劉 暢，郭勁鵬，高 源，胡穎慧，楊 悅，宋宏偉，卜海東，于文全，王 昆，顧廣軍

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，寒地果樹育種與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 157000）（2 黑龍江省林業(yè)科學(xué)院牡丹江分院）（3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）（4 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所）

東北屬于寒地小蘋果栽培區(qū)，以楸子、山定子、海棠及綿蘋果等小蘋果為主，通過(guò)引種并同當(dāng)?shù)匾吧N進(jìn)行雜交育種，形成了北方寒地特有的蘋果資源群落[1]。大量的蘋果資源之間雜交使得群體間基因交流頻繁，導(dǎo)致表型變異幅度增大，增加了種質(zhì)資源的遺傳背景和親緣關(guān)系的鑒定難度。目前對(duì)于寒地蘋果資源的鑒定大多從葉片、枝條、果實(shí)等形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行[2-5]，由于受環(huán)境影響較大而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，SSR 標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好以及準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，已成為蘋果資源遺傳多樣性研究的主要方法[6-7]。Gharghani 等[8]利用篩選出的9 對(duì)SSR 位點(diǎn)對(duì)159 份蘋果資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)伊朗地方蘋果品種與俄羅斯的東方海棠關(guān)系比其他海棠品種更近，來(lái)自世界不同地區(qū)的老蘋果與西方蘋果、東方蘋果和伊朗蘋果的遺傳關(guān)系比其他野生品種更為密切；Gasia 等[9]利用10對(duì)SSR 引物對(duì)24 份波黑蘋果品種和15 個(gè)國(guó)外品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)傳統(tǒng)的本國(guó)品種與國(guó)外品種緊密地聚類在一起，而其他品種形成了獨(dú)立的聚類；Zhang 等[10]利用29 個(gè)SSR 引物對(duì)19 份克什米爾地區(qū)蘋果材料遺傳多樣性進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出218 個(gè)多態(tài)性等位基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)所有蘋果品種主要分為2 個(gè)大類，存在更廣泛的遺傳多樣性。

目前，針對(duì)中國(guó)北方寒地蘋果資源群體多樣性研究較少。本研究用篩選出多態(tài)性好的20 對(duì)熒光SSR 引物，對(duì)49 份寒地蘋果種質(zhì)資源進(jìn)行SSR 多態(tài)性分析、聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析，旨在揭示寒地蘋果資源遺傳多樣性特征和群體遺傳分化結(jié)構(gòu)，為寒地蘋果資源收集利用、親緣關(guān)系分析和分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試49 份寒地蘋果資源材料見表1，其中21份為在黑龍江野外對(duì)蘋果資源收集考察時(shí)獲得，6份為在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)考察時(shí)獲得，13 份取自國(guó)家果樹種質(zhì)公主嶺寒地果樹圃，其余9 份取自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院蘋果資源圃。

表1 49 份寒地蘋果資源

1.2 試驗(yàn)方法

2020 年5 月采集幼嫩葉片，采用德國(guó)QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit 提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。從Hokanson 等[11]、Liebhard 等[12]、Yamamoto等[13]和Guiford 等[14]報(bào)道的序列中選取擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在100～300 bp 并經(jīng)檢測(cè)具有高度多態(tài)性的SSR 引物20 對(duì)，引物相關(guān)信息見表2。SSR 反向引物和帶有6FAMTM 熒光標(biāo)記的SSR 正向引物均由上海生工有限公司合成。

PCR 體系參照Cao 等[15]的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物的純化體系參照高源等[16]的方法。PCR 反應(yīng)在Bio-Rad PTC-200 上進(jìn)行。熒光SSR 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后在美國(guó)ABI-3730 基因測(cè)序儀上進(jìn)行熒光檢測(cè)，收集原始數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用GeneMapper 3.0 軟件對(duì)ABI-3730 收集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得樣品在每個(gè)SSR 位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，即指紋數(shù)據(jù)。利用遺傳數(shù)據(jù)分析軟件GenAlEx 6.501 計(jì)算多態(tài)性等位基因數(shù)（Na）、SSR 位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、固定指數(shù)（F）及香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）等遺傳多樣性指標(biāo)，并分析種群間的分子變異（AMOVA）?；赟SR 不同位點(diǎn)，通過(guò)Excel 2017構(gòu)建（0，1）矩陣，利用NTSYS 1.2 構(gòu)建49 份寒地蘋果材料的進(jìn)化樹，使用STRUCTURE 2.3.4 分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)并確定最佳的群體分組。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

