農(nóng)瑩丹，范氏泰和，韓 簫，何勇飛，梁天儀，盧春苗，唐立博，楊子葉，韓創(chuàng)業(yè)，6，羅小玲，5

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部，廣西 南寧 530021；2.廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021；3.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院壯瑤藥研發(fā)中心，廣西 南寧市 530201；4.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣西 南寧 530021；5.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021；6.廣西消化道腫瘤加速康復(fù)外科（ERAS）基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

原發(fā)性肝癌是我國第四大常見腫瘤，其死亡率高居所有惡性腫瘤中的第二位，75%～85%以上的原發(fā)性肝癌病理類型為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）（以下簡(jiǎn)稱肝癌）［1］。根治性切除術(shù)是肝癌患者獲得長期生存的首選治療方法，但由于肝癌早期缺乏明顯癥狀，70%的患者在就診時(shí)已為中晚期，無法獲得根治性切除［2，3］。對(duì)于多發(fā)腫瘤、已經(jīng)發(fā)生血管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或腫瘤體積過大而殘肝體積不足的中晚期肝癌患者，分子靶向藥物治療是主要的治療方式［4］。索拉非尼是美國FDA批準(zhǔn)作為肝癌系統(tǒng)性治療的一線用藥，是最早用于肝癌系統(tǒng)抗腫瘤治療的小分子多靶點(diǎn)藥物，至今仍然是肝癌診療指南推薦的一線藥物［1］。臨床研究表明，索拉非尼能有效延長晚期肝癌患者的總體生存時(shí)間，改善患者的生存質(zhì)量［5］。然而，臨床發(fā)現(xiàn)部分患者一開始即對(duì)索拉非尼不敏感，稱為原發(fā)性耐藥；部分患者在使用過程中逐漸對(duì)索拉非尼降低敏感性，稱為繼發(fā)性耐藥［6］，耐藥性限制了索拉非尼的治療效果。因此，肝癌治療過程中增強(qiáng)索拉非尼敏感性和逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥的研究一直是肝癌治療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

中西醫(yī)結(jié)合治療已成為我國肝癌治療的模式之一，大量研究表明中藥可經(jīng)多途徑控制腫瘤進(jìn)展，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、抗腫瘤血管生成，在提高機(jī)體免疫力方面也有較好作用［7-9］；中藥與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌治療有協(xié)同增效作用［10，11］。近年來，本課題組開展了中藥活性成分治療肝癌及增強(qiáng)索拉非尼治療敏感性及逆轉(zhuǎn)耐藥方面的研究，我們從中藥材楊桃根中分離得到中藥單體——DMDD（2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-環(huán)己二酮），初步實(shí)驗(yàn)證明DMDD 為有效的抗肝細(xì)胞癌藥物［12］。因此，本研究旨在進(jìn)一步探討DMDD與索拉尼聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，二者是否具有協(xié)同增效作用，為提高索拉非尼治療肝癌的療效提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株Huh7 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；索拉非尼購自美國MCE 公司；中藥單體DMDD由課題組成員廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院壯瑤藥研發(fā)中心范氏泰和博士提取，DMDD 已于2021 年申請(qǐng)發(fā)明專利，發(fā)明專利名稱：楊桃根及其提取物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物中的應(yīng)用；申請(qǐng)?zhí)枺?02011305629.9［12］；DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Gibco 公司；CCK-8 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒購于中國白鯊公司；Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)板、基質(zhì)膠購于美國Corning 公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購于中國碧云天生物技術(shù)公司；兔源 PHGDH 抗體、抗兔IgG 二抗和鼠源微管蛋白tubulin、抗鼠IgG 二抗購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；PHGDH 基因引物、tubulin 基因引物購于擎科生物公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國Thermo Scientific Varioskan 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 法檢測(cè)Huh7 細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長期Huh7 細(xì)胞接種于96 孔板中，密度為5×103個(gè)，待細(xì)胞貼壁后更換100 μL 含有不同藥物的培養(yǎng)基。DMDD 組以0、2、4、6、8、10 μmol/L 的濃度梯度干預(yù)，索拉非尼組以0、1、2、3、4、5 μmol/L 的濃度梯度干預(yù)，聯(lián)合應(yīng)用組以上述相應(yīng)濃度的DMDD 和索拉非尼兩兩配伍，以等量不含藥物和細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，干預(yù)48 h 后檢測(cè)450 nm 處吸光度值（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率和細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞存活率=［（實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白組OD 值）/（對(duì)照組OD 值-空白組OD 值）］×100%。細(xì)胞增殖抑制率=［（對(duì)照組OD 值-實(shí)驗(yàn)組OD 值）/（對(duì)照組OD 值-空白組OD 值）］。采用金氏公式［13］Q=Ea+b/（Ea+Eb-EaEb）評(píng)價(jià)藥物聯(lián)合應(yīng)用效果，公式中的Ea和Eb為單藥的抑制率，Ea+b為兩藥聯(lián)合的抑制率，Q＜0.85 提示兩藥聯(lián)合效果為拮抗，Q 值為0.85～1.15 提示兩藥聯(lián)合效果為相加，Q 值＞1.15 表示兩藥聯(lián)合效果為增效。

