史國英 曾泉 葉雪蓮 馬明亮 胡春錦

摘要：【目的】篩選對甘蔗葉有降解效果的細菌菌株，為其在蔗葉還田中的應用及甘蔗葉田間高效生物腐解劑和纖維素酶制劑產品的研發(fā)提供參考?！痉椒ā坑靡愿收崛~粉為唯一碳源的培養(yǎng)基對田間腐解甘蔗葉樣品中的降解菌進行富集，通過剛果紅培養(yǎng)基初篩和羧甲基纖維素酶（CMCase）活性測定復篩纖維素降解菌，結合形態(tài)特征和16S rDNA序列分析，明確篩選菌株的系統分類地位；分析經菌株發(fā)酵處理后甘蔗葉的失重率，利用透射電鏡和掃描電鏡觀察甘蔗葉超微組織結構變化，明確菌株對甘蔗葉的降解效果。【結果】經過初篩和復篩，獲得1株高效產CMCase菌株XW005，其纖維素酶活力為80.51 U/mL，經16S rDNA序列及系統發(fā)育分析，將XW005菌株鑒定為Brucella intermedia細菌（NCBI登錄號：MW538324.1）。電鏡觀察甘蔗葉顯微結構，發(fā)現經菌株發(fā)酵處理的甘蔗葉表皮層開裂，維管束和質膜解體，受損的葉片呈疏松狀態(tài)，平坦表面受到破壞，致密結構變得松散。甘蔗葉降解試驗結果表明，發(fā)酵處理20 d后，菌株處理的甘蔗葉失重率達45.09%?！窘Y論】菌株XW005是1株具有降解纖維素能力的細菌，在常溫條件下可對甘蔗葉進行有效降解，具有潛在的開發(fā)價值和良好的應用前景。

關鍵詞：甘蔗葉；纖維素降解菌；Brucella intermedia；組織微結構

中圖分類號：S646.099? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）02-0488-09

Abstract：【Objective】To screen bacteria with degradation effects on sugarcane leaves， and to provide reference for application of bacteria in sugarcane leaf returning and development of efficient biological decomposition agents and cellulase preparation products for sugarcane leaf in field. 【Method】Medium with sugarcane leaf powder as the only carbon source was used to enrich cellulose-degrading bacteria of sugarcane leaf decomposition in field. Cellulose-degrading bacteria were preliminarily screened using Congo red medium and rescreened via determination of carboxymethyl cellulose（CMCase） activity， and according to analysis of morphological characteristics and 16S rDNA sequences， systematic taxonomic classification position of the screened bacteria were made clear. Weight loss rate of sugarcane leaves after fermentation treatment was analyzed and transmission electron microscope and scanning electron microscope were used to observe the change of sugarcane leaf ultrastructure， so as to make clear effects of the strain on sugarcane leaf degradation. 【Result】Through preliminary screening and rescreening， a strain of CMCase-producing strain XW005 with cellulase activity of 80.51 U/mL was obtained. According to analysis of 16S rDNA gene sequence and phylogenetic analysis， XW005 strain was identified as bacterium Brucella intermedia（NCBI accession number： MW538324.1）. Electron microscopic observation of sugarcane leaf microstructure showed that epidermis of sugarcane leaves under fermentation treatment of the strain cracked， while vascular bundles and plasma membrane disintegrated， the damaged leaves were loosened， the flat surface was destroyed， and the dense structure became loose. The results of sugarcane leaf degradation test showed that after 20 d of fermentation treatment， the weight loss rate of sugarcane leaves under the strain treatment reached 45.09%. 【Conclusion】XW005 is a bacterium capable of degrading cellulose and it can effectively degrade sugarcane leaves at room tempera-ture，which has potential of development and prospect for application.

Key words： sugarcane leaf； cellulose-degrading bacterium； Brucella intermedia； tissue microstructure

Foundation items：Guangxi Natural Science Foundation（2020GXNSFAA297096）；Guangxi Science and Technology Plan Project（Guike AB18221048）；Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Science（Guinongke 2021JM89，Guinongke 2021YT098）

