牟紅婷

（中國(guó)石油大學(xué)（華東）計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 青島 266580）

1 引言

癌癥、心血管疾病等復(fù)雜疾病是影響人們身體健康的一個(gè)重要因素。其發(fā)病率高，遺傳方式不確定，致病機(jī)理異常復(fù)雜［1～2］。疾病性狀是復(fù)雜疾病的表現(xiàn)特征，是疾病的特征標(biāo)簽，而且復(fù)雜疾病多表現(xiàn)為連續(xù)的數(shù)量性狀變異，疾病性狀很容易被量化。因此為了了解復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)和疾病性狀相關(guān)的基因非常重要，這對(duì)復(fù)雜疾病的診斷、治療以及預(yù)防都起到至關(guān)重要的作用［3～4］。

復(fù)雜疾病并不只是由單個(gè)基因引起的，而是由多個(gè)基因共同決定，受多個(gè)基因共同影響。其中每個(gè)基因的作用相對(duì)較弱，但是它們的綜合作用卻可以產(chǎn)生顯著作用。在分離分析每一個(gè)基因時(shí)，都有產(chǎn)生巨大假陽(yáng)性的結(jié)果的可能性，因此我們很難發(fā)現(xiàn)相互作用的基因［5］。除此之外，人體中有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的基因，如果對(duì)全部基因進(jìn)行研究分析，無(wú)論是基因與基因之間的相互作用關(guān)系還是基因與疾病性狀之間的相互作用關(guān)系都是龐大且復(fù)雜的，這對(duì)數(shù)據(jù)的選擇工作也提出了新的挑戰(zhàn)。

所以本文提出利用結(jié)構(gòu)方程模型對(duì)基因和疾病相關(guān)性狀建模，量化了多個(gè)基因的綜合作用，以及多組基因和疾病相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與疾病性狀相關(guān)的基因。結(jié)構(gòu)方程模型可以用來(lái)解決多個(gè)變量之間的相互作用，明確量化單個(gè)變量對(duì)整體的作用和單個(gè)變量之間的作用［6～7］。與其他方法相比，結(jié)構(gòu)方程模型所估計(jì)的參數(shù)更加準(zhǔn)確，而且無(wú)需考慮控制變量；其次這種方法可以將測(cè)量誤差排除在外。

2 材料和方法

2.1 數(shù)據(jù)

癌癥的mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)從基因表達(dá)Omnibus（GEO）（https：//www.ncbi）獲得，我們對(duì)下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行了預(yù)處理，刪除部分與實(shí)驗(yàn)不相關(guān)的數(shù)據(jù)，對(duì)缺失值進(jìn)行刪除或填補(bǔ)，以及對(duì)基因數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化等。最終獲得肺癌數(shù)據(jù)（GSE103512、GSE74777）共176 例。臨床數(shù)據(jù)都包括樣本的年齡、腫瘤大小和腫瘤分期，以便識(shí)別和癌癥性狀相關(guān)的基因。

2.2 建立基因潛變量

利用結(jié)構(gòu)方程模型對(duì)癌癥基因和性狀建模，但是無(wú)法對(duì)所有的基因建模，所以我們從全部的基因中篩選差異表達(dá)基因，建立基因潛變量。使用limma 包通過(guò)分析比較正常樣本與疾病樣本的基因歸一化表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出表達(dá)最差異的部分基因。然后對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分層聚類，把最相似的基因聚為一類。因子分析（factor analysis）［8］是一種用來(lái)探討連續(xù)變量之間相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)方法。利用因子分析來(lái)確定代表一組基因相互作用的共同影響，并用一個(gè)變量來(lái)代替，這個(gè)變量就是潛變量。因子分析的數(shù)學(xué)模型其實(shí)是聯(lián)系潛在因子與可觀測(cè)變量的一系列方程組。

xi是第i 個(gè)可觀測(cè)變量。f是潛變量。λi是待估計(jì)的因子載荷，δi是各個(gè)觀測(cè)變量的度量誤差。

2.3 結(jié)構(gòu)方程模型

結(jié)構(gòu)方程模型即用變量的協(xié)方差矩陣來(lái)分析變量之間關(guān)系，模型中既包含有可觀測(cè)的顯在變量，也包含無(wú)法直接觀測(cè)的潛在變量。結(jié)構(gòu)方程模型包括兩個(gè)部分：測(cè)量模型和結(jié)構(gòu)模型。

測(cè)量模型一般由兩個(gè)方程式組成，分別規(guī)定了內(nèi)生的潛在向量η和內(nèi)生的可觀測(cè)變量Y之間，以及外生的潛在向量ξ和外生的可觀測(cè)變量X之間的聯(lián)系，即：

其中，ΛY表示Y對(duì)η的回歸系數(shù)矩陣(p×m)，ε表示Υ的測(cè)量誤差構(gòu)成的向量(P×1) 。 ΛX表示X對(duì)ξ的回歸系數(shù)矩陣(q×n)，δ表示X的測(cè)量誤差構(gòu)成的向量(q×1) 。

