蔣葉靈 侯緒和 呂保櫻
摘 要:應用超高效液相色譜-串聯質譜法(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)實現發(fā)酵面制品的7種甜味劑(糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、三氯蔗糖)同時檢測。樣品經機械震蕩、超聲萃取,亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅沉淀蛋白,經0.22 μm濾膜過濾預處理,以Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50.0 mm,1.8 μm)和乙腈-水為流動相梯度洗脫;電噴霧負離子模式(ESI-)下采用多重反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式進行分段采集。實驗結果:7種甜味劑在0.01~0.50 μg/mL濃度范圍內線性關系較好,相關系數r2均大于0.999 1,檢出限為3.0×10-6~3.0×10-4 g/kg,定量限為1.0×10-5~1.0×10-3 g/kg,樣品平均加標回收率為84.5%~96.5%,相對標準偏差為1.3%~8.1%(n = 6)。實驗結果表明:該方法快速、準確、重現性好,在各種發(fā)酵面制品檢測中有廣泛的應用前景。
關鍵詞:甜味劑;發(fā)酵面制品;超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)
中圖分類號:TS213.2 DOI:10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2023.03.018
0 引言
發(fā)酵面制品是指以面粉為主要成分,經由和面-發(fā)酵-熟制而成的一類食品,包括饅頭、包子、花卷、蒸糕等,是我國北方居民的主要糧食,占其主食的70%以上[1],其中饅頭是60%以上消費者的主食[2]。可見發(fā)酵面制品在人們的生活中占據著重要的地位。甜味劑能夠增加食品的甜度,增強食品的口感[3]。目前,我國使用的甜味劑主要有安賽蜜、三氯蔗糖、甜蜜素、糖精鈉、紐甜等化學合成甜味劑?;瘜W合成甜味劑的長期大量攝入可能會引起腸道菌群結構和組成改變,使用量過大可導致血糖高、葡萄糖不耐受等代謝系統疾病,甚至會導致脾氣暴躁、性格壓抑、記憶力衰退、阿爾茲海默癥等神經系統異常及致癌[4-7]。在《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》(GB 2760—2014)[8]中規(guī)定發(fā)酵面制品中均不得使用上述化學合成甜味劑,然而部分商家為了追求經濟效益,存在濫用、違規(guī)使用等不規(guī)范行為。
常用的化學合成甜味劑檢測方法主要有氣相色譜法[9-10]、離子色譜法[11]、高效液相色譜法[12-14]、高效液相色譜-串聯質譜法(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)[15-16]等。使用氣相色譜法進行檢測需要進行衍生化處理后方能使用,操作繁瑣,在食品檢驗中適用度不高[17-18]。離子色譜法檢測合成甜味劑時對樣品基質要求純凈,而食品基質復雜性高,離子色譜法適用度較差。高效液相色譜法是合成甜味劑檢測中最為常用的檢測方法[19],同時高效液相色譜法也是《食品安全國家標準 食品中阿斯巴甜和阿力甜的測定》(GB 5009.263—2016)[20]和《食品中糖精鈉的測定》(GB/T 5009.28—2003)[21]規(guī)定使用的測定方法。但由于發(fā)酵面制品中存在泡打粉等影響因素,存在基質干擾引起的假陽性現象[22],并且在現行標準中也未有將7種合成甜味劑在高效液相色譜法中同時檢測的方法。因此,開發(fā)發(fā)酵面制品中合成甜味劑同時檢測的新方法是目前亟待解決的問題。本研究基于超高效液相色譜-串聯質譜法,建立了同時檢測發(fā)酵面制品的7種甜味劑(糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、三氯蔗糖)的方法。該方法利用了超高效液相色譜柱效高的特點,分離度高,分析速度快,色譜峰更尖銳使得信噪比增大,從而提高分析靈敏度,解決了復雜基質的多組分同時測定的問題。由于UPLC-MS/MS選擇性高、靈敏度好,因此在食品監(jiān)督檢測中有廣泛的應用前景,并可提高監(jiān)管效率,為市場上此類食品的安全檢測提供參考,具有一定的社會效益。