0 引言

【研究意義】甘蔗作為制糖業(yè)的主要原料，廣泛種植于我國廣東、廣西、云南、海南等熱帶亞熱帶地區(qū)。甘蔗為宿根多年生作物，生長期長，需肥量大，長期連作會消耗大量土壤養(yǎng)分，對地力的消耗高于其他作物，甚至引起營養(yǎng)元素失調（樊仙等，2014）。單一依賴化肥補償土壤地力難以有效解決問題，還會造成甘蔗種植成本上升、蔗區(qū)土壤質量下降等一系列問題。研究表明，甘蔗葉中含有大量的碳、氮、磷、鉀及微量元素，是一種數量多、可就地利用的優(yōu)質有機肥源，蔗葉還田能改善土壤理化性狀、保持土壤生產力，同時又能提高土壤微生物物種總數和群落多樣性（趙麗萍，2014；張才芳，2019）。蔗葉還田是當前集約化、機械化生產的甘蔗產業(yè)發(fā)展的必然選擇。然而，由于甘蔗葉含有大量的纖維素，在田間自然條件下很難降解。2016年之前，甘蔗葉大多在采收后直接進行焚燒處理。近年來，隨著國家對環(huán)境保護的重視，已嚴禁進行秸稈焚燒。目前，每年有大量甘蔗葉棄于田間地頭，不僅造成資源浪費，而且由于甘蔗葉在田間降解速度緩慢，不及時處理會嚴重影響新植蔗的耕整地、開溝和宿根蔗的破壟松蔸、培土等后續(xù)作業(yè)（樊保寧等，2020；葛暢等，2020）。篩選獲得具有較好環(huán)境適應性的高效秸稈降解菌是利用外源微生物促進秸稈原位腐化的關鍵。從添加外源微生物促進甘蔗葉原位腐解角度篩選適合的甘蔗葉降解菌，開發(fā)新型甘蔗葉降解菌劑，促進甘蔗葉原位腐解，對我國糖料甘蔗葉的有效處理與利用及促進蔗糖產業(yè)持續(xù)發(fā)展均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，研究人員已陸續(xù)分離得到一些對秸稈具有降解能力的微生物，包括細菌、真菌和放線菌。由于細菌繁殖快、發(fā)酵周期短，關于纖維素降解菌的研究已引起較多關注（李冠杰等，2015；賈輝等，2016）。自然界中廣泛存在纖維素降解菌，特別是在一些降解菌較活躍的特定環(huán)境中，可分離獲得能高效降解纖維素的微生物，如從腐爛秸稈、食草動物糞便、蚯蚓腸道及特定作物秸稈（胡海紅等，2016；張?zhí)N琦等，2017；王麗萍等，2018）、特定環(huán)境（王旭輝等，2017）和特定溫度（黃亞麗等，2020；江高飛等，2020）中篩選獲得纖維素降解菌。研究表明，添加外源微生物有利于縮短秸稈發(fā)酵時間。曲繼松等（2019）研究表明，向枸杞枝條粉添加粗纖維降解菌、鋸末專用復合益菌后，枸杞枝條粉堆體整體溫度提升，在發(fā)酵周期內，其堆體內部溫度超過50 ℃的時間達9 d，有助于加快基質化進程、縮短發(fā)酵時間、提高發(fā)酵效率。宋春麗（2019）研究發(fā)現，添加微生物菌劑能顯著提高蔬菜廢棄物堆肥溫度、延長堆肥高溫時間、加快有機物質分解、縮短堆肥發(fā)酵周期，添加微生物菌劑處理比未添加微生物菌劑處理完成發(fā)酵的時間縮短13 d；同時添加微生物菌劑可促進堆肥腐熟，降低堆肥產品對植物發(fā)芽和生長的不良影響。李雯等（2020）研究表明，玉米秸稈中添加纖維素降解菌X11-1（Luteimonas sp.）菌株，堆肥腐熟時間可提前5 d；Wang等（2022）研究發(fā)現，外源纖維素降解菌（ECDB）作為生物活性劑可促進玉米秸稈和牛糞混合堆肥中腐殖質的形成，提高玉米秸稈堆肥的效率和質量?！颈狙芯壳腥朦c】目前已報道具有產纖維素酶活性的細菌種屬較多（臧超群等，2018；Surachaia et al.，2020；Danso et al.，2021；Mohammadipour et al.，2021），但可培養(yǎng)秸稈降解菌種類不多，尤其是適合甘蔗葉腐解的功能菌鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】用以甘蔗葉粉為唯一碳源的培養(yǎng)基對田間腐解甘蔗葉樣品中的降解菌進行富集，通過剛果紅培養(yǎng)基初篩和羧甲基纖維素酶（CMCase）活性測定復篩纖維素降解菌，結合形態(tài)特征和16S rDNA序列分析，明確篩選菌株的系統分類地位；分析經菌株發(fā)酵處理后甘蔗葉的失重率，電鏡觀察甘蔗葉超微組織結構變化，明確菌株對甘蔗葉的降解效果，為其在蔗葉還田中的應用及甘蔗葉田間高效生物腐解劑和纖維素酶制劑產品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

樣品來源：采集田間堆積腐爛的甘蔗葉裝入封口袋中，封口，冷藏備用。

主要培養(yǎng)基：（1）纖維素降解菌富集培養(yǎng)基：K2HPO4 2.0 g，（NH4）2SO4 1.4 g，MgSO2·7H2O 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 5.0 mg，MnSO4·H2O 1.6 mg，ZnSO4 1.7 mg，甘蔗葉粉（過40目篩）2%，蒸餾水1000 mL；（2）甘蔗葉發(fā)酵培養(yǎng)基：去掉上述富集培養(yǎng)基中的蔗葉粉，加入尿素0.3 g/L，分裝成150 mL/瓶，每瓶加入于80 ℃烘干至恒重的2～3 cm長蔗葉段5 g；（3）剛果紅培養(yǎng)基、細菌純化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵產酶培養(yǎng)基參考馬欣雨等（2020）的方法配制。

