馮萍 ，吳深寶 ，季峰

1.浙江大學國際健康醫(yī)學研究院，浙江 義烏 322000； 2.義烏市中心醫(yī)院，浙江 義烏 322000；3.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310000

膿毒癥（sepsis）是機體應對感染失衡導致的可危及生命的全身炎癥反應綜合征，最終會導致膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征[1]。華盛頓大學健康指標與評估研究所（IHME）對1990－2017年全球膿毒癥的發(fā)病率和病死率進行統(tǒng)計分析，結果顯示，2017年因膿毒癥死亡人數(shù)占全球死亡總人數(shù)的19.7%[2]。目前膿毒癥相關研究主要集中在肺臟、腎臟和肝臟等，但膿毒癥相關胰腺損傷同樣具有重要意義[3]。且胰腺損傷會進一步通過內分泌失調、炎癥及氧化應激反應使病情加劇[4]。因此，減輕胰腺損傷對治療膿毒癥十分重要。

半胱氨酸白三烯（CysLT）主要由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、單核細胞和巨噬細胞產生，作為炎癥介質廣泛存在于機體中[5]。阻斷或選擇性抑制CysLT對炎癥狀態(tài)（如哮喘、結腸炎及胰腺損傷）具有改善作用[6]。核因子（NF）-κB通路作為調控炎癥反應的重要信號通路，能誘導腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-1β等炎癥因子表達[7]，阻斷該通路可減輕相關器官炎癥損傷。CysLT受體1（CysLTR1）可通過NF-κB通路誘導炎癥細胞趨化和活化，從而促進炎癥反應發(fā)生發(fā)展[8]。

柴芍承氣湯是在大承氣湯基礎上加柴胡、黃芩、白芍組成。有研究表明，針對胰腺的缺血壞死，柴芍承氣湯能抑制胰蛋白酶分泌及活性，改善胰腺微循環(huán)并修復微血管內皮損傷，抑制炎癥因子釋放，從而改善相關癥狀[9-10]。但柴芍承氣湯改善膿毒癥繼發(fā)胰腺損傷的具體機制尚不清楚。本研究通過建立膿毒癥繼發(fā)胰腺損傷大鼠模型，檢測胰腺組織CysLTR1和NF-κB表達，探討柴芍承氣湯對膿毒癥胰腺損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性Wistar大鼠36只，體質量（320±30）g，購于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，動物許可證號SYXK（浙）2021-0012。飼養(yǎng)于溫度23～25 ℃、濕度55%～65% SPF動物房，自由進食飲水。本實驗經浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批（20221101）。

1.2 藥物及制備

柴芍承氣湯由白芍10 g、柴胡10 g、黃芩10 g、枳實10 g、厚樸10 g、生大黃10 g、玄明粉10 g組成，將前5味藥物飲片置于容器中，加入純凈水煮沸18 min，關火后加入生大黃浸泡2 min，過濾，在濾液中加入玄明粉，冷卻至室溫。湯劑由義烏市中心醫(yī)院中醫(yī)科制備。

1.3 主要試劑及儀器

脂質過氧化物（LPO）試劑盒，南京建成，貨號A106-1；谷胱甘肽（GSH）試劑盒，南京建成，貨號A006-1；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒，南京建成，貨號A044；RIPA組織細胞快速裂解液，北京索萊寶，貨號R0010；BCA蛋白定量試劑盒，美國Thermo，貨號PICPI23223； NC 膜， 美 國Millipore， 貨 號HATF00010；CysLTR1 抗體，上海碧云天，貨號Orb182861；NF-κB 抗體，美國CST，貨號#8242；TUNEL試劑盒，瑞士Roche公司，貨號11684817910；DAB 濃縮型試劑盒，上海長島生物，貨號FL-6001；免疫組化試劑盒，福州邁新生物，貨號KIT-5002；廣譜二抗，上海長島生物，貨號D-3004；蛋白預染Marker，F(xiàn)ermentas，貨號SM1811；HRP 標記二抗，上海碧云天，貨號分別為A0208、A0181、A0216。