1.2.2 平板克隆檢測(cè)Huh7 細(xì)胞集落形成能力 根據(jù)CCK-8 結(jié)果確定藥物濃度，設(shè)Huh7 細(xì)胞空白對(duì)照組、DMDD 5 μmol/L 組、索拉非尼2 μmol/L 組、聯(lián)合應(yīng)用組（DMDD 5 μmol/L+索拉非尼2 μmol/L）。各組藥物干預(yù)48 h 后，收集細(xì)胞接種于6 孔板中，接種密度為每孔500 個(gè)細(xì)胞。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d 換液一次，14 d 后取出培養(yǎng)板，移除培養(yǎng)液，多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min。清洗及干燥后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，以≥10 個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)為細(xì)胞集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Huh7 細(xì)胞遷移能力 Huh7 細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞生長密度達(dá)90%～100%，用100 μL 移液槍頭沿?zé)o菌鋼尺邊緣劃直線，PBS 洗2 次。用2%血清培養(yǎng)基配制各組濃度藥物進(jìn)行干預(yù)，各藥物分組及用量與1.2.2 中相同，倒置顯微鏡下取直線附近區(qū)域進(jìn)行拍照并記錄位置。0、24、48、72 h 于倒置顯微鏡下尋找標(biāo)記位置拍照。利用Image J 處理圖片并計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率%=（劃痕面積0 h-劃痕面積72 h）/劃痕面積0 h×100%。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Huh7 細(xì)胞遷移和侵襲能力 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，各藥物分組及用量與1.2.2 中相同。取不同藥物干預(yù)的Huh7 細(xì)胞種植于上室，密度為每孔1×105個(gè)，下室加入完全培養(yǎng)基，24 h 后取出小室，多聚甲醛固定及結(jié)晶紫染色各30 min，清洗結(jié)晶紫并用棉簽小心清除上室細(xì)胞，待小室干燥后在倒置顯微鏡下選擇3 個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，各藥物分組及用量與1.2.2 中相同，上室加入100 μL/孔Matrigel 膠，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h 膠化，取不同藥物干預(yù)的Huh7細(xì)胞種植于上室，密度為每孔1×105個(gè)，下室加入完全培養(yǎng)基，24 h 后取出小室，多聚甲醛固定及結(jié)晶紫染色各30 min，清洗結(jié)晶紫并用棉簽小心清除上室細(xì)胞，待小室干燥后在倒置顯微鏡下選擇3 個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Huh7 細(xì)胞周期分布 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔板，過夜貼壁后加藥，各藥物分組及用量與1.2.2 中相同。孵育48 h 后收集細(xì)胞，PBS 洗2 次，用預(yù)冷的70%乙醇固定過夜。次日離心洗滌后，加入含有RNase A 和PI 的染色液，37 ℃避光染色30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，用FlowJo 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 RT-qPCR 檢測(cè)Huh7 細(xì)胞PHGDH mRNA表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔板，過夜貼壁后加藥，各藥物分組及用量與1.2.2 中相同。孵育48 h 后，收集細(xì)胞，使用Omega RNA 試劑盒提取總RNA，并用TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列如下：PHGDH 上游引物：5'-ATGAACTTCTTCCGCTCCCATTT-3'，下游引物：3'-TCGGTGAAATGCTGTGGTTTAAA-5'。tubulin上游引物：5' - CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC - 3'，下游引物：5'- AAGTTAAAACGTCACAAAGGTGCT - 3'。利用SYBR Green 染料檢測(cè)細(xì)胞目的基因的表達(dá)，以tubulin作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量公式：2-ΔΔCt計(jì)算細(xì)胞目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)Huh7 細(xì)胞PHGDH 蛋白表達(dá)水平 不同藥物干預(yù)的Huh7 細(xì)胞用裂解液冰上裂解30 min，收集裂解后的細(xì)胞懸液，14 000×g離心15 min，收集上清，測(cè)蛋白濃度，將等量總蛋白從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液4 ℃孵育12～16 h，洗膜3 次，二抗室溫孵育2 h，ECL 顯影液充分浸泡20 s 后掃膜，圖片用ImageJ 軟件處理并進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析用于多組比較，并以Tukey's 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Huh7 細(xì)胞存活率隨DMDD、索拉非尼、DMDD 和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用的濃度增加而降低，聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞存活率顯著降低，呈濃度依賴關(guān)系，結(jié)果見圖1。經(jīng)金氏公式計(jì)算，2、4、8 μmol/L DMDD 分別聯(lián)合1、2、4 μmol/L 索拉非尼具有協(xié)同作用（Q＞1.15），6、10 μmol/L DMDD 分別聯(lián)合3、5 μmol/L 索拉非尼具有相加作用（0.85＜Q＜1.15），結(jié)果見表1。

