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牛蒡子苷元抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路減輕單側輸尿管梗阻大鼠腎纖維化

2023-07-12 06:33高海洋陳曦張金存關曉海曹鳳宏康紹叁王磊么安亮劉健張立國
廣州中醫(yī)藥大學學報 2023年7期
關鍵詞:牛蒡子低劑量纖維化

高海洋, 陳曦, 張金存, 關曉海, 曹鳳宏, 康紹叁, 王磊, 么安亮, 劉健, 張立國

(華北理工大學附屬醫(yī)院泌尿外科,河北唐山 063000)

腎纖維化是幾乎所有慢性和進行性腎病常見的病理改變[1]。在慢性腎病中,纖維化是一種主動的生物合成愈合反應,其目的是保護組織免受損傷。然而,當纖維化獨立于初始刺激時,它會導致嚴重的器官損傷[2]。大量研究表明,天然產物用于預防和治療纖維化具有廣闊的前景。腎纖維化歸屬于中醫(yī)學“水腫”“癃閉”“虛勞”“腎勞”“腎風”“溺毒”“尿濁”等范疇,其病機多由脾腎虛衰,濕濁羈留,濁邪壅塞三焦,氣機升降失調,導致水濕、濕熱、痰濁、濁毒和瘀血等病理產物集聚所致,補益脾腎、清熱利濕、化濁排毒、活血化瘀為主要治法[3]。牛蒡子,味辛、苦,性寒,具有疏散風熱、宣肺透疹、解毒利咽的功效[4]。已有研究表明,牛蒡子可用于治療糖尿病腎臟病[5]。牛蒡子苷元(arctigenin)是從牛蒡中分離出的木脂素衍生化合物,現(xiàn)代藥理學研究表明,其具有抗病毒、抗炎、抗腎損傷的作用[6-10]。既往有研究表明,牛蒡子苷元可通過抑制炎癥、氧化應激來保護腎臟免受單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)誘導的損傷和纖維化[11]。減弱源自高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)/Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路傳導的纖維化信號可預防UUO 誘導的腎纖維化[12]。但牛蒡子苷元能否通過調控HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路減輕UUO大鼠腎纖維化尚未見報道。因此,本研究通過構建UUO 大鼠模型,探討牛蒡子苷元對UUO 大鼠腎纖維化的治療作用及機制,旨在為腎纖維化的臨床治療提供新的思路,現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物60 只SPF 級雄性SD 大鼠,8~10 周齡,體質量308 ~317 g,購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司,動物生產許可證號為SCXK(吉)2019-0007,于華北理工大學附屬醫(yī)院動物實驗室進行實驗,動物使用許可證號為SYXK(冀)2021-0014。大鼠飼喂標準飼料,飼養(yǎng)條件為溫度(23±2)℃,平均濕度(55±5)%,自由進食和飲水。本研究動物實驗方案已經華北理工大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準,批準編號:DWLS2021 第107 號。

1.2 主要藥物、試劑與儀器牛蒡子苷元(分子量:372.412,分子式:C21H24O6,分子結構純度≥98%,批號:HEJCX-00001978-025),購自合肥博美生物科技有限責任公司。將牛蒡子苷元溶于生理鹽水配制成1.0、2.0 mg/mL(0.002 7、0.005 4 mol/L)的牛蒡子苷元溶液。HMGB1過表達質粒購自武漢華聯(lián)科生物公司;白細胞介素(IL)-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒,末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒,均購自武漢亞科因生物公司;兔源α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)、HMGB1、TLR4、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、NF-κB p65、β-actin 等一抗、羊抗兔IgG 二抗,均購自美國Abcam 公司。全自動生化分析儀(型號:Senlo8011)、顯微鏡(型號:NE950)、酶標儀(型號:PT-3502B),均購自成都斯馬特科技有限公司;蛋白成像儀(型號:BOT-860SR),購自北京諾匯誠科技有限公司。