電泳儀（Bio-Rad公司，型號mini protean 3 cell），電轉儀（大連競邁科技有限公司，型號PS-9），酶標儀（芬蘭雷勃酶標儀，型號MK3），正置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號CX41）。

1.4 分組、造模及給藥

36只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組、膿毒癥組和柴芍承氣湯組，每組12只。膿毒癥組和柴芍承氣湯組行盲腸結扎穿孔法建立膿毒癥模型[11]：術前大鼠禁食不禁水12 h，異氟烷吸入麻醉，于腹部行正中切口，暴露盲腸并結扎其根部，用16號針對盲腸穿刺3次形成腸瘺，并留置2 cm×2 mm橡皮條引流。將盲腸回納，逐層縫合腹部切口，皮下注射生理鹽水50 mL/kg抗休克。手術完畢放回鼠籠飼養(yǎng)觀察，自由進食飲水，手術全程遵循無菌原則。對照組僅行開關腹操作。柴芍承氣湯組于造模前1 h及造模后6 h各灌胃1次，灌胃體積5 mL/100 g，膿毒癥組和對照組灌胃等體積無菌生理鹽水。造模后6 h脫頸處死大鼠，造模及灌胃過程中各組均無大鼠死亡。

1.5 生化檢測

取相同質量胰腺組織，加入9 倍體積生理鹽水，4 ℃勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書操作分別檢測MPO、LPO、GSH水平。

1.6 免疫組化檢測

取胰腺組織（約1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm），經固定、包埋及切片后，進行抗原修復，滴加CysLTR1 一抗（1∶300）、NF-κB一抗（1∶1 000），4 ℃濕盒孵育過夜，滴加HRP標記二抗孵育，DAB顯色，封片。在100倍顯微鏡下，每個樣本隨機選取8～10個視野，使用Image Pro Plus軟件計算平均光密度。

1.7 Western blot檢測

胰腺組織加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，按照20 mg組織加入150～260 μL裂解液比例進行勻漿，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液，BCA法進行蛋白定量。蛋白上樣后，電泳分離蛋白，轉至NC 膜，將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入CysLTR1 一抗（1∶300）、NF-κB 一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶1 500），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，按1∶1 000加入HRP標記二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗滌，發(fā)光液顯色處理，凝膠成像系統(tǒng)掃描后，應用Quantity One軟件進行灰度值分析，計算目標蛋白灰度值/內參蛋白灰度值，即蛋白相對表達量。

1.8 TUNEL染色

胰腺組織切片加入TUNEL反應液50 μL，37 ℃反應1 h，洗滌后滴加POD液50 μL，37 ℃反應30 min，DAB染色，顯微鏡下觀察，以棕褐色為陽性表達，計算細胞凋亡率（凋亡細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%）。

1.9 相關性分析

將對照組及膿毒癥組大鼠進行整體分析，以膿毒癥組與對照組CysLTR1差值為橫坐標，NF-κB差值為縱坐標，采用雙變量線性回歸分析法求得回歸方程，計算相關系數(shù)（r）。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用Shapiro-Wilk法行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布用±s表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 柴芍承氣湯對模型大鼠胰腺組織髓過氧化物酶、脂質過氧化物、谷胱甘肽水平的影響

與對照組比較，膿毒癥組胰腺組織MPO、LPO水平顯著升高，GSH 水平顯著降低（P＜0.001）；柴芍承氣湯組胰腺組織MPO、LPO水平顯著降低，GSH水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠胰腺組織MPO、LPO、GSH水平比較（±s）