結(jié)構(gòu)方程模型規(guī)定了所研究的系統(tǒng)中假設(shè)的潛在外生變量和潛在內(nèi)生變量之間的因果關(guān)系，即

其中，B表示潛在內(nèi)生變量對(duì)潛在外生變量的效應(yīng)的系數(shù)矩陣(m×n)。Γ 表示潛在外生變量對(duì)潛在內(nèi)生變量的效應(yīng)的系數(shù)矩陣(m×n)，ζ表示殘差項(xiàng)構(gòu)成的向量(m×1) 。

為了確定模型參數(shù)，盡量減小模型中隱含的模型協(xié)方差矩陣與樣本協(xié)方差矩陣之間的差距，采用最大似然法，通過(guò)擬合得到矩陣方程中所有自由參數(shù)的值。

3 結(jié)果

3.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

因?yàn)榛驍?shù)目龐大，所以只利用其中一部分基因來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)分析。為了選取基因，使用limma 包通過(guò)分析比較正常樣本與疾病樣本的歸一化表達(dá)數(shù)據(jù)，來(lái)識(shí)別差異表達(dá)基因，結(jié)果如圖1 所示。選取最差異的前70 個(gè)基因?yàn)橐唤M命名為S1，選取中間70 個(gè)基因?yàn)镾2，最不差異的70 個(gè)基因?yàn)镾3。分別利用結(jié)構(gòu)方程模型進(jìn)行分析每組基因，比較并討論它們與疾病相關(guān)性狀之間的關(guān)系。

圖1 火山圖

圖1 為火山圖，基因差異表達(dá)分析的結(jié)果。橫軸是log2（FC），縱軸是-log10（P value），每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因。

3.2 建立結(jié)構(gòu)方程模型

在結(jié)構(gòu)方程模型中，把外生觀測(cè)變量基因變量設(shè)定為X，ξ即基因潛變量，用來(lái)表示基因的綜合作用。把Y設(shè)定為內(nèi)生觀測(cè)變量，η即疾病潛變量，用來(lái)表示疾病性狀的綜合作用。為了確定ξ，對(duì)S1組基因進(jìn)行聚類，如圖2所示。然后對(duì)不同的聚類結(jié)果分別做因子分析驗(yàn)證，同一個(gè)聚類下的基因的共同作用用一個(gè)潛變量來(lái)表示。這個(gè)過(guò)程是用Mplus軟件完成。

圖2 熱圖

為了確定潛變量的數(shù)目，使用貝葉斯信息準(zhǔn)則（BIC）［9～10］來(lái)決定把基因聚為幾類，以此確定結(jié)構(gòu)模型的最佳模型。根據(jù)表1 列出的結(jié)果可以看出，當(dāng)潛在類別數(shù)量逐漸增加時(shí)，模型的BIC 值先減小后增大。在8 個(gè)模型中，聚類5 的BIC 值最低（25167.205），所以選擇聚類5 為最佳模型，即有5個(gè)基因潛變量。

表1 基于不同聚類結(jié)果的因子分析結(jié)果

圖2 為熱圖，對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化，然后計(jì)算基因表達(dá)值之間的歐氏距離進(jìn)行聚類。

表1 為基于不同聚類結(jié)果的因子分析結(jié)果，通過(guò)模型評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)確定最佳測(cè)量模型。

在確定好ξ和η后，又選取肺癌患者臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)中的3 項(xiàng)作為內(nèi)生觀測(cè)變量Y，并且用一個(gè)內(nèi)生潛變量η來(lái)表示。建立了基因與疾病相關(guān)性狀之間的結(jié)構(gòu)方程模型，采用極大似然法進(jìn)行擬合［11］。對(duì)基因組S2和S3利用以上相同的方法建立結(jié)構(gòu)方程模型。通過(guò)因子分析驗(yàn)證，選擇模型7為S2組基因的最佳模型，選擇模型8 為S3 組基因的最佳模型。

在建立的結(jié)構(gòu)方程模型中，疾病潛變量和基因潛變量之間的路徑系數(shù)代表基因?qū)膊⌒誀畹挠绊憽?duì)3 組路徑系數(shù)進(jìn)行了分析比較，如表2。在S1 組中有5 個(gè)基因潛變量，最顯著的是0.835，這個(gè)基因潛變量代表9 個(gè)基因的綜合作用；S2 組中有7個(gè)基因潛變量，最顯著的是0.823，涵蓋了5 個(gè)基因；S3 組中有8 個(gè)基因潛變量，最顯著的是0.722，代表4個(gè)基因的綜合作用。