1 材料與方法
1.1 材料、儀器與試劑
樣品:馬拉糕、饅頭、花卷、包子共50批,均購于本地超市和商店。
儀器:超高壓三重四極桿液質聯用儀(型號:Agilent 1290-646,安捷倫科技有限公司);電子天平(型號:XS205DU,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);Multi Reax渦旋振蕩器(德國海道夫集團);超聲波清洗器(型號:DTA-42,鼎泰(湖北)生化科技設備制造有限公司);冷凍離心機(型號:ROTANTA 460R,德國Hettich有限公司);SYNS00000密理博超純水機(美國Millipore公司)。
試劑:甲醇、乙腈(色譜純),均為默克股份有限公司;甲酸(色譜純)、乙酸銨(色譜純),均為Fisher Scientific;亞鐵氰化鉀(分析純)、乙酸鋅(分析純),均為西隴科學股份有限公司;微孔濾膜,0.22 μm,天津市科億隆實驗設備有限公司。
對照品:糖精鈉(1 mg/mL,中國計量科學研究院,批號:GBW(E)100008-19001);安賽蜜(質量分數:100%,Stanford Chemicals,批號:ASF-785053-AP171106-18);甜蜜素(質量分數:99.12%,Dr.Ehrenstorfer GmbH,批號:G140210);阿斯巴甜(質量分數:99.50%,Stanford Chemicals,批號:ASP-841481-AL171106-06);阿力甜(1 000 μg/mL,TMstandard,批號:3452006);紐甜(質量分數:99.14%,Stanford Chemicals,批號:NT-230025);三氯蔗糖(質量分數:98.41%,Stanford Chemicals,批號:24714XA-14658-036)。
1.2 實驗方法
1.2.1 質譜條件
離子源:電噴霧離子源,負離子模式(ESI-);離子源溫度:350 ℃;霧化氣流速:5 L/min;鞘氣溫度:350 ℃;鞘氣流速:11 L/min;霧化器電壓:45 psi;毛細管電壓:-3 000 V;掃描模式:多重反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式。
1.2.2 色譜條件
液相色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50.0 mm,1.8 μm);進樣體積:5 μL;流速:0.3 mL/min;柱溫:35 ℃;流動相:A-乙腈、B-純水,流動相梯度洗脫條件見表1。
1.2.3 對照品儲備液的制備
精密稱取阿斯巴甜、紐甜、安賽蜜、三氯蔗糖、甜蜜素適量,分別用純水(紐甜用0.1%甲酸水)配制成1.078 6、1.037 0、1.228 0、1.089 4、0.893 1 mg/mL的單標儲備液;精密移取糖精鈉標準溶液2 mL,配制成0.760 mg/mL的儲備液;阿力甜儲備液(質量濃度1 000 μg/mL);于4 ℃冰箱中保存。
1.2.4 混合標準中間液的配制
精密吸取1.2.3對照品儲備液中安賽蜜0.4 mL、糖精鈉2 mL、甜蜜素0.2 mL、阿斯巴甜4 mL、三氯蔗糖4 mL、紐甜0.2 mL,阿力甜對照品原液0.04 mL定容至20 mL容量瓶中備用。
1.2.5 混合標準使用液的配制
精密移取上述1.2.4混合標準中間液適量,加入空白基質定容至刻度,搖勻。制得混合標準使用液,含阿斯巴甜:10.786 0 mg/L,紐甜:0.518 5 mg/L,安賽蜜:1.228 0 mg/L,三氯蔗糖:10.894 0 mg/L,甜蜜素:0.446 6 mg/L,糖精鈉:3.800 0 mg/L,阿力甜:0.100 0 mg/L。
1.2.6 樣品處理
發(fā)酵面制品實際樣品處理測試:分別稱取4份陰性樣品各5 g,各精密加入1.2.4中混合標準中間液0.25 mL,分別加入純水、20%甲醇-水、50%甲醇-水、70%甲醇-水25 mL,分別加入106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和220 g/L乙酸鋅溶液2.5 mL,渦旋10 min后定容至50 mL,超聲15 min,經7 000 r/min 離心10 min,過0.22 μm微孔濾膜后,待測。陰性樣品處理:取2份陰性樣品同法處理,得空白基質。
