)系，為闡明我國(guó)特色多子芋和魁芋遺傳差異，芋種質(zhì)資源鑒定、開發(fā)、利用以及遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究為比較紅芽芋（多子芋，三倍體）和荔浦芋（魁芋，二倍體）的葉綠體基因的差異，所用紅芽芋品種為贛芋1 號(hào)，是江西上饒鉛山縣的地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品；荔浦芋采自廣西壯族自治區(qū)桂林市荔浦市。同時(shí)利用30 份從全國(guó)搜集的芋核心種質(zhì)資源品種（表1）對(duì)紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中開發(fā)的SSR 標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢驗(yàn)。于2021 年7 月在田間收集新鮮的葉片，立即凍存于液氮中，然后運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室保存在?80 ℃冰箱中直至使用。利用CTAB 改良法提取葉片高純度基因組DNA[13]，并用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop-2000 核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA 的質(zhì)量和濃度，符合要求的DNA 樣品將用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 基因組測(cè)序、組裝與注釋 將紅芽芋和荔浦芋的DNA 送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，其余稀釋到10 ng/μL，分裝凍存待用。利用華大基因自主開發(fā)的過(guò)濾軟件SOAPnuke 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾參數(shù)為“-n0.01 -I 20 -q 0.3 -A 0.25 -f -r -1 < fq1> -2 < fq2> -C < cleanFq1> -D -o ”。刪除匹配上adapter 序列的25%或者以上、質(zhì)量值低于20 的堿基占整條read 的30%或者以上、堿基N 含量占整條read 的1%或者以上的整條read，得到無(wú)雜質(zhì)的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。利用Seqtk 軟件隨機(jī)抽取獲得1 Gb 的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)，采用SPAdes 軟件[14]中的Plasmidspades.py 腳本程序?qū)⒌玫降腸lean reads 組裝到contig 序列，用BlastN 軟件[15]將其比對(duì)到國(guó)外發(fā)表的芋的葉綠體參考基因組（NC_016753.1），構(gòu)建出芋葉綠體基因組骨架。使用GapCloser 軟件對(duì)框架序列上的gap 進(jìn)行填補(bǔ)。通過(guò)CPGAVAS2[16]和GeSeq[17]對(duì)2 種芋葉綠體基因組序列進(jìn)行注釋，利用IGV 和Sequin 軟件檢查和修正注釋結(jié)果，將最終注釋的紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組數(shù)據(jù)提交到NCBI 的GenBank 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)， 獲得基因編號(hào)分別為MT447084 和MT447085。最后，使用在線程序OGDRAW[18]（ https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制完整的環(huán)狀葉綠體基因組圖譜。

1.2.2 簡(jiǎn)單重復(fù)序列鑒定及標(biāo)記開發(fā) 利用MISA 軟件[19]對(duì)紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）進(jìn)行鑒定，再利用Primer3軟件進(jìn)行批量化SSR 引物設(shè)計(jì)，引物挑選標(biāo)準(zhǔn)：引物序列長(zhǎng)度為16～24 bp，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為100～300 bp，TM 值為50～60 ℃，最適為55 ℃，上下游引物的TM值相差不大于3 ℃，GC%為40%～60%；SSR 多態(tài)性引物的篩選的條件為：SSR 重復(fù)單元包含2～6 個(gè)堿基重復(fù)，SSR 長(zhǎng)度不少于18 bp，富含AT 堿基，且SSR 序列在2 種芋葉綠體基因組上存在差異，它們的側(cè)翼引物將用于后續(xù)的多態(tài)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。然后，利用本實(shí)驗(yàn)室保存的32 份芋核心種質(zhì)資源的DNA 樣品（表1）對(duì)符合篩選條件的SSR 引物進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL，含5 μL 2TSINGKEMaster Mix（Green）；前引物0.25 μL（10 μmol/L）；后引物0.25 μL（10 μmol/L）；0.5 μL 模板DNA；4 μL ddH2O。擴(kuò)增反應(yīng)采用以下循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性2～5 min，94 ℃變性30 s，50～68 ℃退火30 s，30～35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1～2 min，72 ℃終延伸5～10 min。擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)。使用AgNO3 染色12 min后用適量蒸餾水浸洗膠面2 次，每次20～30 s，將膠片浸于NaOH 顯影液中不斷搖勻，直至顯出條帶，并拍照記錄進(jìn)行分析。