表2 為疾病潛變量和基因潛變量之間的路徑系數(shù)，從S1 到S3 模型，每組基因不同，所以基因潛變量的數(shù)目也不同。

3.3 相關(guān)性分析

為了驗(yàn)證得到的基因的綜合作用以及和疾病性狀的相關(guān)性，選出在三組實(shí)驗(yàn)中對(duì)疾病性狀影響最大的基因進(jìn)行分析。對(duì)單一基因和單一性狀做了雙變量相關(guān)性分析，然后對(duì)基因總體和性狀總體做了典型相關(guān)分析。結(jié)果如表3 和表4，雙變量相關(guān)性分析結(jié)果表明單個(gè)基因和單個(gè)性狀之間幾乎沒有相關(guān)性，而典型相關(guān)分析結(jié)果表明基因總體和性狀總體是顯著相關(guān)的。

表3 雙變量相關(guān)性分析結(jié)果

表4 典型相關(guān)分析結(jié)果

通過(guò)相關(guān)性分析，不僅可以說(shuō)明這部分基因是和疾病性狀或病人生存有明顯的關(guān)聯(lián)關(guān)系，更重要的是它們驗(yàn)證了基因的綜合作用，證明通過(guò)結(jié)構(gòu)方程模型得到的這部分基因是通過(guò)基因間的相互作用和疾病性狀顯著相關(guān)的。從而證明通過(guò)結(jié)構(gòu)方程模型得到的結(jié)論是有顯著意義的。

表3 為雙變量相關(guān)性分析結(jié)果。每一個(gè)基因和每一個(gè)性狀分別做雙變量相關(guān)性分析。是結(jié)構(gòu)方程模型中的疾病性狀。

表4 為典型相關(guān)分析結(jié)果。三組基因分別計(jì)算基因整體和所有性狀的的相關(guān)性。相關(guān)性＜0.05證明顯著相關(guān)。

我們還對(duì)得到的基因做了文獻(xiàn)挖掘，在我們得到的和疾病性狀相關(guān)的基因中，很多基因已有資料證明和肺癌或者癌癥的發(fā)病或治療是有密切聯(lián)系的。AQP4 是AOPs 水通道蛋白基因家族成員，AQPs 與癌癥生物學(xué)功能密切相關(guān)，并在二十多種人類癌細(xì)胞中都有表達(dá)［12］，與腫瘤的類型、等級(jí)、增殖、遷移及血管生成均相關(guān)［13～14］。MMP12 是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，對(duì)非小細(xì)胞肺癌的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值［15］。在肺腺癌腫瘤組織中表達(dá)水平上調(diào)，可能參與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展［16］。SPP1 是一種骨橋蛋白，它的表達(dá)同腫瘤的致癌作用和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能作為腫瘤發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志物。它在肺癌中高表達(dá)，是癌旁組織的6 倍以上，具有極為明顯的差異，提示可以用作臨床指標(biāo)用于監(jiān)測(cè)癌腫復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［17～18］。CDKN3 被認(rèn)為在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，CDKN3的過(guò)表達(dá)與卵巢癌、腎癌等多種實(shí)體瘤的增殖密切相關(guān)［19～20］。

4 結(jié)語(yǔ)

我們最后通過(guò)結(jié)構(gòu)方程模型獲得了三組和疾病性狀相關(guān)的基因，一共18 個(gè)基因。并且通過(guò)相關(guān)性分析驗(yàn)證他們的綜合作用是和疾病顯著相關(guān)的。復(fù)雜疾病的性狀是受許多基因控制的，和許多基因都相關(guān)，但是單個(gè)基因的作用是微弱的，只有它們的綜合作用才可以產(chǎn)生共顯性的效應(yīng)。所以在通過(guò)結(jié)構(gòu)方程模型得到的基因中，單個(gè)基因并不都是和該疾病相關(guān)的，但是基因和基因之間是存在相互作用的，他們綜合作用的結(jié)果是和疾病性狀顯著相關(guān)的，從而證明通過(guò)結(jié)構(gòu)方程模型得到的結(jié)論是有意義的。

基因數(shù)目龐大且基因間的作用復(fù)雜難以估計(jì)，結(jié)構(gòu)方程模型對(duì)于衡量多個(gè)基因的綜合作用，理清觀測(cè)變量、潛變量之間的關(guān)系無(wú)疑是一種很好的方法，然而結(jié)構(gòu)方程模型也有它的局限性。第一，結(jié)構(gòu)方程模型對(duì)樣本大小有較高的要求，特別是在假設(shè)較為復(fù)雜的模型的情況下，意味著有更多的未知參數(shù)需要估計(jì)；第二，由于結(jié)構(gòu)方程模型是一種驗(yàn)證性方法，它對(duì)所要研究的變量結(jié)構(gòu)要求有一定的先驗(yàn)信息，以便建模。在本文中，是對(duì)基因聚類后建模。在接下來(lái)的工作中，也可以針對(duì)這一點(diǎn)，利用其它方法，充分挖掘基因數(shù)據(jù)中的信息，建立更適合衡量基因綜合作用的模型。