主要試劑：（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4、NaCl、CMC-Na、剛果紅、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、ZnSO4和Tween-80（v/v）購自天津市大茂化學試劑廠；DNS試劑、瓊脂、蛋白胨和酵母提取物購自北京索萊寶科技有限公司；DNA提取試劑盒及PCR反應試劑購自北京全式金生物技術有限公司。

主要儀器設備：PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）、全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）、紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）、數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）、H1850R 臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 纖維素降解菌的富集培養(yǎng) 稱取10 g樣品，加入到裝有100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，于28 ℃、180 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)5 d。吸取10 mL培養(yǎng)液轉接至新的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)，重復以上操作，富集培養(yǎng)3代，進行下一步試驗。

1. 2. 2 纖維素降解菌的初步篩選 量取1 mL第3代富集液加入9 mL滅菌水，連續(xù)稀釋3次，取第3次的稀釋液100 μL在剛果紅纖維素培養(yǎng)基中涂布，于28 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察透明圈的有無及大小，將有明顯透明圈的菌株接種到新的剛果紅纖維素培養(yǎng)基上，連續(xù)點接純化獲得純培養(yǎng)。用游標卡尺準確測定菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），同時計算透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）。選取D/d較大的菌株劃線純化4～5代后保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 菌株復篩 將初篩得到的菌株接種至20 mL種子培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)18 h，制成種子液。取1 mL種子液接入100 mL產酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d，于4 ℃、5000 r/min條件下離心20 min，取上清液測定纖維素酶活性。纖維素酶活性的測定采用DNS法，以每分鐘從底物溶液中分解產生1 μmol還原糖所需的酶量為1個酶活性單位（U）。

羧甲基纖維素酶（CMCase）測定：0.5 mL粗酶液與含1% CMC-Na的醋酸緩沖液（pH 4.8，0.1 mol/L）1.5 mL，放入≥25 mL刻度試管中，經50 ℃恒溫水浴 30 min后，立即加入DNS 3 mL終止反應。隨后將處理過的樣品煮沸5 min，冷卻至顏色穩(wěn)定，加入去離子水或蒸餾水至25 mL，540 nm處測定吸光值。記錄數據，計算纖維素酶活性。

葡萄糖標準曲線制作：稱取100 mg分析純無水葡萄糖，定容至100 mL。分別吸取上述溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL于干燥刻度試管中，補加蒸餾水至2.0 mL，再加3.0 mL DNS試劑，煮沸5 min后冷卻，并定容至25 mL，540 nm處測定吸光值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，以吸光值為縱坐標，得到葡萄糖標準曲線方程為y=0.6963x-0.0224（R?=0.9991）。

1. 2. 4 菌株鑒定 菌株培養(yǎng)性狀及菌落形態(tài)觀察：以平板劃線法將篩選菌株培養(yǎng)于NA培養(yǎng)基上，置于28 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。觀察并記錄菌落的顏色、大小、形狀。

菌株的16S rDNA序列分析：16S rDNA序列的擴增采用菌落PCR方法，培養(yǎng)供試菌株24 h，挑取少許菌落作為PCR模板。利用已報道16S rDNA序列通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行擴增；擴增產物測序及菌株系統發(fā)育分析參照史國英等（2019）的方法進行。擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI進行BLAST同源性比對，并用MEGA 7.0構建菌株系統發(fā)育進化樹，確定菌株的種屬。

1. 2. 5 菌株對甘蔗葉的降解特性及降解能力測定 將篩選菌株接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，按1%接種量接種到發(fā)酵產酶培養(yǎng)液中，在恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)72 h后，按2%接菌量將篩選菌株的菌液轉接到甘蔗葉發(fā)酵培養(yǎng)液中，以加入未接菌的發(fā)酵產酶培養(yǎng)液為對照，每處理15瓶，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)20 d。

甘蔗葉組織微結構觀察：發(fā)酵第20 d時各處理隨機取1瓶，選取有代表性的葉片進行微結構觀察。參照滕堯等（2018）的方法制作石蠟切片，采用LEICA-DMLB型多功能生物顯微鏡觀察和拍照，顯微照片采用CaseViewer 2.4進行分析、標注；參照劉愷等（2020）的方法制備掃描電鏡樣品，采用HITACHI掃描電子顯微鏡觀察和拍照采圖。每處理樣本組織采集3小塊，制備20個切片。

甘蔗葉失重率測定：蔗葉降解過程中，每隔5 d取樣（每處理隨機取3瓶），分別用雙層紗布過濾后于80 °C烘至恒重，稱量后計算失重率。失重率（%）=（處理組蔗葉干重-對照組蔗葉干重）/對照組蔗葉干重×100。

1. 3 統計分析

利用Excel 2003和DPS 9.50進行數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2. 1 纖維素降解菌初篩結果