1.2.7 加標回收檢測
稱取5 g不同種類發(fā)酵面制品陰性樣品(代表不同基質基底),分別精密加入混合標準儲備液(阿斯巴甜:10.786 0 mg/L,紐甜:0.518 5 mg/L,安賽蜜:1.228 0 mg/L,三氯蔗糖:10.894 0 mg/L,甜蜜素:0.446 6 mg/L,糖精鈉:3.800 0 mg/L,阿力甜:0.100 0 mg/L)0.125 mL(低濃度水平)、0.250 mL(中濃度水平)、1.000 mL(高濃度水平),按1.2.6方法進行前處理,按上述優(yōu)化好的色譜條件操作,對低、中、高3個濃度梯度水平的樣品進行6次平行測定。
2 結果與討論
2.1 質譜條件的優(yōu)化
分別使用5 mg/L各組分標準溶液依次采用直接進樣的方式逐一進行測試,在ESI正離子和ESI負離子模式下分別進行MS2掃描,選擇了響應力較強的激基締合體的母離子,而糖精鈉和安賽蜜在ESI正離子狀態(tài)下無法尋找適當的母離子,所以首先使用ESI負離子方法進行測量。Product Ion 模式中選擇各組分的最佳子離子和碎裂電壓,在MRM模式中選定各組分子離子的碰撞能量。7種甜味劑的質譜MRM參數見表2。
2.2 色譜條件的優(yōu)化
2.2.1 色譜柱的選擇
本研究分別考察了Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×50.0 mm,1.8 μm)、Agilent Poroshell 120 SB-C8(2.1 mm×100.0 mm,2.7 μm)、Agilent SB-C18(2.1 mm×50.0 mm,1.8 μm)3種色譜柱,其高效液相色譜圖見圖1。通過圖1可知,3種色譜柱中,Agilent Poroshell 120 SB-C8峰形有拖尾現象,保留時間為4.6 min,紐甜的峰不尖銳;Agilent SB-C18保留時間為3.4 min,峰有重疊,分離效果差;Agilent Eclipse Plus C18(簡稱C18)柱峰寬較窄,峰形尖銳,柱效高,分離效果最好。因為C18為全硅膠基鍵合18個碳的烷烴色譜柱,Agilent Poroshell 120 SB-C8為全硅膠基鍵合8個碳的烷烴色譜柱,而Agilent SB-C18具有較大的二異丁基(SB-C18) 側鏈基團,更適用于低pH值的體系。C18柱適合分離弱極性、中極性相對較弱的化合物,7種合成甜味劑均為極性相對偏弱的化合物,而發(fā)酵面制品基本上為弱堿性體系,因此,C18更為適用,本研究選擇其作為本體系用色譜柱。
2.2.2 流動相的選擇
本研究分別對有機相和水相的選擇進行優(yōu)化。實驗選取甲醇和乙腈作為有機相,對兩者作為有機相的分離效果進行比較。結果表明,乙腈作為有機相進行檢測時,其基線更低,峰形狹窄而尖銳,出峰時間較早,可以得到一個較好的分離效果。主要原因是乙腈在高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)上的吸收小,因此基線較平穩(wěn)。并且乙腈與水相混合壓力較甲醇與水相混合壓力更低,同樣流速下柱壓較低,出峰時間可以更早。對于甜味劑的合成,乙腈的洗脫能力較甲醇更強,可以有更好的分離效果。因此,在該體系中選擇乙腈作為有機相流動相較好。以超純水、摩爾濃度分別為10、30、50 mmol/L乙酸銨的4種水溶液作為水相,乙腈為有機相時,實驗比較了7種甜味劑標樣的定量離子對響應信號的強弱狀況。實驗結果表明:水相中乙酸銨濃度越高,化合物的響應就越低,以純水為水相時響應最高。乙酸銨加入流動相主要是起到調節(jié)流動相pH值的作用,本體系測試中對pH值影響不大,乙酸銨的加入反而降低了化合物的響應,因此,本體系選擇純水作為水相流動。綜上所述,本研究采用乙腈-純水作為流動相。7種甜味劑混合標準溶液的定量離子對色譜圖見圖2。由圖2可見,三氯蔗糖和阿斯巴甜的出峰時間有重疊,但可以通過選擇不同的子離子來進行定性和定量分析,互不干擾。
2.3 樣品前處理的選擇
由分析各處理液所得數據可知:當用甲醇濃度過高的甲醇-水溶液處理甜蜜素和安賽蜜時,未檢測到相應物質。甲醇濃度過高時,會造成甜蜜素和安賽蜜溶解度降低導致目標檢測物的損失,降低體系檢測靈敏度。純水和20%甲醇-水溶液的各組分均能檢出,其中純水的各組分響應值大于20%甲醇-水的響應值。因此,本研究體系采用純水作為前處理溶液。