表1 以金氏公式Q 值評(píng)價(jià)不同濃度DMDD 與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用的作用效果Tab 1 Evaluation of the combined effect of different concentrations of DMDD and sorafenib by Q value of Kim's formula

圖1 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞活力的影響Fig 1 Effects of different drugs on the viability of Huh7 cells

2.2 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞集落形成能力的影響

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)48 h 后，對(duì)照組、DMDD 組、索拉非尼組及聯(lián)合應(yīng)用組的細(xì)胞集落個(gè)數(shù)分別為99.00±6.56、47.67±8.02、71.33±5.51、28.33±6.03。與對(duì)照組比較，3 組的Huh7 細(xì)胞集落個(gè)數(shù)均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1，P＜0.01，P＜0.000 1）；與DMDD 組、索拉非尼組比較，聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞集落個(gè)數(shù)顯著下降（P＜0.05，P＜0.001）。結(jié)果見圖2。

圖2 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞集落形成的影響Fig 2 Effects of different drugs on clony formation of Huh7 cells

2.3 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)48 h 后，對(duì)照組、DMDD 組、索拉非尼組及聯(lián)合應(yīng)用組的劃痕愈合率分別為（40.43±5.10）%、（31.38±1.56）%、（22.04±1.51）%、（15.02±2.76）%。與對(duì)照組比較，3 組的Huh7 細(xì)胞劃痕愈合率均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.000 1）；與DMDD組比較，聯(lián)合應(yīng)用組劃痕愈合率顯著下降（P＜0.001）；聯(lián)合應(yīng)用組與索拉非尼組的劃痕愈合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞遷移能力的影響（×100）Fig 3 Effects of different drugs on the migration ability of Huh7 cells（×100）