表1 各組大鼠胰腺組織MPO、LPO、GSH水平比較（±s）

注：與對照組比較，***P＜0.001；與膿毒癥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

GSH/（mg/g）5.53±0.38 1.68±0.37***2.90±0.37#組別對照組膿毒癥組柴芍承氣湯組只數(shù)12 12 12 MPO/（U/g）1.07±0.16 3.68±0.44***2.66±0.19#LPO/（μmoL/g）0.60±0.08 1.97±0.17***1.49±0.10##

2.2 柴芍承氣湯對模型大鼠胰腺組織半胱氨酸白三烯受體1、核因子-κB表達的影響

免疫組化結果顯示，與對照組比較，膿毒癥組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB 表達顯著升高（P＜0.001，P＜0.01）；與膿毒癥組比較，柴芍承氣湯組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB表達顯著降低（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB陽性表達（免疫組化染色，×200）

表2 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB表達比較（±s，平均光密度）

表2 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB表達比較（±s，平均光密度）

注：與對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與膿毒癥組比較，#P＜0.05

NF-κB 328.00±96.63 603.33±50.64**512.33±16.65#組別對照組膿毒癥組柴芍承氣湯組只數(shù)12 12 12 CysLTR1 594.67±124.31 1 164.00± 94.60***859.00± 41.39#

Western blot結果顯示，與對照組比較，膿毒癥組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB 蛋白表達顯著升高（P＜0.001）；與膿毒癥組比較，柴芍承氣湯組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB蛋白表達顯著降低（P＜0.001）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB蛋白免疫印跡

表3 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，***P＜0.001；與膿毒癥組比較，###P＜0.001

NF-κB 0.121 6±0.008 2 0.572 4±0.026 8***0.361 7±0.010 8###組別對照組膿毒癥組柴芍承氣湯組只數(shù)12 12 12 CysLTR1 0.082 5±0.001 4 0.545 6±0.010 5***0.382 7±0.030 3###

2.3 柴芍承氣湯對模型大鼠胰腺組織細胞凋亡的影響

與對照組比較，膿毒癥組大鼠胰腺組織細胞凋亡率顯著升高（P＜0.001）；與膿毒癥組比較，柴芍承氣湯組大鼠胰腺組織細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠胰腺組織細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×200）

表4 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB凋亡率比較（±s，%）

表4 各組大鼠胰腺組織CysLTR1、NF-κB凋亡率比較（±s，%）

注：與對照組比較，***P＜0.001；與膿毒癥組比較，##P＜0.01

凋亡率33.31±6.19 65.08±5.39***43.83±4.88##組別對照組膿毒癥組柴芍承氣湯組只數(shù)12 12 12

2.4 相關性分析結果

對免疫組化和Western blot 檢測的膿毒癥組與對照組CysLTR1、NF-κB差值進行相關性分析。結果顯示，NF-κB 表達與CysLTR1 表達呈顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01），2種檢測方法r分別為0.732 0和0.642 4。見表5。

表5 2種檢測方法的胰腺組織CysLTR1、NF-κB表達相關性分析

3 討論

膿毒癥是宿主對感染反應失調導致的全身炎癥反應綜合征，中心環(huán)節(jié)是失控性的炎癥反應，最終導致多器官功能衰竭和膿毒性休克，是重癥感染死亡的主要原因[12]。胰腺損傷是膿毒癥重要的器官功能障礙之一，膿毒癥引起的胰腺損害是由多因素、多條件介導的病理過程，可能涉及由細菌移位引起的內毒素血癥、臟器及血管缺血再灌注損傷、血栓形成和代謝及免疫功能抑制等多方面[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠胰腺組織細胞凋亡率顯著升高，表明在膿毒癥中存在胰腺組織細胞水平的損傷。研究顯示，危重患者如果在原發(fā)疾病基礎上出現(xiàn)胰酶水平升高，可使病情進一步惡化甚至導致死亡[15-16]。因此，對胰腺組織損傷機制的研究需要進一步深入。本研究也發(fā)現(xiàn)，膿毒癥損傷的胰腺組織中，反映炎癥程度的MPO和LPO水平上調，具有抗炎、抗氧化作用的GSH水平下調，提示膿毒癥引起的組織損傷是失調性炎癥反應。