1.2.3 葉綠體基因組比較分析 為了解芋種內(nèi)葉綠體基因組的遺傳多樣性，本研究利用BWA[20]、SAMtools[21]、VarsScan 等軟件挖掘紅芽芋和荔浦芋2 種類型芋葉綠體基因組中的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP），并用SNPeff 軟件分析SNP 對(duì)基因的影響，以解析紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組的遺傳差異。天南星亞科植物是天南星科植物中數(shù)量最多且遺傳多樣性最高的一類植物，其中多數(shù)植物具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值。目前，NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)已收錄17 種天南星亞科植物，共13 個(gè)屬，本研究分別從以上13 個(gè)屬中隨機(jī)挑選一種代表植物參與比較分析?；诒狙芯恐凶⑨尩募t芽芋和荔浦芋葉綠體基因組信息和數(shù)據(jù)庫(kù)中13 個(gè)屬葉綠體基因組信息，對(duì)該15 個(gè)葉綠體基因組的基因含量和基因結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以紅芽芋為參照，利用DNASP6 軟件進(jìn)行遺傳多樣性滑窗分析，鑒別15 種天南星科植物葉綠體基因序列的遺傳差異。

1.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析 為揭示芋屬植物在天南星亞科植物中的進(jìn)化地位，本研究利用MAFFT 軟件[22]對(duì)紅芽芋、荔浦芋和13 個(gè)天南星亞科代表屬植物的葉綠體基因組進(jìn)行完全比對(duì)，以澤瀉屬澤瀉（ NC_044108.1 ） 和浮萍屬浮萍（ NC_010109.1）葉綠體基因組作為外群（outgroup），基于極大似然法（ML），自舉值（bootstrap）為1000，利用MEGA 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅芽芋及荔浦芋葉綠體基因組基本特征

紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組均為典型的環(huán)狀雙鏈四分體結(jié)構(gòu)，全長(zhǎng)分別為162 478 bp 和162453 bp（圖1），2 種芋葉綠體基因組全長(zhǎng)僅相差25 bp。紅芽芋和荔浦芋均包括1 個(gè)小的單拷貝片段（SSC），長(zhǎng)度分別為22 072 bp 和22 187 bp，1 個(gè)大的單拷貝片段（LSC，89 808 bp 和89 718 bp）和1 對(duì)反向重復(fù)序列（IRa 和IRb，25 299 bp 和25 274 bp）（圖1）。由此可見(jiàn)，其中SSC 片段長(zhǎng)度在2 種芋中差異最大，IR 片段的差異最小。

2 種芋葉綠體基因組均注釋到131 個(gè)基因（表2），包括86 個(gè)蛋白編碼基因，37 個(gè)tRNA 基因和8 個(gè)rRNA 基因。其中86 個(gè)蛋白編碼基因可分為3 個(gè)大類，第一類包含29 個(gè)與自我復(fù)制相關(guān)的基因，包括編碼RNA 聚合酶的3 個(gè)亞基（大亞基、小亞基和DNA 依賴性RNA 聚合酶）；第二類包含45 個(gè)與光合作用相關(guān)的基因（ATP 合酶亞基、光系統(tǒng)Ⅰ的亞基、光系統(tǒng)Ⅱ的亞基、NADH–脫氫酶的亞基、細(xì)胞色素b/f 復(fù)合物的亞基、二磷酸核酮糖氧合酶/羧化酶亞基）；第三類包括5 個(gè)其他編碼蛋白質(zhì)的基因和6 個(gè)功能未知的基因。

紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中共有23 個(gè)基因含有內(nèi)含子，其中只有ycf3 和clpP 含有2個(gè)內(nèi)含子（表3）。對(duì)二者葉綠體基因組中所有翻譯蛋白表達(dá)的密碼子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，亮氨酸Leu 是其中編碼率最髙的氨基酸，分別有5056 個(gè)和5050 個(gè)（表4）；半胱氨酸Cys 是編碼率最低的氨基酸，均只含606 個(gè)；二者葉綠體基因組中的密碼子用法有所不同，使用同種密碼子數(shù)量差異范圍為0～12 個(gè)。紅芽芋和荔浦芋的第三密碼子A/T 含量分別為68.09%和68.12%。

2.2 SSR 鑒定及其分子標(biāo)記開發(fā)

鑒定到紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中SSR數(shù)量分別為130 和124（表5）。紅芽芋SSR 序列絕大部分是單核苷酸重復(fù)序列（p1），占65.38%，二核苷酸重復(fù)序列（p2）共35 個(gè)（26.92%），三核苷酸重復(fù)序列（p3）共8 個(gè)（6.15%），四核苷酸重復(fù)序列（p4）僅2 個(gè)（1.54%）；位于編碼區(qū)僅14.62%，而大部分（85.38%）位于非編碼區(qū)（圖2）。荔浦芋SSR 序列中p1 占62.9%，p2 共35 個(gè)（28.23%），p3 共10 個(gè)（8.06%），p4 僅1 個(gè)（0.81%），其中19.35%位于編碼區(qū)，80.65%位于非編碼區(qū)（圖2）。紅芽芋葉綠體基因組中63.08%的SSR 由A/T堿基組成，而荔浦芋重復(fù)堿基中A/T 堿基占61.29%（表6）。