通過富集培養(yǎng)、剛果紅平板染色法初篩和菌株純化，得到8株具有明顯透明圈的菌株，分別命名為XW001～XW008，測定菌株的菌落直徑（d）及其對應的透明圈直徑（D），D/d比值在3.56～4.98（圖1）。D/d比值可反映菌株纖維素酶活性的高低，比值越大，纖維素酶活性越高，菌株的纖維素降解能力越強。根據初步篩選結果，選擇D/d比值較高的4株細菌XW001、XW002、XW005和XW007進行復篩試驗。

2. 2 復篩菌株纖維素酶活性比較

進一步的復篩試驗中，測定菌株XW001、XW002、XW005和XW007的纖維素酶活力，結果（圖2）表明，XW005菌株的纖維素酶活性最高，達80.51 U/mL，與其他菌株的纖維素酶活性差異極顯著（P<0.01），顯示出良好的應用潛力。

2. 3 篩選菌株的分類鑒定結果

2. 3. 1 菌落培養(yǎng)性狀 菌落的培養(yǎng)性狀見圖3。菌株XW005在NA固體培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色、圓形、光滑凸起、邊緣整齊、不產色素。

2. 3. 2 菌株XW005的16S rDNA序列分析及系統發(fā)育關系 將菌株XW005的16S rDNA序列在NCBI數據庫進行在線同源比對，結果顯示，該菌株與多株Brucella intermedia細菌的相似性在99%～100%。系統發(fā)育進化樹結果（圖4）顯示，菌株XW005與已報道的B. intermedia（MK249656.1）自成一個分支，表明這2個菌株的親緣關系最近。因此，將菌株XW005鑒定為B. intermedia細菌（NCBI登錄號：MW538324.1）。

2. 4 篩選菌株對甘蔗葉的降解效果

通過掃描電鏡觀察甘蔗葉腐解的表面形態(tài)變化，結果顯示，未接菌對照處理的甘蔗葉，其表面結構的蠟質層光滑規(guī)則，平整且致密，甘蔗葉結構較完整，緊密相連，纖維束均勻且伸展（圖5-A、圖5-B和圖5-C），表皮層未受破壞，組織結構完整（圖5-D）；經菌株XW005處理后，甘蔗葉表皮出現分解孔洞，進而形成裂紋（圖5-E），破壞嚴重的部位維管束解體成絲狀結構，總體出現蓬松化（圖5-F和圖5-G），石蠟切片可觀察到葉片的表皮細胞破裂，組織被破壞消解，呈松弛狀態(tài)（圖5-H）。

甘蔗葉發(fā)酵過程中每隔5 d采樣1次，對比不同發(fā)酵時間的腐解情況，發(fā)現甘蔗葉先從四周切面處開始腐解，然后逐漸向葉片中間擴展，最后將整段葉片腐解成粉末狀（圖6）。測定發(fā)酵5～20 d的甘蔗葉失重率，結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，甘蔗葉失重率呈逐漸上升趨勢；發(fā)酵至第20 d時，XW005菌株處理的甘蔗葉失重率達45.09%（圖7）。

3 討論

產纖維素酶菌株在自然界中分布廣泛，利用選擇性培養(yǎng)基對纖維素降解菌進行富集是篩選特定作物秸稈纖維降解微生物的常用方法。雷湘蘭等（2017）以椰糠作為唯一碳源，從紅樹林土壤中分離出1株高產纖維素酶菌株，該菌株對椰糠的降解率達39.88%；張?zhí)N琦等（2017）利用濾紙和水稻秸稈馴化出對濾紙纖維素和水稻秸稈纖維素均有較強降解能力的優(yōu)勢菌群，該菌群培養(yǎng)7 d時水稻秸稈的失重率達39.3%；孫美娜等（2018）以棉花秸稈為唯一碳源ISAM固體培養(yǎng)基對棉花秸稈纖維素降解菌菌株進行篩選，獲得4株高效纖維素降解菌株，將篩選菌株接種到新鮮棉花秸稈進行培養(yǎng)，培養(yǎng)25 d的棉花秸稈失重率最高可達52.52%。為獲得針對甘蔗葉有較強降解功能的菌株，本研究借鑒前人研究經驗，選擇以甘蔗葉為唯一碳源的培養(yǎng)基富集篩選纖維素降解菌，通過羧甲基纖維素—剛果紅染色法及DNS法對菌株產CMCase能力進行定性和定量檢測，有效提高了甘蔗葉纖維素降解菌的篩選效率；從腐爛的甘蔗葉中分離獲得了具有產纖維素酶活性的Brucella屬細菌菌株XW005，該菌株在28 ℃條件下產纖維素酶活性達80.51 U/mL。本研究結果進一步豐富了產纖維素細菌的菌種資源，同時為蔗葉還田提供了具有潛在應用前景的優(yōu)良菌株。近年來國內外已有一些關于Brucella屬細菌產纖維素酶特性的相關報道，如Behera等（2016）從印度馬哈納迪河三角洲的紅樹林土壤中分離出1株產纖維素酶Brucella屬細菌，該菌株在以麥芽糖為碳源、酵母抽提物為氮源，發(fā)酵溫度35 ℃下產酶活性為96.37 U/mL；Li等（2021）從新疆4種鹽生植物中分離獲得4株Brucella屬細菌，其中有3株具有產纖維素酶活性；此外，有研究結果表明Brucella屬細菌菌株PS4可降解樂果，同時促進植物在逆境和有利條件下生長（Ahmad et al.，2022）。然而，由于Brucella屬細菌個別種是條件致病菌，可能會引發(fā)人類和動物疾病（顧曉英，2017；Guzmán-Verri et al.，2019），因此，對Brucella屬細菌在農業(yè)上的應用還需保留謹慎態(tài)度。本研究獲得的菌株XW005雖來源于甘蔗田間，但若要將菌株做為活體菌劑或含有活菌的微生態(tài)制劑直接應用，除要進一步驗證菌株在田間對甘蔗葉的實際腐解效果外，還需對其環(huán)境安全性進行充分評價。