利用20 對(duì)多態(tài)性熒光SSR 引物對(duì)49 份寒地蘋果資源基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見表3，共擴(kuò)增出278 個(gè)多態(tài)性等位基因（Na）。多態(tài)性等位基因數(shù)最少為3.000（GD147），最多為21.000（CH01f07a和CH01f02），平均多態(tài)性等位基因數(shù)為13.850，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為100%。有效等位基因數(shù)（Ne）為1.353（NZ28f4）～12.637（CH01f07a），平均值為6.649。香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）為0.646（NZ28f4）～2.745（CH01f07a），平均值為2.065。觀察雜合度（Ho）為0.000（GD147）～0.776（GD15），平均值為0.569。期望雜合度（He）為0.261（NZ28f4）～0.921（CH01f07a），平均值為0.799。固定指數(shù)（F）為-0.026（GD15）～1.000（GD147），平均值為0.296，只有在GD15 中為負(fù)值，其余均為正值，說(shuō)明供試寒地蘋果資源群體內(nèi)含有雜合子較少。

表3 不同SSR 位點(diǎn)的遺傳多樣性特征

2.2 不同蘋果群體的遺傳多樣性和方差分析

49 份寒地蘋果資源分屬于3 個(gè)不同的群體（表4），群體分析發(fā)現(xiàn)中國(guó)蘋果的多態(tài)性等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)最多，分別為12.750、6.885、2.054；觀察雜合度楸子群體最高，為0.600，西洋蘋果群體最低，為0.480；期望雜合度全部群體均高于0.500，中國(guó)蘋果群體最高，為0.803，西洋蘋果群體最低，為0.635，整體上遺傳多樣性較高；期望雜合度與觀察雜合度差值最小的為楸子群體，差值最大的為中國(guó)蘋果群體；固定指數(shù)在各個(gè)群體中均為正值，其中在楸子群體中最小，為0.144，與其他兩個(gè)群體相比雜合子較多。對(duì)3 個(gè)群體進(jìn)行群體分子遺傳變異方差分析，群體內(nèi)方差分量的貢獻(xiàn)率占28%，個(gè)體內(nèi)方差分量的貢獻(xiàn)率占69%，遺傳變異顯著；群體間方差分量的貢獻(xiàn)率占3%，遺傳變異不顯著。

表4 3 個(gè)蘋果群體的遺傳多樣性

2.3 群體間的遺傳分化

按照所屬種劃分群體后計(jì)算Nei 遺傳距離和遺傳分化系數(shù)（表5），楸子群體與西洋蘋果群體間遺傳距離最大，為0.411；其次是西洋蘋果群體與中國(guó)蘋果群體，為0.305；楸子群體與中國(guó)蘋果群體間遺傳距離最小，為0.261。不同群體之間遺傳分化系數(shù)為0.047～0.081，西洋蘋果群體與楸子群體遺傳分化系數(shù)最高，為0.081；西洋蘋果群體與中國(guó)蘋果群體遺傳分化系數(shù)居中，為0.058；中國(guó)蘋果群體與楸子群體遺傳分化系數(shù)最低，為0.047；體現(xiàn)了不同群體地理位置和遺傳距離的相關(guān)性。

表5 寒地3 個(gè)蘋果群體間的遺傳距離和遺傳分化系數(shù)

2.4 寒地蘋果資源聚類分析

基于20 對(duì)引物對(duì)49 份供試材料的SSR 數(shù)據(jù)進(jìn)行UPGMA 聚類分析（圖1），遺傳距離為0.80～1.00，表明各種質(zhì)間親緣關(guān)系差異較大。在遺傳距離0.80 處供試的49 份蘋果資源分為2 個(gè)大類：第Ⅰ類包括18 份資源，全部是中國(guó)蘋果群體；第Ⅱ類包括31 份資源，其中楸子群體10 份，中國(guó)蘋果群體16 份，西洋蘋果群體5 份。在遺傳距離0.81處，第Ⅰ類進(jìn)一步分為Ⅰa 和Ⅰb 2 個(gè)亞類。其中Ⅰa 亞類包括124、甜豐、脆蘋、花紅、紫奎5 份資源；Ⅰb 亞類含有13 份資源，進(jìn)一步細(xì)分可以看出青皮大秋、大皮溝紅秋、大皮溝綠秋3 份資源聚為一類，雞心果、462、紫香3 份資源聚為一類，龍頭、龍頭窄葉等7 份資源聚為一類。

