陸苑 陸玉婷 楊思敏 馮學(xué)珍 伍善廣

摘 要：為了從金錢(qián)菇中快速分離出降血壓肽，利用超聲細(xì)胞破碎法提取金錢(qián)菇蛋白，采用透析、超濾的方法對(duì)提取物進(jìn)行純化，以固定化金屬親和磁性脂質(zhì)體（metal affinity-immobilied magnetic liposome，MA-IML）作為吸附介質(zhì)，以金錢(qián)菇提取物為吸附對(duì)象，吸附分離其中的降血壓肽，并解析其結(jié)構(gòu)，利用分子對(duì)接分析其結(jié)合血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-I converting enzyme， ACE）的能力。結(jié)果表明：對(duì)金錢(qián)菇提取液用透析、超濾的方法進(jìn)行純化后，蛋白含量由37.67%提高至51.18%，多糖含量由26.80%降低至6.90%，ACE抑制率由61.83%提高至79.77%，純化后更有利于分離降血壓肽；用MA-IML粒子吸附分離出金錢(qián)菇純化液中的降血壓活性組分，經(jīng)反相高效液相色譜法分析其為單一組分，該組分為五肽，其氨基酸序列為苯丙氨酸-丙氨酸-色氨酸-丙氨酸-酪氨酸（Phe-Ala-Trp-Ala-Tyr，F(xiàn)AWAY），IC50為179 μmol/L。分子對(duì)接模擬表明，F(xiàn)AWAY能與ACE自發(fā)發(fā)生結(jié)合并形成穩(wěn)定的構(gòu)象。該研究制備的MA-IML可作為從金錢(qián)菇中分離降血壓肽的有效工具。

關(guān)鍵詞：磁性脂質(zhì)體；金錢(qián)菇；降血壓肽；血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶（ACE）；分離鑒定；分子對(duì)接

中圖分類號(hào)：R284.2 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2023.03.016

0 引言

高血壓是最常見(jiàn)的慢性疾病，是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，也是世界范圍內(nèi)患者死亡的主要原因[1-2]。血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-I converting enzyme， ACE）通過(guò)將血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II，并催化血管舒張劑——緩激肽的降解，在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[2]。換言之，ACE抑制劑可抑制ACE，降低血壓。

從天然產(chǎn)物蛋白質(zhì)中提取的ACE抑制劑比合成藥物更安全。許多研究報(bào)道了從牛奶、豆類、蛋、魚(yú)和乳制品等天然產(chǎn)物中提取、分離和純化得到ACE抑制劑[3-4]。由于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物很復(fù)雜，ACE抑制劑的純化和鑒定的步驟存在一定困難[5]。親和層析法是對(duì)多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化的有效方法[6]。1992年，Winzerling等[7]首次報(bào)道了固定化金屬親和色譜法（immobilized metal affinity chromatography， IMAC），IMAC在純化工藝中具有效率高、純度高、成本低的優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)有報(bào)道，利用IMAC對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行純化[8-12]。2014年，Nagami等[13]開(kāi)發(fā)了一種新的色譜技術(shù)——金屬親和固定化脂質(zhì)體色譜（metal affinity-immobilized liposome chromatography， MA-ILC），同時(shí)具有IMAC和固定化脂質(zhì)體色譜ILC的特性。在IMAC中，蛋白質(zhì)或多肽的分離取決于與金屬離子的親和性差異，而在ILC中脂質(zhì)體通過(guò)疏水相互作用與多種蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合。然而，MA-ILC的預(yù)處理步驟和操作過(guò)程比較復(fù)雜。有研究報(bào)道磁性固定化金屬親和分離介質(zhì)能顯著提高分離效率[14]。

為了簡(jiǎn)化分離操作，本課題組結(jié)合磁性技術(shù)和MA-ILC的分離特性，制備了一種新的固定化金屬親和磁性脂質(zhì)體（metal affinity-immobilized magnetic liposome， MA-IML）[15]，并成功地將其應(yīng)用于從長(zhǎng)蛇鯔蛋白水解產(chǎn)物中分離出ACE抑制肽[16]。用這種磁性脂質(zhì)體粒子吸附蛋白質(zhì)或多肽后，可簡(jiǎn)單地用磁鐵快速分離吸附介質(zhì)和溶液。