1.3 分組、建模與給藥將60 只SD 大鼠隨機分為假手術組、模型組、牛蒡子苷元低劑量組、牛蒡子苷元高劑量組、HMGB1 過表達質粒+牛蒡子苷元高劑量組(HMGB1+牛蒡子苷元高劑量組),每組12 只。除假手術組外,其余各組大鼠參照文獻研究[13]進行UUO 模型的構建。造模方法:采用腹腔注射3%戊巴比妥鈉(90 mg/kg)麻醉大鼠,切開大鼠左腹側表面,分離左側輸尿管并用絲線于上1/3 處雙結扎,使左腎處于完全梗阻的狀態(tài),最后縫合傷口。假手術組大鼠僅分離左側輸尿管,不進行結扎處理。術后第2天開始給藥,給藥劑量參照文獻研究[14]及前期預實驗結果進行確定。牛蒡子苷元低劑量組按照10 mg/kg的劑量灌胃牛蒡子苷元(10 mL/kg,0.002 7 mol/L),同時尾靜脈注射等體積生理鹽水;牛蒡子苷元高劑量組按照20 mg/kg的劑量灌胃牛蒡子苷元(10 mL/kg,0.005 4 mol/L),同時尾靜脈注射等體積生理鹽水;HMGB1+牛蒡子苷元高劑量組灌胃20 mg/kg的牛蒡子苷元外,同時尾靜脈注射8 μg/kg HMGB1 過表達質粒[15];假手術組、模型組灌胃并尾靜脈注射等體積生理鹽水。每日1次,持續(xù)14 d。

1.4 標本收集末次給藥結束后,代謝籠收集大鼠24 h尿液用于24 h尿蛋白定量(UTP)的檢測。麻醉后經心臟穿刺取血,離心得血清用于血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)的檢測。心臟穿刺取血后處死大鼠,收集大鼠左側腎組織,分為兩部分,一部分固定于4%多聚甲醛中,另一部分凍存于液氮中。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 腎功能指標的檢測 應用全自動生化分析儀檢測24 h UTP 及SCr、BUN 水平。

1.5.2 腎組織的蘇木素-伊紅(HE)染色及Masson染色 將固定于4%多聚甲醛的腎組織以石蠟包埋,切成4 μm 厚的切片,通過HE 染色法檢測腎組織病理變化,Masson 染色法檢測大鼠腎組織纖維化程度,均置于顯微鏡下觀察。

1.5.3 ELISA 法檢測腎組織中IL-1 β、IL-6水平 將液氮中凍存的腎組織解凍勻漿,嚴格按照IL-1β、IL-6 試劑盒說明書檢測腎組織勻漿中IL-1β、IL-6水平。

1.5.4 TUNEL 染色法檢測腎細胞凋亡 取腎組織石臘切片,應用TUNEL 試劑盒染色檢測腎細胞凋亡。TUNEL 染色陽性的細胞呈綠色熒光,細胞核呈藍色。細胞凋亡率(%)=(綠色熒光細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

1.5.5 蛋白印跡法檢測腎組織中蛋白表達 用放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解緩沖液提取腎組織勻漿中的總蛋白,將40 μg 蛋白質樣品進行電泳、轉膜、封閉,再將膜與按體積比稀釋的一抗包括α-SMA(1∶1 700)、Collagen I(1∶1 700)、HMGB1(1∶1 300)、TLR4(1∶1 450)、p-NF-κB p65(1∶1 350)、NF-κB p65(1∶1 350)、β-actin(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜,然后與羊抗兔IgG 二抗(1∶2 700)37 ℃溫育1 h,加入增強化學發(fā)光(ECL)底物染色5 min,曝光顯影,最后使用ImageJ 軟件對蛋白灰度值進行定量。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 25.0軟件處理數(shù)據,計量資料(均符合正態(tài)分布)以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較行SNK-q檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 牛蒡子苷元對UUO模型大鼠腎功能的影響表1 結果顯示:與假手術組比較,模型組大鼠24 h UTP、SCr、BUN 水平升高(P<0.05);與模型組比較,牛蒡子苷元低、高劑量組大鼠24 h UTP、SCr、BUN水平降低(P<0.05);與牛蒡子苷元低劑量組比較,牛蒡子苷元高劑量組大鼠24 h UTP、SCr、BUN水平降低(P<0.05);與牛蒡子苷元高劑量組比較,HMGB1+牛蒡子苷元高劑量組大鼠24 h UTP、SCr、BUN水平升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠腎功能比較Table 1 Comparison of renal function among each group of rats(±s)