組織微結構觀察可較直觀地反映菌株對秸稈的腐解情況，從而判斷其降解能力。本研究結果表明，接種XW005發(fā)酵液后，甘蔗葉由邊緣開始腐解，結構被嚴重破壞，整體呈現斷裂狀的碎片狀態(tài)且結構變得更加纖細化，出現大量條狀裂紋，其腐解狀態(tài)與李凌波等（2022）觀察的綠色木霉對油菜秸稈腐解過程相似，區(qū)別在于真菌對秸稈的腐解過程中菌絲體進入秸稈組織內部，加大與秸稈的接觸面，加劇秸稈斷裂，加快秸稈腐解（樸哲等，2011；孫玲，2018）。XW005菌株的作用破壞了甘蔗葉表面最初的完整結構，形成一些小孔，凹陷的小孔表明細菌可水解秸稈并破壞其表面結構。馬玲玲（2020）研究發(fā)現小麥秸稈在經過細菌預處理后，麥稈的表皮觀察到類似現象。有研究表明，細菌進入秸稈組織后需氧細菌如嗜纖維菌（Cytophaga hutchinsonii）主要通過分泌單獨的纖維素酶降解纖維素，而厭氧細菌如一些瘤胃細菌和熱纖維梭菌（Clostridiumthermo cellum）通過產生纖維素多酶復合物降解纖維素（Wilson，2008）。本研究中，通過掃描電鏡觀察到甘蔗葉表面的結構變化，證明了菌株對甘蔗葉的降解作用，表明該菌株在甘蔗葉降解方面具有一定的研究開發(fā)潛力。由于甘蔗的收獲季節(jié)氣溫偏低，后期將會進一步對XW005菌株在15～20 ℃條件下對甘蔗葉的降解效果及降解甘蔗葉過程中的產酶特性、菌株的環(huán)境馴化等方面開展研究，擬為菌株的實際應用提供科學支持。

4 結論

本研究獲得的產纖維素酶菌株XW005來源于田間自然腐解的甘蔗葉，對蔗葉還田環(huán)境具有適應性優(yōu)勢；此外，菌株在常溫條件下可對甘蔗葉進行有效降解，在甘蔗葉田間高效生物腐解劑及纖維素酶制劑產品的研發(fā)上具有良好的應用前景。

參考文獻：

樊保寧，游建華，周秋惠. 2020. 我國糖料甘蔗葉有效處理與利用［J］. 中國糖料，42（1）：77-80. ［Fan B N，You J H，Zhou Q H. 2020. Effective treatment and utilization of sugarcane leaves in China［J］. Sugar Crops of China，42（1）：77-80.］ doi：10.13570/j.cnki.scc.2020.01.014.

樊仙，郭家文，張躍彬. 2014. 國內外甘蔗養(yǎng)分管理概況［J］. 中國糖料，（3）：71-73. ［Fan X，Guo J W，Zhang Y B. 2014. Progress of sugarcane at home and abroad nutrient management［J］. Sugar Crops of China，（3）：71-73.］ doi：10.13570/j.cnki.scc.2014.03.027.

葛暢，韋麗嬌，李明，董學虎，牛釗君，黃偉華，陳小艷. 2020. 甘蔗葉還田技術正負效應研究［J］. 中國熱帶農業(yè)，（2）：56-60. ［Ge C，Wei L J，Li M，Dong X H，Niu Z J，Huang W H，Chen X Y. 2020. Study on positive and negative effects of sugarcane leaf returning technology［J］. China Tropical Agriculture，（2）：56-60.］ doi：10.3969/j.issn.1673- 0658.2020.02.014.

顧曉英. 2017. 2例非牧區(qū)布魯氏菌感染致關節(jié)疼痛患者的護理［J］. 中西醫(yī)結合護理，10（3）：180-182. ［Gu X Y. 2017. Nursing management of joint pain caused by Brucella sp. infection：With two case reports［J］. Nursing of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，10（3）：180-182.］ doi：10.11997/nitcwm.2017010057.