根據(jù)紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中SSR 序列差異信息，鑒別到38 個(gè)SSR 序列在2 個(gè)材料的基因組序列之間具有多態(tài)性，在多態(tài)性SSR 序列兩端共設(shè)計(jì)出191 對(duì)SSR 引物，其中31 對(duì)符合多態(tài)性引物的篩選條件，以32 種芋試驗(yàn)材料的DNA 樣品為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果表明，其中12 對(duì)引物能擴(kuò)增出穩(wěn)定、清晰的條帶，并具有多態(tài)性（表7），每個(gè)引物在一份材料中產(chǎn)生0～10 個(gè)條帶（圖3），12 對(duì)引物在32 份材料中共擴(kuò)增出1226 個(gè)清晰條帶，其中827 條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為67.45%。

本研究所搜集的32 份試驗(yàn)材料在芋種群中具有一定代表性，利用其葉綠體基因組SSR 開發(fā)標(biāo)記有助于深入研究我國(guó)芋種質(zhì)資源，因此，本研究基于上述12 對(duì)引物對(duì)試驗(yàn)材料的遺傳分型條帶對(duì)32 份芋核心種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析（圖4），結(jié)果表明遺傳距離最遠(yuǎn)的是青島芋頭和于都大野芋，最近的是白肉毛頭芋和贛州多子芋，品種間相似性系數(shù)在0～0.971 之間，平均值為0.515。在相似性系數(shù)為0.480 處可以將供試材料分成3 組。

第Ⅰ組包括18 個(gè)品種，92.3%為多子芋品種，其中贛州1 號(hào)紅芽芋（1）、紫柄芋（10）、紫芽芋（12）、狗爪芋（13）、白肉毛芋（14）、扁母芋（19）等為多子芋類型的典型品種，子芋多、芽色艷麗、芋肉粉質(zhì)，除粉紅佳人（7）、粉紅芋2 號(hào)（8）和于都大野芋（9）外，其他10 個(gè)來(lái)源于江西的品種均聚集在該組。

第Ⅱ組包括13 個(gè)品種，集中了炮彈芋（17）、泉州魁芋（21）、大香芋（28）和荔浦芋（32）四種魁芋，其中炮彈芋和泉州魁芋相似性最高，相似系數(shù)為0.936，來(lái)自廣西的欽州芋（11）、紅嘴芋（16）和荔浦芋（32）3 個(gè)品種均聚集在第Ⅱ組。

第Ⅲ組只含于都大野芋（9）一個(gè)品種，大野芋[Colocasia gigantea （Blume） Hook. f.]屬天南星科、芋屬、大野芋種，根莖倒圓錐形，直立，葉叢生，葉片卵狀心形，與本研究其他31 份芋材料有較大差異，此外，12 對(duì)SSR 引物在于都大野芋（9）上擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶位點(diǎn)也與其他試驗(yàn)材料的較為不同。

2.3 紅芽芋與荔浦芋葉綠體基因組中單核苷酸多態(tài)性分析

為了比較紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組的差異，進(jìn)一步了解紅芽芋和荔浦芋的遺傳多樣性，本研究對(duì)二者的葉綠體基因組進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性分析（SNP）。共鑒別到236 個(gè)SNP 位點(diǎn)（圖5），其中173 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生在基因間區(qū)（intergenicregion），63 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生在基因編碼區(qū)，致使36個(gè)基因發(fā)生同義突變（synonymous variant），25個(gè)基因發(fā)生錯(cuò)位突變（missense variant）（表8），其中，ycf2 是發(fā)生錯(cuò)義突變頻率最高的基因。此外，rpl16 發(fā)生終止密碼子提前（stop gained），atpF 發(fā)生剪接區(qū)突變（splice region variant）。