注:①P<0.05,與假手術組比較;②P<0.05,與模型組比較;③P<0.05,與牛蒡子苷元低劑量組比較;④P<0.05,與牛蒡子苷元高劑量組比較

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2.2 牛蒡子苷元對UUO模型大鼠腎組織病理變化及纖維化的影響HE 染色結果顯示:與假手術組比較,模型組可見腎小球基底膜增厚、系膜增生,且有大量炎性細胞浸潤;與模型組比較,牛蒡子苷元低、高劑量組大鼠腎組織病理損傷減輕;與牛蒡子苷元高劑量組比較,HMGB1+牛蒡子苷元高劑量組大鼠腎組織病理損傷加劇。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理變化比較(HE染色法,×200)Figure 1 Comparison of histopathological changes among each group of rats(HE staining,×200)

Masson 染色結果顯示:與假手術組比較,模型組大鼠的腎組織中可見大量藍染區(qū)域,纖維化嚴重;與模型組比較,牛蒡子苷元低、高劑量組腎組織藍染區(qū)域減少,纖維化減輕;與牛蒡子苷元高劑量組比較,HMGB1+牛蒡子苷元高劑量組腎組織纖維化加劇。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織纖維化表現(xiàn)比較(Masson染色法,×200)Figure 2 Comparison of fibrosis manifestations of renal tissue among each group of rats(Masson,×200)

2.3 牛蒡子苷元對UUO模型大鼠腎組織中IL-1β、IL-6水平的影響表2 結果顯示:與假手術組比較,模型組IL-1β、IL-6 水平升高(P<0.05);與模型組比較,牛蒡子苷元低、高劑量組IL-1β、IL-6 水平降低(P<0.05);與牛蒡子苷元低劑量組比較,牛蒡子苷元高劑量組IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05);與牛蒡子苷元高劑量組比較,HMGB1+牛蒡子苷元高劑量組IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6水平比較Table 2 Comparison of IL-1β and IL-6 levels in renal tissue among each group of rats(±s,pg·mL-1)

表2 各組大鼠腎組織中IL-1β、IL-6水平比較Table 2 Comparison of IL-1β and IL-6 levels in renal tissue among each group of rats(±s,pg·mL-1)

注:①P<0.05,與假手術組比較;②P<0.05,與模型組比較;③P<0.05,與牛蒡子苷元低劑量組比較;④P<0.05,與牛蒡子苷元高劑量組比較

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2.4 牛蒡子苷元對UUO模型大鼠腎細胞凋亡的影響圖3、表3 結果顯示:與假手術組比較,模型組腎細胞凋亡率升高(P<0.05);與模型組比較,牛蒡子苷元低、高劑量組腎細胞凋亡率降低(P<0.05);與牛蒡子苷元低劑量組比較,牛蒡子苷元高劑量組腎細胞凋亡率降低(P<0.05);與牛蒡子苷元高劑量組比較,HMGB1+牛蒡子苷元高劑量組腎細胞凋亡率升高(P<0.05)。

圖3 各組大鼠腎細胞凋亡比較(TUNEL染色,×200)Figure 3 Comparison of renal cell apoptosis among each group of rats(TUNEL staining,×200)

表3 各組大鼠腎細胞凋亡率比較Table 3 Comparison of renal cell apoptosis rate among each group of rats(±s,%)

表3 各組大鼠腎細胞凋亡率比較Table 3 Comparison of renal cell apoptosis rate among each group of rats(±s,%)

注:①P<0.05,與假手術組比較;②P<0.05,與模型組比較;③P<0.05,與牛蒡子苷元低劑量組比較;④P<0.05,與牛蒡子苷元高劑量組比較

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2.5 牛蒡子苷元對UUO模型大鼠腎組織中纖維化相關蛋白α-SMA、CollagenⅠ表達的影響圖4、表4 結果顯示:與假手術組比較,模型組α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達升高(P<0.05);與模型組比較,牛蒡子苷元低、高劑量組α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達降低(P<0.05);與牛蒡子苷元低劑量組比較,牛蒡子苷元高劑量組α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達降低(P<0.05);與牛蒡子苷元高劑量組比較,HMGB1+牛蒡子苷元高劑量組α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達升高(P<0.05)。