胡海紅，孫繼穎，高聚林，王振，包鬧干朝魯，胡樹平，青格爾. 2016. 低溫高效降解玉米秸稈復合菌系發(fā)酵條件優(yōu)化及腐解菌劑的研究［J］. 農業(yè)環(huán)境科學學報，35（8）：1602-1609. ［Hu H H，Sun J Y，Gao J L，Wang Z，Bao N G C L，Hu S P，Qing G E. 2016. Optimization of fermentation conditions for low-temperature and high-efficiency composite microbial system for corn stover degradation and preliminary development of microbial inocula［J］. Journal of Agro-Environment Science，35（8）：1602-1609.］ doi：10. 11654/jaes.2016-0110.

黃亞麗，黃媛媛，馬慧媛，徐炳雪，賈振華，宋水山，李再興，賈素巧. 2020. 低溫秸稈降解真菌的篩選及在秸稈還田中的應用［J］. 中國農學通報，36（21）：53-60. ［Huang Y L，Huang Y Y，Ma H Y，Xu B X，Jia Z H，Song S S，Li Z X，Jia S Q. 2020. Fungi with corn straw decomposing characterization at low-temperature：Screening and application in straw returning field［J］. Chinese Agricultural Science Bulletin，36（21）：53-60.］

賈輝，陳秀蓉，蘆光新，孔雅麗，楊成德. 2016. 纖維素降解細菌的篩選、生物學特性及降解效果［J］. 草業(yè)學報，25（3）：60-66. ［Jia H，Chen X R，Lu G X，Kong Y L，Yang C D. 2016. Isolation of cellulose-degrading bacteria and determination of their degradation activity［J］. Acta Prataculturae Sinica，25（3）：60-66.］ doi：10.11686/cyxb2014172.

江高飛，暴彥灼，楊天杰，鄭海平，梅新蘭，韋中，徐陽春，沈其榮. 2020. 高溫秸稈降解菌的篩選及其纖維素酶活性研究［J］. 農業(yè)環(huán)境科學學報，39（10）：2465-2472. ［Jiang G F，Bao Y Z，Yang T J，Zheng H P，Mei X L，Wei Z，Xu Y C，Shen Q R. 2020. Screening of thermophilic cellulolytic bacteria and investigation of cellulase thermostability［J］. Journal of Agro-Environment Science，39（10）：2465-2472.］ doi：10.11654/jaes.2020-0958.

雷湘蘭，沈振國，孫倩，鄭金明. 2017. 一株椰糠纖維降解菌的分離、鑒定及特性研究［J］. 中國釀造，36（8）：16-23. ［Lei X L，Shen Z G，Sun Q，Zheng J M. 2017. Isolation，identification and characteristics of a coconut coir fiber-decomposing strain［J］. China Brewing，36（8）：16-23.］ doi：10.11654/jaes.2020-0958.

李冠杰，劉瑩瑩，甄靜，王繼雯，慕琦. 2015. 一株降解纖維素細菌的分離、鑒定及酶學性質分析［J］. 河南科學，（4）：530-534. ［Li G J，Liu Y Y，Zhen J，Wang J W，Mu Q. 2015. Isolation，identification of a cellulose-degrading bacterium and analysis the properties of its enzyme［J］. Henan Science，（4）：530-534.］

李凌波，許歡歡，夏燕維，郭傳旭，楊明珠，馬磊，繆有志，劉東陽，張瑞福. 2022. 油菜秸稈高效降解菌的篩選及其雙功能纖維素酶性質研究［J］. 南京農業(yè)大學學報，45（4）：711-720. ［Li L B，Xu H H，Xia Y W，Guo C X，Yang M Z，Ma L，Miao Y Z，Liu D Y，Zhang R F. 2022. Scree-ning of efficient degradation fungi of rape straw and pro-perties of its bifunctional cellulase［J］. Journal of Nanjing Agricultural University，45（4）：711-720.］ doi：10.7685/jnau.202111024.

李雯，劉艷薇，李停鋒，郭君鈺，顧欣，孫權，王銳. 2020. 不同纖維素降解菌對玉米秸稈的降解效果［J］. 生態(tài)環(huán)境學報，29（2）：402-410. ［Li W，Liu Y W，Li T F，Guo J Y，Gu X，Sun Q，Wang R. 2020. Effects of different cellulose-degrading microorganism on corn straw degradation［J］. Ecology and Environmental Sciences，29（2）：402-410.］ doi：10.16258/j.cnki.1674-5906.2020.02.023.

劉愷，密玲煜，劉玲玲，李洋. 2020. 不同掃描電鏡制樣方法觀察棉花葉片氣孔［J］. 生命科學研究，24（4）：293-300. ［Liu K，Mi L Y，Liu L L，Li Y. 2020. Different SEM sample preparation methods to observe the stomata of cotton leaves［J］. Life Science Research，24（4）：293-300.］ doi：10.16605/j.cnki.1007-7847.2020.04.006.