2.4 芋與天南星亞科植物葉綠體基因組的分析比較

比較紅芽芋、荔浦芋及其他13 種天南星科植物葉綠體基因組發(fā)現(xiàn)，其葉綠體基因的結(jié)構(gòu)大小及基因種類差異不大（表9）。犁頭尖的葉綠體基因組最大，為169 977 bp，普陀南星葉綠體基因組最小，為160 792 bp。紅芽芋GC 含量最高，為38.15%，獨(dú)角蓮GC 含量最低，為35.59%。一共注釋到128～132 個(gè)基因，其中最多的為獨(dú)角蓮（132 個(gè)），最少的為掌葉半夏（128 個(gè)）。編碼蛋白基因數(shù)在83～86 之間，掌葉半夏只注釋到83個(gè)編碼基因。13 種天南星亞科植物rRNA 數(shù)均為8 個(gè)。tRNA 個(gè)數(shù)在36～38 之間，大多數(shù)植物有37 個(gè)tRNA，最多的為獨(dú)角蓮（38 個(gè)）。

2.5 遺傳多樣性滑窗分析

為了明確紅芽芋、荔浦芋及其他13 種天南星科植物序列的差異程度，本研究利用DnaSP 6.0軟件計(jì)算了表9 中15 個(gè)植物葉綠體基因組的核苷酸序列遺傳多樣性Pi 值。結(jié)果表明在SSC 區(qū)基因變異程度最大，LSC 區(qū)次之，IRa 和IRb 區(qū)的基因變異程度最低（圖6），并發(fā)現(xiàn)trnS-trnG 和ndhF-rpl32（π>0.5）分別為SSC 區(qū)和LSC 區(qū)中最高的變異位點(diǎn)，這2 個(gè)區(qū)域均位于基因間區(qū)。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析

葉綠體基因組是研究物種起源、進(jìn)化演變及不同物種之間的親緣關(guān)系等方面的重要分子依據(jù)之一。本研究利用MAFFT 軟件比對(duì)分析表9 中紅芽芋和荔浦芋，以及其他13 個(gè)天南星亞科代表屬植物的葉綠體基因組，以天南星科浮萍（Lemnaminor）和澤瀉科澤瀉（Alisma plantago-aquatica）植物葉綠體基因組作為外群，利用MEGA 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，探究芋與其他天南星科植物間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。由圖7 可知，系統(tǒng)進(jìn)化樹分支上的bootstrap 值均大于95，表明該樹結(jié)構(gòu)對(duì)于揭示植物親緣關(guān)系的置信程度較高。從水平方向分支可知，紅芽芋、荔浦芋與皂七屬橫向距離相加最短，表明與其他13 個(gè)屬相比，芋屬與皂七屬進(jìn)化分歧時(shí)間最短，親緣關(guān)系相近。其次，紅芽芋（多子芋，三倍體）和荔浦芋（魁芋，二倍體）各自分支均有一定長(zhǎng)度，表明二者在進(jìn)化過(guò)程中遺傳變量的變化程度有差異。

3 討論

高等植物葉綠體基因組通常為典型的四分結(jié)構(gòu)，序列長(zhǎng)度在120～160 kb 范圍內(nèi)[23]。紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組結(jié)構(gòu)與之相似，全長(zhǎng)分別為162 478 bp 和162 453 bp，呈典型的環(huán)狀雙鏈四分體結(jié)構(gòu)，均由1 個(gè)SSC 區(qū)，1 個(gè)LSC 區(qū)和1 對(duì)反向重復(fù)序列（IRa 和IRb）組成。在二者葉綠體基因組所有翻譯蛋白表達(dá)的密碼子中，亮氨酸Leu是編碼率最髙的氨基酸，表明芋可能富含亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，從而提高芋的天然免疫防御能力[24-25]。二者葉綠體基因組蛋白編碼基因第三密碼子均具有明顯的A/T 偏好性，進(jìn)一步證明了A/T 密碼子偏好性普遍存在于高等植物的葉綠體基因組中[26]。

SSR 是以PCR 技術(shù)為核心的DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，SSR 標(biāo)記能在遺傳水平上直接識(shí)別特定的基因型，在芋種質(zhì)資源鑒定與分類、遺傳多樣性分析和新品種開發(fā)中具有重要作用。近年來(lái)，隨著芋的食藥同源價(jià)值被大眾認(rèn)可和芋產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，芋特異性SSR 分子標(biāo)記開發(fā)逐漸受到重視。YOU 等[27]根據(jù)芋頭轉(zhuǎn)錄組序列，開發(fā)了2858 對(duì)SSR 引物，隨機(jī)合成100 對(duì)，其中72 對(duì)可以擴(kuò)增出條帶，62 對(duì)在芋頭的品種中存在多態(tài)性；CHAR等[28]使用11 對(duì)SSR 標(biāo)記成功地將來(lái)自19 個(gè)國(guó)家的芋頭品種進(jìn)行分類。本研究利用MISA 和Primer3 軟件對(duì)紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組進(jìn)行SSR 鑒定及引物開發(fā)，鑒定到紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組分別有130 和124 個(gè)SSR，以多聚A 和多聚T 單核苷酸重復(fù)序列為主，分別為65.38%和62.9%，二者的SSR 序列主要分布在非編碼區(qū)。通過(guò)對(duì)紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組SSR 位點(diǎn)的比較分析，開發(fā)出15 對(duì)能擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性豐富的SSR 引物，將為深入研究芋種質(zhì)資源鑒別、遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助選擇育種等提供理論依據(jù)。