圖4 各組大鼠腎組織α-SMA、Collagen I蛋白電泳條帶圖(Western Blot法)Figure 4 Comparison of electrophoretic bands of α-SMA and Collagen I in renal tissue among each group of rats(Western Blot method)

2.6 牛蒡子苷元對UUO模型大鼠腎組織中HMGB1/TLR4/NF-κB通路蛋白表達的影響圖5、表5 結果顯示:與假手術組比較,模型組HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白相對表達量升高(P<0.05);與模型組比較,牛蒡子苷元低、高劑量組HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白相對表達量降低(P<0.05);與牛蒡子苷元低劑量組比較,牛蒡子苷元高劑量組HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白相對表達量降低(P<0.05);與牛蒡子苷元高劑量組比較,HMGB1+牛蒡子苷元高劑量組HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白相對表達量升高(P<0.05)。

圖5 各組大鼠腎組織HMGB1/TLR4/NF-κB通路相關蛋白電泳條帶圖(Western Blot法)Figure 5 Comparison of electrophoretic bands of HMGB1/TLR4/NF-κB pathway-related proteins in renal tissue among each group of rats(Western Blot method)

3 討論

腎纖維化作為慢性腎病的一個關鍵步驟,其主要特征包括促纖維化因子的過度產生和沉積、腎小管間質炎癥反應、腎細胞大量凋亡等[16-18]。相關研究顯示,單側輸卵管梗阻(UUO)小鼠腎功能指標SCr、BUN水平以及血清中炎癥因子IL-1β、IL-6 水平升高,表明UUO 小鼠存在腎功能下降及炎癥反應[19];在UUO 后,包括Collagen I、α-SMA在內的多種纖維化蛋白在腎組織中的表達顯著增加,提示UUO 成功誘導了腎纖維化[20];腎細胞凋亡加速了腎纖維化的進展[21]。UUO是一種經典且廣泛使用的實驗性腎間質纖維化模型[22]。本研究構建了UUO 大鼠模型,HE 及Masson 染色結果顯示,模型組大鼠腎組織病理損傷及纖維化嚴重,且CollagenⅠ、α-SMA 的表達升高,表明UUO 誘導腎纖維化大鼠模型構建成功。本研究結果還顯示,模型組大鼠腎功能指標(24 h UTP、SCr、BUN)、炎性因子(IL-1β、IL-6)水平及腎細胞凋亡率顯著高于假手術組,提示UUO 誘導腎纖維化大鼠腎功能異常,炎癥反應及腎細胞凋亡加劇。經低、高劑量牛蒡子苷元處理后,UUO 大鼠腎組織病理損傷減輕,纖維化減少,24 h UTP、SCr、BUN、IL-1β、IL-6 水平及腎細胞凋亡率明顯降低,提示牛蒡子苷元可抑制UUO 大鼠腎纖維化及炎癥損傷。

HMGB1 是炎癥反應重要的調節(jié)劑,其可與TLR4 結合,通過髓樣分化因子88(MyD88)依賴性機制激活NF-κB 信號通路,進而促進炎癥細胞因子的產生,如IL-1β 和IL-6 等[23]。據報道:抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路可對造影劑腎病產生腎臟保護作用[24];抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 通路可減輕糖尿病腎病大鼠腎組織病理損傷[25];Lu等[26]研究表明,牛蒡子苷元能抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路,改善弓形蟲誘導的肝損傷小鼠肝臟炎癥。因此,本研究推測牛蒡子苷元可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路介導的炎癥反應在腎纖維化中起到一定的治療作用。本研究結果顯示,UUO 大鼠腎組織中HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白表達升高,推測HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路參與了UUO 大鼠腎纖維化進程。牛蒡子苷元干預后,UUO 大鼠腎組織中HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路上述蛋白表達明顯減少,推測牛蒡子苷元通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路減輕UUO 大鼠腎纖維化。為了驗證該推測結果,本研究將高劑量牛蒡子苷元處理的UUO 大鼠再用HMGB1 過表達質粒進行干預,結果顯示,HMGB1 逆轉了高劑量牛蒡子苷元對UUO 大鼠腎纖維化的抑制作用。

綜上所述,牛蒡子苷元對UUO 大鼠腎纖維化具有明顯的改善作用,其機制與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路有關。

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