2.4 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)48 h 后，對(duì)照組、DMDD 組、索拉非尼組及聯(lián)合應(yīng)用組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為 346.70±17.50、247.70±14.57、233.30±10.50、97.00±13.75。與對(duì)照組比較，3 組的遷移細(xì)胞數(shù)均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.0001，P＜0.000 1）。與DMDD 組、索拉非尼組比較，聯(lián)合應(yīng)用組遷移細(xì)胞數(shù)顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.000 1）。結(jié)果見圖4。

圖4 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞遷移能力的影響（×100）Fig 4 Effects of different drugs on the migration ability of Huh7 cells（×100）

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)48 h 后，Huh7 細(xì)胞對(duì)照組、DMDD 組、索拉非尼組及聯(lián)合應(yīng)用組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為443.00±17.06、177.00±19.67、186.00±16.70、54.67±7.371。與對(duì)照組比較，3 組的侵襲細(xì)胞數(shù)均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.000 1）。與DMDD 組、索拉非尼組比較，聯(lián)合應(yīng)用組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.000 1）。見圖5。

圖5 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞侵襲能力的影響（×100）Fig 5 Effects of different drugs on the invasive ability of Huh7 cells（×100）

2.5 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組藥物干預(yù)48 h 后，對(duì)照組、DMDD 組、索拉非尼組及聯(lián)合應(yīng)用組G2/M 期細(xì)胞比例分別為（10.63±0.32）% 、（35.77±1.22）% 、（30.03±2.22）% 、（38.97±0.60）%。與對(duì)照組比較，3 組G2/M 期細(xì)胞比例均顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.000 1）。與索拉非尼組比較，聯(lián)合應(yīng)用組G2/M 期細(xì)胞比例上升（P＜0.001），聯(lián)合應(yīng)用組與DMDD 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞周期的影響Fig 6 Effects of different drugs on Huh7 cell cycle

2.6 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞PHGDH mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的影響

RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)48 h 后，與對(duì)照組比較，DMDD 組、索拉非尼組、聯(lián)合應(yīng)用組PHGDH mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.000 1）；與DMDD 組、索拉非尼組比較，聯(lián)合應(yīng)用組Huh7 細(xì)胞PHGDH mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，3 組Huh7 細(xì)胞PHGDH 蛋白表達(dá)水平均下降，差異有均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.000 1，P＜0.000 1），與DMDD組、索拉非尼組比較，聯(lián)合應(yīng)用組PHGDH 蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.000 1，P＜0.001）。結(jié)果見圖7。

圖7 不同藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞PHGDH mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的影響Fig 7 Effects of different drugs on PHGDHmRNA transcription and protein expression in Huh7 cells