食用菌是健康研究的熱門(mén)領(lǐng)域，具有極高的保健和藥用價(jià)值，從食用菌（如松茸、姬菇、巨大口蘑、多脂鱗傘、雙孢蘑菇等）中分離出的生物活性肽被發(fā)現(xiàn)有降血壓的功效[17-18]。金錢(qián)菇（Lentinus edodes）是一種幼小型、未開(kāi)傘的香菇，呈小圓形，因像銅板般形狀而得名。目前尚未見(jiàn)從金錢(qián)菇中提取分離降血壓活性肽的相關(guān)報(bào)道，故本研究選取金錢(qián)菇為研究對(duì)象，通過(guò)超聲破碎提取后對(duì)蛋白進(jìn)行純化，以前期研究制備的MA-IML粒子為吸附介質(zhì)，分離金錢(qián)菇中的降血壓肽，為從其他食用菌中快速篩選降血壓肽提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金錢(qián)菇，廣西平南縣紅心食品有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL）、血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶（ACE），北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；卵磷脂，上海太偉藥業(yè)股份有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，無(wú)水乙醇、氨水、硫酸鎳等其他試劑均為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀UltiMate3000，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1900，島津儀器（蘇州）有限公司；酶標(biāo)儀1510，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀AXIMA Performance，島津（中國(guó)）有限公司；依利特色譜柱Hypersil ODS，大連依利特分析儀器有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀JY98-III，寧波新芝生物有限公司；真空冷凍干燥機(jī)LGJ-10，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會(huì)社（中國(guó)）；恒溫水浴搖床，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；恒溫水浴鍋，常州蒙特儀器制造有限公司；數(shù)顯電動(dòng)攪拌器，常州普天儀器制造有限公司；電子天平，德國(guó)塞利多斯集團(tuán)（中國(guó)）等。

1.3 方法

1.3.1 原材料處理

金錢(qián)菇粉碎、過(guò)篩，利用超聲細(xì)胞破碎儀，以水為溶劑、按料液比1∶10，在一定pH條件下進(jìn)行超聲提取，離心，2%活性炭脫色，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空干燥，得到金錢(qián)菇浸膏，待用。

1.3.2 多糖和蛋白濃度的測(cè)定

1.3.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

由于沒(méi)有市售的香菇多糖標(biāo)準(zhǔn)品，類似實(shí)驗(yàn)都用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)測(cè)定多糖濃度[19]。根據(jù)文獻(xiàn)[20]，采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖的濃度。將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至0.1 mg/mL，分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL離心管中，加純化水使總體積為2 mL。將5%苯酚溶液1 mL依次加到各離心管中，再加入5 mL濃硫酸，混勻，置于沸水浴15 min，冷卻后用紫外分光光度計(jì)在490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

根據(jù)文獻(xiàn)[21]，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制500 μg/mL 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。將500 μg/mL 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液按0、4、8、12、16、20 μL分別加入到6支1.5 mL離心管里，然后加入純化水使其總體積為20 μL，依次向各管加入BCA工作液200 μL，混勻后在37 ℃的水浴中孵育30 min，用酶標(biāo)儀在562 nm處測(cè)定吸光度。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 ACE抑制率的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[22]，采用高效液相色譜法測(cè)定吸附蛋白的ACE抑制率。色譜柱：依利特Hypersil ODS，4.6 mm×150.0 mm，5 μm；流動(dòng)相：A相，甲醇；B相，水（含0.1%三氟乙酸）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm。

樣品處理：配制0.1 mol/L硼酸緩沖液，將待測(cè)樣品經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，加入ACE溶液，在37 ℃水浴中恒溫振蕩10 min，然后加入5 mmol/L的HHL溶液，在37 ℃水浴中恒溫振搖30 min，最后加入2 mol/L的HCl使反應(yīng)終止。按上述色譜條件進(jìn)樣分析，樣品中蛋白對(duì)ACE的抑制率按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

IP = [1 ? （Atest/Acontrol）] × 100%. ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（1）