馬玲玲. 2020. 纖維素降解細菌B. subtilis 1AJ3的纖維素酶的克隆表達、協同作用及其應用研究［D］. 楊凌：西北農林科技大學. ［Ma L L. 2020. Cloning，expression，synergy and application of cellulases from celluloytic bacterium B. subtilis 1AJ3［D］. Yangling：Northwest A & F University.］

馬欣雨，孫麗娜，盧珊，何鵬，周一平，劉星邑. 2020. 秸稈降解菌的篩選及對秸稈的降解效果［J］. 生態(tài)學雜志，39（4）：1198-1205. ［Ma X Y，Sun L N，Lu S，He P，Zhou Y P，Liu X Y. 2020. Screening of straw degrading microbial strains and their degradation effects［J］. Chinese Journal of Ecology，39（4）：1198-1205.］ doi：10.13292/j.1000-4890.202004.012.

樸哲，李玉敏，馬帥，陳德瑩，梅麗娟，殷士學. 2011. 堆肥制作中微生物侵染秸稈的環(huán)境掃描電鏡（ESEM）觀察［J］. 生態(tài)與農村環(huán)境學報，27（5）：98-100. ［Pu Z，Li Y M，Ma S，Chen D Y，Mei L J，Yin S X. 2011. Environmental scanning electron microscope（ESEM）observation of microbial colonization process in straw composting［J］. Journal of Ecology and Rural Environment，27（5）：98-100.］ doi：10.3969/j.issn.1673-4831.2011.05.018.

曲繼松，張麗娟，朱倩楠，田永強，高麗紅. 2019. 微生物菌劑對枸杞枝條粉發(fā)酵堆體腐熟效果的影響［J］. 環(huán)境科學研究，32（2）：332-339. ［Qu J S，Zhang L J，Zhu Q N，Tian Y Q，Gao L H. 2019. Effect of microbial inoculum on the humification degree of Lycium barbarum L．branches powder substrate fermentation［J］. Research of Environmental Sciences，32（2）：332-339.］ doi：10.13198/j.issn.1001-6929.2018.08.19.

史國英，曾泉，農澤梅，葉雪蓮，岑貞陸，李楊瑞，胡春錦. 2019. 一株高效甘蔗內生固氮菌NN08200的鑒定及其對甘蔗的促生長作用［J］. 微生物學通報，46（6）：1336-1345. ［Shi G Y，Zeng Q，Nong Z M，Ye X L，Cen Z L，Li Y R，Hu C J. 2019. Identification of an endophytic nitrogen-fixing bacterium NN08200 from sugarcane and its growth promotion of sugarcane［J］. Microbiology China，46（6）：1336-1345.］ doi：10.13344/j.microbiol.china.180523.

宋春麗. 2019. 蔬菜廢棄物堆肥化技術研究［J］. 農學學報，9（9）：40-44. ［Song C L. 2019. Study on composting tech-niques of vegetable wastes［J］. Journal of Agriculture，9（9）：40-44.］

孫玲. 2018. 秸稈降解菌的篩選及促腐菌劑的應用探究［D］. 長春：吉林農業(yè)大學. ［Sun L. 2018. Screening of straw degrading bacteria and application of microbial inoculum［D］. Changchun：Jilin Agricultural University.］

孫美娜，張凡凡，王永強，魏曉燕，魯建江. 2018. 棉花秸稈纖維素降解菌的篩選鑒定與降解棉稈效果研究［J］. 新疆農業(yè)科學，55（1）：72-75. ［Sun M N，Zhang F F，Wang Y Q，Wei X Y，Lu J J. 2018. Screening and identification of cellulolytic strains from cotton straw and its effect on degradation of cotton stalk［J］. Xinjiang Agricultural Scien-ces，55（1）：72-75.］ doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2018. 01.003.

滕堯，李安定，郝自遠，張洪亮，張麗敏，蔡國俊. 2018. 西番蓮解剖結構特征及低溫脅迫下葉片結構與抗寒性的關系［J］. 浙江農業(yè)學報，30（11）：1849-1858. ［Teng Y，Li A D，Hao Z Y，Zhang H L，Zhang L M，Cai G J. 2018. Anatomical structure of Passiflora caerulea L. and relationship between leaf structure and cold resistance under low temperature stress［J］. Acta Agriculturae Zhejiangensis，30（11）：1849-1858.］ doi：10.3969/j.issn.1004-1524.2018.11.07.

王麗萍，李菊馨，黃顯雅，吳耿寰，謝紅輝. 2018. 6株纖維素降解細菌菌株的分離及其酶活性比較［J］. 農業(yè)研究與應用，31（1）：5-8. ［Wang L P，Li J X，Huang X Y，Wu G H，Xie H H. 2018. Isolation and enzyme activity compari-son of six cellulose decomposing bacteria strains［J］. Agri-cultural Research and Application，31（1）：5-8.］ doi：10. 3969/j.issn.2095-0764.2018.01.002.

王旭輝，葉凱，徐鑫，山其米克，王卉，李冠，鄧宇. 2017. 耐鹽纖維素降解菌的篩選、鑒定及其配比優(yōu)化的研究［J］. 新疆農業(yè)科學，54（12）：2282-2292. ［Wang X H，Ye K，Xu X，Shanqimike，Wang H，Li G，Deng Y. 2017. Study on the isolation，identification of salt-tolerant cellulose-degra-ding strains and optimization of its strain ratio［J］. Xinjiang Agricultural Sciences，54（12）：2282-2292.］ doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2017.12.016.