CysLT是由花生四烯酸經5-脂氧酶催化而生成的一類活性很強的炎癥介質，是過敏性慢反應物質，具有強烈促炎作用，通過細胞表面受體CysLTR1 和CysLTR2 發(fā)揮作用[17]。CysLT 可以提高血管通透性，引起炎癥細胞趨化及浸潤，并引起相關炎癥因子釋放，誘導細胞發(fā)生氧化應激反應。不僅參與過敏性鼻炎、支氣管哮喘等發(fā)病過程，對缺血引起的腦細胞損傷同樣起到重要作用[18]。研究表明，CysLTR的特異性阻滯劑孟魯司特鈉能提高GSH水平，減輕脂質過氧化，抑制炎癥級聯(lián)反應，從而對膿毒癥引起的胰腺、小腸、肝臟損傷產生保護作用[19]。本研究膿毒癥組大鼠胰腺組織CysLTR1蛋白表達較對照組顯著升高，說明膿毒癥引起的胰腺損傷可能由CysLTR1介導。

NF-κB作為真核細胞的核轉錄因子，在正常細胞質中為無活性物質。當炎癥介質或內毒素等刺激后，NF-κB活化并轉移至細胞核內，與炎癥相關物質特定的基因序列結合并轉錄，從而引起炎癥反應[20]。研究發(fā)現(xiàn)，CysLT可引起NF-κB活性增強，促進靶基因轉錄，從而引起炎癥介質釋放增加[8]；Wang等[21]研究表明，激活CysLTR1介導的NF-κB信號通路可誘導神經炎癥，引起神經損傷。提示NF-κB作為CysLTR下游通路，受CysLTR1調控。本研究發(fā)現(xiàn)，CysLTR1與NF-κB表達呈正相關，在一定程度上表明CysLTR1 可介導NF-κB通路活化。NF-κB通路也參與由膿毒癥引起的組織器官損害：Shang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過抑制NF-κB通路減輕膿毒癥誘導的心肌損傷；El-Tanbouly等[23]也發(fā)現(xiàn)，NF-κB抑制劑雷公藤紅素可減輕因盲腸結扎和穿刺誘導的大鼠急性肝功能障礙。本研究膿毒癥組大鼠胰腺組織NF-κB表達顯著升高，提示膿毒癥引起的胰腺損傷可能存在NF-κB信號通路活化。

膿毒癥基本病機在于正虛毒損和絡脈瘀滯，根本為正氣不足、毒邪內蘊，并在此基礎上進一步發(fā)展成機體陽脫陰竭、氣陰兩虛。柴芍承氣湯是治療膿毒癥胰腺損傷的重要方劑，具有通里攻下、峻下熱結作用。研究顯示，大黃有效成分能有效抑制胰酶分泌和腸道細菌內毒素滋生[24]；柴胡中柴胡皂苷具有抑制胰蛋白酶、抗炎、調節(jié)免疫及解熱鎮(zhèn)痛作用[25]；白芍中白芍總苷可通過抑制NF-κB信號通路抑制炎癥反應，減少胰腺細胞凋亡[26]；厚樸可通過阻斷NF-κB信號通路減少TNF-α和IL-6釋放，從而減輕炎癥反應[27]。本研究中膿毒癥大鼠經柴芍承氣湯干預后，胰腺組織細胞凋亡顯著減少，MPO、LPO水平顯著降低，GSH水平升高，表明柴芍承氣湯對胰腺損傷具有一定保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，柴芍承氣湯可顯著降低胰腺組織CysLTR1、NF-κB表達，推測柴芍承氣湯可能通過抑制CysLTsR1/NF-κB通路從而減輕膿毒癥胰腺損傷。本研究可為臨床治療膿毒癥胰腺損傷提供新思路。