式中：IP表示抑制率，Atest表示待測(cè)樣品的峰面積，Acontrol表示對(duì)照組的峰面積。

1.3.4 金錢(qián)菇溶液的純化

取適量金錢(qián)菇浸膏用純化水溶解得到金錢(qián)菇粗溶液。采用透析和超濾的方法對(duì)金錢(qián)菇粗溶液進(jìn)行純化。取金錢(qián)菇粗溶液放在扎好一端口的3KD透析袋中，扎緊另一端口，置錐形瓶中，加200 mL純化水，37 ℃恒溫振蕩搖床2 h，倒出洗脫液，重復(fù)透析一次，合并洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到金錢(qián)菇穿透液。將金錢(qián)菇穿透液置于3KD超濾管中，14 000g（g為重力加速度）離心15 min，將超濾管內(nèi)未濾下的金錢(qián)菇穿透液取出，濾液為金錢(qián)菇純化液。為確定透析和超濾后金錢(qián)菇溶液純化的效果，根據(jù)1.3.2和1.3.3的方法測(cè)定并比較金錢(qián)菇粗溶液、金錢(qián)菇穿透液和金錢(qián)菇純化液的多糖含量、蛋白含量和ACE抑制率。

1.3.5 固定化金屬磁性脂質(zhì)體的制備

按照文獻(xiàn)[15]的方法制備MA-IML粒子。首先，采用化學(xué)共沉淀法，以FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O為原料，制備磁性Fe3O4粒子。其次采用薄膜分散法，以N-十六烷基亞氨基二乙酸和卵磷脂為原料、無(wú)水乙醇為溶劑，旋蒸得到脂質(zhì)體薄膜。將Fe3O4粒子用少量純化水混勻后倒入上述薄膜中蕩洗，使脂質(zhì)體充分包裹住磁性Fe3O4粒子，磁棒吸附粒子，棄去上清，加入純化水多次洗滌粒子直至上清液澄明。最后將磁性粒子置于0.05 mol/L的硫酸鎳溶液中浸泡過(guò)夜，使鎳離子連接到磁性脂質(zhì)體粒子上，即得MA-IML。

1.3.6 金錢(qián)菇降血壓活性組分的分離與分析

以MA-IML粒子為吸附介質(zhì)，參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行吸附反應(yīng)。取適量金錢(qián)菇溶液和粒子置于10 mL離心管中，在30 °C恒溫?fù)u床進(jìn)行吸附反應(yīng)30 min，磁性吸附分離粒子，用純化水反復(fù)多次洗滌粒子，直到上清液檢測(cè)不到蛋白（紫外檢測(cè)280 nm處吸光度為0），保證粒子中無(wú)游離蛋白。然后往粒子中加入0.05 mol/L稀鹽酸25 mL，在30 °C恒溫?fù)u床中反應(yīng)2 h，以洗脫吸附在粒子上的蛋白，磁性吸附分離粒子，收集洗脫液，調(diào)pH至中性，旋蒸濃縮，微孔濾膜過(guò)濾，得到蛋白溶液。重復(fù)多次吸附實(shí)驗(yàn)，收集金錢(qián)菇蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)1.3.3的方法測(cè)定蛋白的ACE抑制率，用線性回歸分析計(jì)算半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration， IC50），即ACE抑制率為50%時(shí)的蛋白濃度。蛋白的IC50越小，ACE抑制活性（即降血壓活性）越高。

采用反相高效液相色譜法（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）[10]分析收集金錢(qián)菇蛋白，即降血壓活性組分。色譜柱：依利特Hypersil ODS，4.6 mm×150.0 mm，5 μm；流動(dòng)相：A相，水（含1%三氟乙酸）；B相，乙腈；梯度：0～60 min，0～50% B；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

1.3.7 金錢(qián)菇降血壓肽的序列鑒定與驗(yàn)證

將收集到的金錢(qián)菇降血壓活性組分用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry， MALDI-TOF）質(zhì)譜儀對(duì)降血壓肽進(jìn)行分析，獲得一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖，解析降血壓肽的氨基酸序列。由吉爾生化（上海）有限公司合成解析出的降血壓肽。根據(jù)1.3.3的方法測(cè)定降血壓肽的ACE抑制率，計(jì)算IC50，驗(yàn)證其ACE抑制活性。