臧超群，白元俊，宋飛，謝瑾卉，林英，梁春浩. 2018. 蒼白桿菌SY286菌株纖維素酶基因的克隆與表達［J］. 沈陽農業(yè)大學學報，49（3）：279-285. ［Zang C Q，Bai Y J，Song F，Xie J H，Lin Y，Liang C H. 2018. Cloning and expression of a cellulase gene from Ochrobactrum sp. SY286［J］. Journal of Shenyang Agricultural University，49（3）：279-285.］ doi：0.3969/j.issn.1000-1700.2018.03.004.

張才芳. 2019. 蔗葉還田深度和生物表面活性劑對土壤養(yǎng)分和微生物群落的影響［D］. 福州：福建農林大學. ［Zhang C F. 2019. Effects of sugarcane leaves amendments to different soil depth and biosurfactant on soil nutrition and microbial community［D］. Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University.

張?zhí)N琦，徐鳳花，張書敏，吳優(yōu)，張晴. 2017. 水稻秸稈降解菌系的篩選及其菌群組成分析［J］. 江蘇農業(yè)科學，45（8）：257-260. ［Zhang Y Q，Xu F H，Zhang S M，Wu Y，Zhang Q. 2017. Screening of rice straw degradation bacteria and analysis of its microbial composition［J］. Jiangsu Agricultural Sciences，45（8）：257-260.］ doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.08.069.

趙麗萍. 2014. 蔗葉還田對土壤理化性狀、生態(tài)環(huán)境及甘蔗產量的影響［J］. 土壤通報，45（2）：500-507. ［Zhao L P. 2014. Effect of trash returning on physical and chemical properties of soil，ecological environment and yields of sugarcane［J］. Chinese Journal of Soil Science，45（2）：500-507.］ doi：10.19336/j.cnki.trtb.2014.02.041.

Ahmad S，Chaudhary H J，Damalas C A. 2022. Microbial detoxification of dimethoate through mediated hydrolysis by Brucella sp. PS4：Molecular profiling and plant growth-promoting traits［J］. Environmental Science and Pollution Research International，29（2）：2420-2431. doi：10.1007/s 11356-021-15806-1.

Behera B C，Mishra R R，Singh S K，Dutta S K，Thatoi H. 2016. Cellulase from Bacillus licheniformis and Brucella sp. isolated from mangrove soils of Mahanadi river delta，Odisha，India［J］. Biocatalysis and Biotransformation，34（1）：790-800. doi：10.1080/10242422.2016.1212846.

Danso B，Ali S S，Xie R R，Sun J Z. 2021. Valorisation of wheat straw and bioethanol production by a novel xylanase-and cellulase-producing Streptomyces strain isolated from the wood-feeding termite，Microcerotermes species［J］. Fuel，310：122333. doi：10.1016/j.fuel.2021.122333.

Guzmán-Verri C，Suárez-Esquivel M，Ruiz-Villalobos N，Zygmunt M S，Gonnet M，Campos E，Víquez-Ruiz E，Chacón-Díaz C，Aragón-Aranda B，Conde-Alvarez R，Moriyón I，Blasco J M，Mu?oz P M，Baker K S， Thomson N R，Cloeckaert A，Moreno E. 2019. Genetic and phenotypic characterization of the etiological agent of canine orchiepididymitis smooth Brucella sp. BCCN84.3［J］. Frontiers in Veterinary Science，6：175. doi：10.3389/fvets.2019.00175.

Li L，Gao L，Liu Y H，Fang B Z，Huang Y，Mohamad O A A，Egamberdieva D，Li W J，Ma J B. 2021. Diversity of cultivable endophytic bacteria associated with halophytes in Xinjiang of China and their plant beneficial traits［J］. Journal of Arid Land，13（8）：790-800. doi：10.1007/s13205- 019-1678-8.

Mohammadipour Z，Enayatizamir N，Ghezelbash G，Moezzi A. 2021. Bacterial diversity and chemical properties of wheat straw-based compost leachate and screening of cellulase producing bacteria［J］. Waste and Biomass Valorization，12（3）：1293-1302. doi：10.1007/s12649-020-01119-w.

Surachaia R，Apisitb S，Thanatipc S. 2020. Pseudomonas stutzeri CM1，novel thermotolerant cellulase-producing bacteria isolated from forest soil［J］. Pakistan Journal of Biological Sciences，23（10）：1345-1350. doi：10.3923/pjbs. 2020.1345.1350.

Wang X G，Tian L，Li Y X，Zhong C，Tian C J. 2022. Effects of exogenous cellulose-degrading bacteria on humus formation and bacterial community stability during composting［J］. Bioresource Technology，395：127458. doi：10.1016/j. biortech.2022.127458.

Wilson D B. 2008. Three microbial strategies for plant cell wall degradation［J］. Annals of the New York Academy of Sciences，1125：289-297. doi：10.1196/annals.1419.026.

（責任編輯 王 暉）