2.4 方法學評價
2.4.1 線性關系、檢出限和定量限
將1.2.5的標準使用液用空白基質處理的稀釋液稀釋成標準系列,再按上述條件進行測試。以峰面積為縱坐標,質量濃度為橫坐標繪制標準曲線,得到各組分線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限見表3。結果表明,7種甜味劑在其對應的線性范圍內具有良好的線性關系,相關系數r2值均在0.999 0以上,檢出限以S/N=3、定量限S/N=10進行計算,結果滿足要求。
2.4.2 回收率和精密度
表4為不同面制品中7種甜味劑的加標回收率和精密度計算結果。表4中,添加量為標樣計算數值,測得量為根據本體系優(yōu)化后檢測方法的測試結果,回收率=(測得量/添加量)×100%。由表4可知,各目標化合物標準樣品的平均加標回收率為84.5%~96.5%,相對標準偏差(RSD)為1.3%~8.1%。由此可見,本研究方法加標回收測試有良好的加標回收率,具有良好的準確度和精密度。
2.5 實際樣品的測定
按照本研究所建立的方法對采購的50批樣品(馬拉糕5批、花卷10批、饅頭20批、包子15批)依次進行檢測。其中糖精鈉檢出6批次,質量分數為1.218~180.015 mg/kg;安賽蜜檢出3批次,質量分數為2.749~8.439 mg/kg;阿斯巴甜檢出3批次,質量分數為0.734~1.044 mg/kg;其余組分均未檢出。根據《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》(GB 2760—2014)[8]規(guī)定,本研究中檢測的7種甜味劑均不得檢出,表明在市場中流通的發(fā)酵面制品存在非法添加甜味劑的現象,需要加大對此類產品的監(jiān)管力度。
3 結論
本研究建立了一種利用UPLC-MS/MS同時檢測發(fā)酵面制品中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜的方法,并對儀器條件和前處理方法進行了優(yōu)化,前處理方法簡便,分析體系測試分析時間在6 min以內,體現該方法的快捷高效。研究結果顯示:該方法的線性關系良好,所有相關系數r2值均大于0.999 0,檢出限為3.0×10-6~3.0×10-4 g/kg,定量限為1.0×10-5~1.0×10-3 g/kg。本研究針對發(fā)酵面制品體系不同基質進行加標回收檢測,平均回收率為84.5%~96.5%,相對標準偏差為1.3%~8.1%。該方法在復雜基質基底中有著良好的加標回收率,未出現明顯干擾,將其用于快速檢測發(fā)酵面制品中的7種甜味劑,可大大提高檢測的準確性,為安全監(jiān)管發(fā)酵面制品中的甜味劑的檢測提供了技術支持,具有很好的社會效益。
參考文獻
[1] 田莉,李靜峰,張仁正,等. HPLC法測定發(fā)酵面制品中苯甲酸和山梨酸的含量[J]. 安徽農業(yè)科學,2018,46(22):157-158,178.
[2] 李里特. 中國傳統發(fā)酵面制品創(chuàng)新與面食現代化[J]. 糧食與食品工業(yè), 2009,16(5):1-3.
[3] 吳昌林. 高效液相色譜法檢測含乳飲料中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉3種添加劑含量[J]. 分析儀器,2020(3):38-41.
[4] 趙輝,王鑫璇. 人造甜味劑與人體健康風險[J]. 食品科學技術學報,2018,36(6):15-20.
[5] 高玉婷,張鵬,杜剛,等. 人造甜味劑對人體健康的影響[J]. 食品科學,2018,39(7):285-290.
[6] 食品伙伴網. 美國研究:人工甜味劑飲料增加中風和癡呆風險[J]. 中國食品報,2017,17(4):208.
[7] 童蘭艷,代政華,肖昭競,等. 液相色譜-串聯質譜法同時測定食品中9種甜味劑[J]. 食品科學技術學報,2020,38(2):121-126.
[8] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 食品安全國家標準 食品添加劑使用標準:GB 2760—2014[S]北京:中國標準出版社,2014.