圖1 49 份寒地蘋果資源的UPGMA 聚類圖

2.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于SSR 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)對(duì)供試的49 份寒地蘋果資源進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，參照Evanno 等[17]的方法來(lái)確定K 值。設(shè)置推測(cè)群體數(shù)K 為1～8，重復(fù)10次，當(dāng)K＝2 時(shí)，ΔK 取得最大值（圖2），隨后急劇下降，推測(cè)49 份蘋果資源由于基因型不同分為2個(gè)類群（圖3）。不同群體的材料在2 個(gè)類群中均有分布，類群1 含有21 份資源，包括楸子群體3份、中國(guó)蘋果群體13 份和西洋蘋果群體5 份。類群2 含有28 份資源，包括楸子群體7 份、中國(guó)蘋果群體21 份。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與聚類結(jié)果相類似，UPGMA 聚類Ⅰ類中除去中國(guó)蘋果群體6 份全部歸于STRUCTURE 分組類群2 中，UPGMA 聚類Ⅱ類中楸子群體10 份中3 份、中國(guó)蘋果群體16 份中7 份和西洋蘋果群體5 份歸于STRUCTURE 分組類群1 中。

圖2 ΔK 值變化趨勢(shì)圖

圖3 K＝2 時(shí)，49 份寒地蘋果資源的遺傳結(jié)構(gòu)分析圖

3 討論

3.1 寒地蘋果資源遺傳多樣性

SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在揭示蘋果屬不同群體間遺傳差異具有廣泛應(yīng)用。Kumar 等[18]利用31 個(gè)SSR 位點(diǎn)對(duì)喜馬拉雅海棠進(jìn)行遺傳多樣性研究，共檢測(cè)出96 個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)SSR 位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為3.29個(gè)。Potts 等[7]利用10 個(gè)SSR 分子標(biāo)記對(duì)164 份蘋果資源進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出283 個(gè)等位基因，其中稀有等位基因百分率為39%。Ana 等[19]利用20 個(gè)SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)西班牙東北部地區(qū)的183 份蘋果種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)不同群體中多態(tài)位點(diǎn)的檢出率為100%。出現(xiàn)差異的原因可能與所用標(biāo)記引物和供試群體類型相關(guān)。本研究利用20 對(duì)SSR引物對(duì)49 份寒地蘋果資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出278 個(gè)多態(tài)性等位基因，平均多態(tài)性等位基因數(shù)為13.850，每對(duì)引物在群體中擴(kuò)增出的多態(tài)位點(diǎn)的百分率為100%，表明供試寒地蘋果不同群體間基因多態(tài)性豐富。

有效等位基因數(shù)（Ne）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）、期望雜合度（He）等是評(píng)價(jià)群體變異程度高低的重要指標(biāo)。本研究中，49 份寒地蘋果資源總體遺傳多樣性的期望雜合度（He＝0.799）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（I＝2.065）和有效等位基因數(shù)（Ne＝6.649）均高于變?nèi)~海棠[20]（He＝0.438 9，I＝0.628 2，Ne＝1.81）、湖北海棠[21]（He＝0.262 8，I＝0.401 5，Ne＝1.437 5）和三葉海棠[22]（He＝0.699，I＝1.458，Ne＝3.954）等蘋果屬植物。Lassois 等[23]發(fā)現(xiàn)，雜合度大于0.5的群體具有較高的遺傳多樣性。本研究中49 份寒地蘋果資源的期望雜合度（He）均高于0.5，遺傳多樣性相對(duì)較高。雜合度觀測(cè)值和雜合度期望值的相似程度也反映了群體的遺傳多樣性，差值越小，遺傳多樣性越高。本研究中楸子差值小于西洋蘋果和中國(guó)蘋果，說(shuō)明楸子群體遺傳多樣性高于其他兩個(gè)群體。固定指數(shù)大小也能體現(xiàn)群體的遺傳差異，固定指數(shù)為正值且數(shù)值越大，多樣性越小。本研究結(jié)果顯示楸子群體的固定指數(shù)最小，為0.144，與其他兩個(gè)群體相比雜合子較多。Urrestarazu 等[24]利用16 對(duì)SSR 引物對(duì)493 份本地品種和45 個(gè)參考品種共擴(kuò)增出267 個(gè)等位基因，其中參考品種僅占56%。Wasim 等[25]基于SSR 對(duì)喜馬拉雅北部寒冷地區(qū)29 份蘋果資源的遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，種群內(nèi)遺傳變異占93%，而種群間的遺傳變異僅占7%。本研究顯示，49 份寒地蘋果資源群體間變異占3%，顯著低于前人研究結(jié)果，但整體趨勢(shì)均顯示變異主要存在于群體內(nèi)，而不是群體間。本研究中楸子群體多樣性指標(biāo)（He＝0.700，I＝1.509，Ne＝4.245）均低于高源等[26]對(duì)楸子種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究（He＝0.868，I＝2.446，Ne＝9.399）。其原因一方面是材料全部采自中國(guó)東北，地域過(guò)于集中；另一方面群體數(shù)量太少，可進(jìn)一步增加品種來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。鑒于楸子大多為地方栽培品種且分布廣泛，建議在寒地蘋果育種中加大對(duì)楸子群體的考察收集，豐富群體的遺傳多樣性。