3 討論

索拉非尼作為晚期肝癌治療的一線靶向藥物，可有效延長患者生存期、提高生存質(zhì)量，但耐藥和毒副作用限制了索拉非尼的治療效果［14］。因此，目前有較多增強(qiáng)索拉非尼敏感性或逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥方面的研究［15，16］，其中有研究顯示中藥與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用可提高索拉非尼的敏感性，在肝癌治療中具有良好的應(yīng)用前景［17］。本課題組也開展了中藥活性成分治療肝癌及增強(qiáng)索拉非尼治療肝癌敏感性及逆轉(zhuǎn)耐藥方面的研究，從中藥材楊桃根中分離提取活性成分DMDD，研究表明DMDD 為有效的抗肝細(xì)胞癌藥物并申請(qǐng)了發(fā)明專利［12］。此外，Wang 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，DMDD 可調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程抑制肺癌細(xì)胞生長。Zhou 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，DMDD可通過調(diào)節(jié)MAPK 信號(hào)通路抑制乳腺癌癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究則進(jìn)一步探討DMDD 與索拉尼聯(lián)合應(yīng)用是否具有協(xié)同增效作用及對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，為DMDD 提高索拉非尼肝癌治療效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果表明，DMDD 和索拉非尼單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌Huh7 細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用大于單獨(dú)用藥。經(jīng)金氏公式分析，DMDD 與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)為協(xié)同作用或相加作用，其中，低劑量DMDD 與低劑量索拉非尼聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞的協(xié)同抑制作用更顯著，說明DMDD 可促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DMDD 和索拉非尼單獨(dú)應(yīng)用均可減少肝癌細(xì)胞集落形成個(gè)數(shù)，而聯(lián)合應(yīng)用可顯著降低細(xì)胞集落形成個(gè)數(shù)，對(duì)Huh7 細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)。劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DMDD、索拉非尼單獨(dú)應(yīng)用均可抑制Huh7 細(xì)胞的遷移和侵襲能力，聯(lián)合應(yīng)用抑制作用更顯著。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DMDD、索拉非尼單獨(dú)應(yīng)用和聯(lián)合應(yīng)用均可導(dǎo)致Huh7 細(xì)胞發(fā)生G2/M 期周期阻滯。G2期是細(xì)胞從S 期到M 期之間的時(shí)間段，細(xì)胞在此期間進(jìn)行細(xì)胞器復(fù)制和準(zhǔn)備有絲分裂所必需的物質(zhì)［20］。G2/M 檢查點(diǎn)阻斷是許多細(xì)胞毒藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的一種有效途徑［21］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DMDD 與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用組對(duì)Huh7 細(xì)胞的G2/M 期阻滯作用顯著高于索拉非尼單獨(dú)應(yīng)用組，但與DMDD 單獨(dú)應(yīng)用組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明DMDD 單獨(dú)應(yīng)用即具有較強(qiáng)的G2/M 期細(xì)胞周期阻滯能力，與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同增效作用。

絲氨酸合成途徑將葡萄糖酵解產(chǎn)物3-磷酸甘油酸經(jīng)三步酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為絲氨酸，中間代謝產(chǎn)物參與細(xì)胞內(nèi)一碳代謝、抗氧化能等生物過程，在癌細(xì)胞中，絲氨酸代謝的異?；罨徽J(rèn)為是腫瘤生長和發(fā)展的重要機(jī)制之一［22］。在機(jī)制上探討，我們發(fā)現(xiàn)DMDD、索拉非尼單獨(dú)使用和聯(lián)合應(yīng)用均可下調(diào)Huh7 細(xì)胞PHGDH 表達(dá)水平，聯(lián)合應(yīng)用組PHGDH 表達(dá)下調(diào)更明顯。PHGDH 是絲氨酸合成通路中的第一個(gè)限速酶，在結(jié)腸癌、尤文氏肉瘤和乳腺癌中，均檢測(cè)到PHGDH 表達(dá)水平上調(diào)，且PHGDH表達(dá)水平這些腫瘤的增殖、侵襲和遷移能力呈正相關(guān)［23］。Montrose 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，限制絲氨酸活化可逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌5-氟尿嘧啶耐藥，提高5-氟尿嘧啶的治療效果。這些研究表明，抑制絲氨酸合成途徑的過度活化是抑制癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為、提高藥物治療效果及克服腫瘤細(xì)胞耐藥的有效途徑。

綜上所述，DMDD 與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Huh7 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力的抑制作用均顯著優(yōu)于DMDD 和索拉非尼單獨(dú)應(yīng)用，其機(jī)制可能與DMDD 和索拉非尼協(xié)同下調(diào)絲氨酸合成通路相關(guān)。本研究為提高索拉非尼治療肝癌的療效、降低其使用劑量以減輕毒副作用和延緩耐藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

農(nóng)瑩丹：進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析、撰寫論文；范氏泰和：DMDD 單體提取及其作用功能研究；韓簫、何勇飛、梁天儀：實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)；盧春苗：參與細(xì)胞培養(yǎng)；唐立博：參與Transwell 實(shí)驗(yàn)；楊子葉：參與RT-PCR 實(shí)驗(yàn)；韓創(chuàng)業(yè)：研究方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)技術(shù)和操作指導(dǎo)；羅小玲：項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，課題設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、研究經(jīng)費(fèi)支出、文稿修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。