[9] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 食品安全國家標準 食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定:GB 5009. 97—2016[S]. 北京:中國標準出版社,2016.
[10] 黎良菊,李其美,朱敏. 氣相色譜法測定饅頭中甜蜜素[J]. 現代食品,2020(11):185-186.
[11] 楊仁君,孫潔,李好轉,等. 離子色譜法同時測定白酒中3種甜味劑方法探討[J]. 釀酒科技,2016(9):122-124.
[12] 孫立臻,周禹君,尹麗麗,等. 高效液相色譜法同時測定飲料中10種天然甜味劑[J]. 食品工業(yè),2019,40(10):344-348.
[13] 吳毅,何林飛,劉常凱,等. 固相萃取-高效液相色譜法同時測定糕點中13種添加劑的研究[J]. 中國食品添加劑,2019,30(11):166-172.
[14] 佟芳荻,公緒芳,伍金華,等. 超高效液相色譜法同時測定食品中4種防腐劑和5種甜味劑[J]. 食品安全質量檢測學報,2020,11(7):2273-2280.
[15] 劉麗麗,任璐,羅冠龍,等. 一種高效液相色譜-質譜聯用法同時檢測鳳香型白酒中六種甜味劑的方法[J]. 釀酒,2020,47(3):101-104.
[16] 李延山. 超高效液相色譜串聯質譜法測定飼料中紐甜、阿力甜、阿斯巴甜、環(huán)天冬氨酰苯丙氨酸、甜蜜素、安塞蜜、糖精鈉[J]. 飼料工業(yè),2018,39(4):53-55.
[17] 孟慶順. 氣相色譜法快速測量調味面制品中甜蜜素含量[J]. 中國食品添加劑,2020,31(11):126-129.
[18] 蘇建國,陳枚,李歆,等. 氣相色譜內標法測定食品中甜蜜素含量[J]. 監(jiān)督與選擇,2006(8):58-59.
[19] 曹瑛瑛,文開勇,孫國政,等. HPLC法檢測饅頭中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉及安賽蜜[J]. 食品與發(fā)酵科技,2019,55(5):97-101.
[20] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 食品安全國家標準 食品中阿斯巴甜和阿力甜的測定:GB 5009. 263—2016[S]. 北京:中國標準出版社,2016.
[21] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 食品中糖精鈉的測定:GB/T 5009. 28—2003[S]. 北京:中國標準出版社,2003.
[22] 丘福保,盧麗明,薛榮旋,等. 液質聯用法同時測定植物飲料中的3種防腐劑和4種甜味劑[J]. 中國食品添加劑,2020,31(9):79-84.
Simultaneous determination of 7 sweeteners in fermented flour
product by UPLC-MS/MS
JIANG Yeling1, HOU Xuhe*2, LYU Baoying2
(1.Guilin Food and Drug Quality Inspection Institute, Guilin 541200, China; 2. Medical School,Guangxi
University of Science and Technology, Liuzhou 545005, China)
Abstract:This study adopted ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)to detect 7 sweeteners(sodium saccharin, aspartame, acesulfame-K, neotame, alitame, saccharin sodium and chlorinated sucrose)in fermented dough products simultaneously. The samples were pre-treated by mechanical shaking, ultrasonic extraction, precipitation of proteins with ferricyanide potassium and zinc acetate, and filtration through a 0.22 μm membrane. The Agilent Eclipse Plus C18 column(2.1 mm ×50.0 mm, 1.8 μm)was washed with a gradient of acetonitrile-water. Multiple reaction monitoring(MRM)mode was used for segmented collection under negative electrospray ionization(ESI-). The results showed that the seven sweeteners had good linear relationships within the concentration range of 0.01 to 0.50 μg/mL, with correlation coefficients r2 greater than 0.999 1. The detection limit was 3.0 × 10-6 to 3.0 × 10-4 g/kg and the quantitation limit was 1.0 × 10-5 to 1.0 × 10-3 g/kg. The average recoveries of the samples were 84.5% to 96.5% with relative standard deviations of 1.3% to 8.1%(n=6). The experiment results show that this method is fast, accurate, reproducible, and can be widely applied to the detection of various fermented flour products.
Key words: sweeteners; fermented flour products; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)
(責任編輯:于艷霞 羅小芬)