1.3.8 分子對(duì)接

將鑒定得到的降血壓肽與ACE進(jìn)行分子對(duì)接模擬，以進(jìn)一步確認(rèn)降血壓肽和酶之間的相互作用。將核心蛋白名稱（ACE）輸入 PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)，在“Scientific Name of Source Organism”中設(shè)置篩選條件為“Homo sapien & X-RAY Diffraction”，獲取“Summary Reports”，選中“l(fā)igand”并按“Resolution： Best to Worst”排序，得到最適合的PDB ID：1O86。運(yùn)用薛定諤軟件對(duì)蛋白受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接，驗(yàn)證蛋白與配體之間的互作關(guān)系。一般認(rèn)為，對(duì)接得分小于0，提示配體分子與受體蛋白能自發(fā)結(jié)合；對(duì)接得分小于-5，提示結(jié)合具有顯著性，且分值越小，表示配體與受體的結(jié)合能力越強(qiáng)，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖和蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

2.1.1 多糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，通過(guò)線性回歸得到吸光度（y）和葡萄糖質(zhì)量濃度（x）關(guān)系的方程：y =10.62x+0.005 6（相關(guān)系數(shù)R2=0.996 0），線性范圍為0.01～0.05 mg/mL，在此范圍內(nèi)吸光度和葡萄糖質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。采用苯酚硫酸法建立的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于測(cè)定金錢(qián)菇溶液中的多糖質(zhì)量濃度及多糖含量。

2.1.2 蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，通過(guò)線性回歸得到吸光度（y）和蛋白質(zhì)量濃度（x）關(guān)系的方程：y =0.001 1x+0.023 1（R2=0.990 8），線性范圍為200～1 000 μg/mL，在此范圍內(nèi)吸光度和蛋白質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。采用BCA法建立的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于測(cè)定后續(xù)金錢(qián)菇溶液中的蛋白質(zhì)量濃度及蛋白含量。

2.2 金錢(qián)菇溶液的純化結(jié)果

根據(jù)葡萄糖和蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品體積和金錢(qián)菇浸膏的初始質(zhì)量，可以計(jì)算得到金錢(qián)菇溶液樣品中的多糖含量和蛋白含量。從表1的對(duì)比結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)透析和超濾，金錢(qián)菇純化液與未經(jīng)純化的金錢(qián)菇粗溶液相比，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由26.80%降低至6.90%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)由37.67%增加至51.18%，ACE抑制率由61.83%增加至79.77%，說(shuō)明透析和超濾的方法能有效提高金錢(qián)菇溶液中的活性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，除去大部分會(huì)影響活性蛋白分離的糖類，從而有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)從金錢(qián)菇溶液中分離出活性蛋白。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以金錢(qián)菇純化液為分離降血壓活性蛋白的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.3 金錢(qián)菇降血壓活性組分的分析結(jié)果

以MA-IML粒子為吸附介質(zhì)，金錢(qián)菇純化液為吸附對(duì)象，進(jìn)行多次吸附實(shí)驗(yàn)收集蛋白，測(cè)得金錢(qián)菇蛋白的IC50為0.118 mg/mL。這表明金錢(qián)菇蛋白的ACE抑制活性較高，也證明利用MA-IML粒子可以有效吸附分離得到金錢(qián)菇溶液中的降血壓活性組分。

利用RP-HPLC對(duì)吸附分離出的金錢(qián)菇降血壓活性組分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示，色譜圖中有一個(gè)明顯的單峰。這說(shuō)明從金錢(qián)菇溶液中分離得到的降血壓活性組分為單一組分，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以直接以濃縮后的金錢(qián)菇蛋白吸附液為對(duì)象進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析。

2.4 金錢(qián)菇降血壓肽的氨基酸序列分析與驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)金錢(qián)菇降血壓活性組分進(jìn)行質(zhì)譜分析和鑒定，得到的一級(jí)質(zhì)譜圖如圖4所示，圖中有1個(gè)豐度最高的母離子質(zhì)荷比（m/z）為656，可推測(cè)為分子量656的多肽。選擇這個(gè)m/z為656的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到如圖5所示的二級(jí)質(zhì)譜圖（肽圖），結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜圖中的碎片離子峰對(duì)這一降血壓肽進(jìn)行氨基酸序列分析，推測(cè)得到的氨基酸結(jié)構(gòu)信息如表2所示。