3.2 寒地蘋果資源遺傳結(jié)構(gòu)

群體間遺傳分化是評(píng)價(jià)群體變異的重要指標(biāo)，F(xiàn)st 值的高低反映群體間的遺傳差異程度。Wright[27]認(rèn)為，群體Fst 值在0～0.05，各種群間不存在分化；Fst 值在0.05～0.15 為中度分化；Fst 值在0.15～0.25為高度分化。本研究中楸子群體與中國(guó)蘋果群體間遺傳距離最小，為0.261，F(xiàn)st 值最低，為0.047，群體間不存在分化；楸子群體與西洋蘋果群體間遺傳距離最大，為0.411，F(xiàn)st 值最高，為0.081，其群體間屬于中度分化。推測(cè)原因是寒地蘋果品種選育中優(yōu)先選擇當(dāng)?shù)亻弊幼饔H本與蘋果雜交，存在基因滲透且交流頻繁，導(dǎo)致楸子群體與中國(guó)蘋果群體間無(wú)分化。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)群體之間的遺傳距離與遺傳差異相關(guān)，這與高源等[28]在對(duì)栽培種楸子的遺傳多樣性上面的研究結(jié)果一致。

為進(jìn)一步明確各群體遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)49 份寒地蘋果資源進(jìn)行UPGMA 聚類，發(fā)現(xiàn)在遺傳距離0.80處被分為2 個(gè)大類，與STRUCTURE 群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致，但是在同類內(nèi)部?jī)煞N遺傳關(guān)系分析結(jié)果并不完全一致，第Ⅰ類全部為中國(guó)蘋果，其中雞心果、甜豐、脆蘋、花紅、紫香、紫奎在群體結(jié)構(gòu)中與楸子、西洋蘋果歸為一類，第Ⅱ類中楸子全部聚為一類，其中伊春小果海棠、伊春大果海棠、日新海棠在群體結(jié)構(gòu)中與中國(guó)蘋果和西洋蘋果聚為一類，楸子群體與中國(guó)蘋果群體聚類比較緊密，又與西洋蘋果群體相互交錯(cuò)，各種群遺傳距離和類群歸屬與地理位置不完全相關(guān)。Silva 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，種群的雜交方式對(duì)種群分布有重要影響，所以我們推測(cè)俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)和黑龍江省相鄰，楸子群體大多分布在人類居住區(qū)附近，極易受到人為擴(kuò)散產(chǎn)生屬內(nèi)自然雜交，導(dǎo)致基因滲透。同時(shí)本研究中采集各群體數(shù)量不一致對(duì)聚類結(jié)果可能會(huì)有一定影響，因此應(yīng)加大不同種群蘋果資源收集力度來(lái)完善遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)20 對(duì)多態(tài)性SSR 引物開展蘋果群體的遺傳多樣性分析，49 份寒地蘋果資源總體遺傳多樣性較高，中國(guó)蘋果群體遺傳多樣性最高，西洋蘋果群體遺傳多樣性最低，遺傳變異主要存在于種群內(nèi)的個(gè)體間（28%）和個(gè)體內(nèi)（69%）。49 份寒地蘋果資源共分為2 個(gè)大類，不同資源相互交錯(cuò)，結(jié)果表明遺傳距離和類群歸屬與地理位置不完全相關(guān)，各群體間存在基因滲透和遺傳分化。