葉綠體基因組是植物細(xì)胞中重要的遺傳物質(zhì)之一，紅芽芋、荔浦芋的表型性狀，生長(zhǎng)習(xí)性等方面有較大差別。為了明確2 種芋葉綠體基因組之間遺傳差異，通過(guò)對(duì)紅芽芋、荔浦芋葉綠體基因組的比較分析，發(fā)現(xiàn)盡管二者基因組結(jié)構(gòu)相近，總基因數(shù)、編碼蛋白基因數(shù)、rRNA 數(shù)和tRNA 數(shù)均一致，但它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上遺傳距離約為0.001 486，表明存在遺傳差異。對(duì)紅芽芋和荔浦芋葉綠體基因組中SNP 位點(diǎn)進(jìn)行分析，共鑒別到SNP 位點(diǎn)236 個(gè)，63 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生在基因編碼區(qū)，致使accD、matK、ndhA、ndhD、ndhF、rbcL、rpoC1、rpoC2 等25 個(gè)基因發(fā)生錯(cuò)義突變。accD 基因編碼乙酰輔酶A 羧化酶的β-羧基轉(zhuǎn)移酶亞基[29]，是參與脂肪酸合成的重要調(diào)節(jié)酶之一，研究發(fā)現(xiàn)accD也是調(diào)節(jié)葉片生長(zhǎng)發(fā)育的重要基因[30-31]，荔浦芋的葉片一般比紅芽芋的葉片大，accD 的變異可能促進(jìn)了它們之間的葉片產(chǎn)生形態(tài)差異。matK 基因編碼內(nèi)含子成熟酶K，主要參與RNA 轉(zhuǎn)錄內(nèi)含子的剪接[32]。rpoC1 和rpoC2 基因編碼β-RNA 聚合酶，在植物授粉和性別分化的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[33]。ndhA、ndhD、ndhF 和rbcL 是光系統(tǒng)中重要的調(diào)控基因，對(duì)2 種芋的光合作用具有重要作用。這些葉綠體功能基因?qū)τ筮m應(yīng)生態(tài)環(huán)境與生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程發(fā)揮重要作用，它們的變異可能促使2 種芋的農(nóng)藝性狀與生長(zhǎng)習(xí)性存在較大差異。

通過(guò)2 種芋與13 個(gè)天南星亞科代表屬植物葉綠體基因組的比較分析， 發(fā)現(xiàn)trnS-trnG 和ndhF-rpl32 分別是SSC 區(qū)和LSC 區(qū)的最高變異位點(diǎn)，這2 個(gè)區(qū)域已經(jīng)作為DNA 條形碼（DNAbarcode）被廣泛地用于禾本科[34]、葫蘆科[35]、豆科[36]植物系統(tǒng)進(jìn)化研究中，表明這2 個(gè)高變異區(qū)域可開發(fā)為DNA barcode 用于芋植物及其近緣物種的種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)、遺傳多樣性分析及群體進(jìn)化關(guān)系等研究。在本研究的系統(tǒng)進(jìn)化分析中，與其他天南星亞科代表屬相比，芋屬與皂七屬（Steudnera）親緣關(guān)系最近，該結(jié)果與CABRERA等[37]、CUSIMANO 等[38]、NAUHEIMER 等[39]對(duì)天南星科植物系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究結(jié)果相似，表明本研究準(zhǔn)確分析了芋屬的系統(tǒng)分類位置。芋屬中紅芽芋、荔浦芋與新西蘭芋（NC016753.1）聚在同一分支上，但3 種芋之間存在一定的遺傳距離，表明我國(guó)紅芽芋、荔浦芋與新西蘭芋存在遺傳差異，體現(xiàn)出我國(guó)特色芋種質(zhì)資源在芋屬中的獨(dú)特性與重要性，為深入研究我國(guó)芋特色種質(zhì)資源群體遺傳提供了參考。