根據(jù)所用質(zhì)譜儀的碎片斷裂模式及18種基本氨基酸的分子量，從二級(jí)質(zhì)譜圖中可以找到部分b離子和y離子的碎片離子峰，推測(cè)從金錢(qián)菇溶液中吸附分離出來(lái)的降血壓肽為表2所示的氨基酸序列：苯丙氨酸-丙氨酸-色氨酸-丙氨酸-酪氨酸（Phe-Ala-Trp-Ala-Tyr，F(xiàn)AWAY）。將這個(gè)序列的五肽合成出來(lái)之后，測(cè)定其ACE抑制率，計(jì)算得到其IC50值為179 μmol/L，與上述初步測(cè)定的金錢(qián)菇蛋白IC50值非常接近，故可確定從純化后的金錢(qián)菇溶液中吸附分離出來(lái)的活性組分是序列為FAWAY的五肽。

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

降血壓肽與ACE結(jié)合才能發(fā)揮抑制ACE的作用。二者之間的結(jié)合能力，可以利用薛定諤軟件對(duì)分離得到的降血壓肽FAWAY和ACE進(jìn)行分子對(duì)接模擬，對(duì)接模型如圖6所示，F(xiàn)AWAY與ACE之間可以形成6個(gè)氫鍵、1個(gè)鹽橋和2個(gè)π鍵。模擬得到的對(duì)接得分為-6.592，表明FAWAY與ACE可以自發(fā)發(fā)生結(jié)合，且具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，結(jié)合構(gòu)象較穩(wěn)定。分子對(duì)接結(jié)果預(yù)測(cè)了從金錢(qián)菇中分離出來(lái)的降血壓肽FAWAY能夠與ACE發(fā)生相互作用，從而發(fā)揮其對(duì)ACE的抑制作用。

3 討論

3.1 金錢(qián)菇溶液的純化

降血壓肽通常是由2～12個(gè)氨基酸組成的短肽[23]。由于實(shí)驗(yàn)以金錢(qián)菇提取物為分離降血壓肽的對(duì)象，溶液中除了不同分子量大小的蛋白質(zhì)和多肽外，可能還含有較多的香菇多糖，會(huì)影響小分子活性蛋白的分離，因此，考慮用常見(jiàn)的透析和超濾的方法來(lái)除去多糖和大分子蛋白，提高金錢(qián)菇溶液中活性蛋白的純度。此外，金錢(qián)菇穿透液中也檢測(cè)到少量蛋白，說(shuō)明可能有部分疏水性較強(qiáng)的降血壓肽與超濾膜發(fā)生了相互作用而吸附在膜上[23]，未進(jìn)入濾液中。有文獻(xiàn)報(bào)道用大孔吸附樹(shù)脂來(lái)純化燕麥肽[24]，使多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由66.76%降低至36.61%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)由28.38%增加至62.93%，ACE抑制率由65.76%增加至78.56%，本研究的純化效果與文獻(xiàn)報(bào)道相當(dāng)，說(shuō)明透析、超濾的純化方法可行。

3.2 金錢(qián)菇降血壓活性組分的分離

很多文獻(xiàn)報(bào)道了從食用菌中分離、純化降血壓肽的方法，最常用的包括超濾法、排阻色譜法、離子交換色譜法和一維或二維反相高效液相色譜法[25]。Kaprasob等[26]采用多個(gè)步驟從一種牛肝菌中分離降血壓肽，首先用不同規(guī)格的超濾膜對(duì)牛肝菌蛋白水解物進(jìn)行超濾，篩選出ACE抑制活性最高的餾分，對(duì)其進(jìn)行離子交換色譜分離，其中蛋白含量最高、活性最好的組分再用反相高效液相色譜法進(jìn)行分離，最后獲得純度較高的組分，用于氨基酸序列分析。類似地，Zhang等[27]利用超濾、醇沉、離子交換和凝膠過(guò)濾等多步方法，從5種食用菌中分別純化得到降血壓活性組分，進(jìn)行氨基酸序列鑒定。超濾法利用蛋白分子量的差異進(jìn)行分離，但能否有效分離還取決于蛋白和超濾膜的相互作用。排阻色譜法（或稱為凝膠色譜法）和離子交換色譜法對(duì)混合物的分離能力較差，反相高效液相色譜法對(duì)低豐度蛋白的檢測(cè)能力有限。因此這些方法常常聯(lián)合使用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜蛋白體系的有效分離。但這些方法聯(lián)用的最大缺點(diǎn)是，每一步都需對(duì)各個(gè)組分逐一進(jìn)行活性驗(yàn)證，樣品或材料預(yù)處理的步驟較多，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，分離過(guò)程繁雜。

本實(shí)驗(yàn)利用磁性親和吸附介質(zhì)，可以直接對(duì)超濾過(guò)的金錢(qián)菇提取液中的多肽進(jìn)行吸附分離并得到了單一組分，省去了復(fù)雜的前處理操作，還可以利用外部磁場(chǎng)迅速進(jìn)行分離，磁性粒子可以回收循環(huán)再利用，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所采用的磁性脂質(zhì)體吸附分離方法，其效果與文獻(xiàn)報(bào)道相當(dāng)。

3.3 金錢(qián)菇降血壓肽的活性與結(jié)合機(jī)制

本研究分離鑒定出的金錢(qián)菇降血壓肽FAWAY鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。最近的一篇綜述[28]總結(jié)了從多種食用菌中分離鑒定得到的降血壓肽，其IC50值范圍為3.2 ～ 1 079.0 μmol/L，平均值為240.0 μmol/L。本研究發(fā)現(xiàn)的金錢(qián)菇降血壓肽FAWAY活性與其他食用菌中的降血壓肽活性相近。此外，本研究的分子對(duì)接模擬與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[25-26]相似，食用菌降血壓肽與ACE結(jié)合的作用力中以氫鍵為主，其他分子間作用力對(duì)二者的穩(wěn)定結(jié)合也起到了不可忽視的作用。

4 結(jié)論

MA-IML作為一種新型吸附介質(zhì)，分離出了金錢(qián)菇中的一種活性較好的降血壓肽FAWAY，證明MA-IML可作為從金錢(qián)菇中分離ACE抑制肽的有效工具。但作為一次以食用菌為研究對(duì)象的新嘗試，本研究尚存在一些值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題。首先，金錢(qián)菇蛋白的提取方法需要進(jìn)行優(yōu)化，例如，以蛋白含量、ACE抑制率等為指標(biāo)，通過(guò)單因素或正交試驗(yàn)研究pH值、溫度、超聲功率、超聲時(shí)間等因素對(duì)提取的影響；其次，在利用MA-IML吸附金錢(qián)菇活性組分時(shí)，還可以對(duì)粒子與吸附溶液的固液比、吸附溶液pH值、吸附溫度、吸附時(shí)間、洗脫液濃度等因素進(jìn)行優(yōu)化，從而提高吸附分離降血壓肽的效率；此外，在分子對(duì)接預(yù)測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，可以通過(guò)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析金錢(qián)菇降血壓肽對(duì)ACE的抑制作用機(jī)制，明確其抑制類型。天然產(chǎn)物提取物仍是一個(gè)復(fù)雜的體系，開(kāi)發(fā)一種快速篩選天然產(chǎn)物中降血壓肽的新方法將為食品科學(xué)、保健品開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域的研究提供高效的途徑。本研究利用磁性脂質(zhì)體分離金錢(qián)菇中的降血壓肽，可作為從食用菌中分離活性肽的參考依據(jù)。

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Purification of anti-hypertensive peptide and separation identification of magnetic liposome from Lentinus edodes

LU Yuan， LU Yuting， YANG Simin， FENG Xuezhen， WU Shanguang*

（Medical School， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545005， China）

Abstract：To separate anti-hypertensive peptide from Lentinus edodes， the Lentinus edodes proteins were extracted by using an ultrasonic cell disrupter and purified by dialysis and ultra-filtration. The metal affinity-immobilized magnetic liposome（MA-IML）particles were prepared and used as absorption medium to separate anti-hypertensive peptide from Lentinus edodes. The amino acid