藍(lán)雯婷 任董董 李瑞環(huán) 潘斐 姜子德 潘汝謙 紀(jì)春艷

摘要：【目的】檢測荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性，建立敏感性基線；測定抗烯酰嗎啉突變株的生物學(xué)適合度，為荔枝霜疫病的化學(xué)防治提供依據(jù)。【方法】采用菌絲生長速率法，對2019—2020 年來自中國廣東、廣西、福建、四川和云南5 個省份荔枝主產(chǎn)區(qū)的320 株荔枝霜疫霉單孢子囊菌株進(jìn)行烯酰嗎啉敏感性測定，通過藥劑馴化獲得抗烯酰嗎啉突變株，測定其生物學(xué)適合度?！窘Y(jié)果】經(jīng)過異常值分析并剔除，317 株荔枝霜疫霉菌株對烯酰嗎啉的敏感性頻率分布呈正態(tài)分布，EC50值介于0.086 3～0.173 3 μg·mL-1之間，平均（0.122 2±0.000 9）μg·mL-1，以此建立荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性基線。來自2020 年的荔枝霜疫霉菌株對烯酰嗎啉的EC50均值較2019 年顯著增高。3 株荔枝霜疫霉抗烯酰嗎啉突變株的抗性指數(shù)介于77.17～360.11 之間，為中到高抗水平，抗藥性可穩(wěn)定遺傳，與親本相比，抗性突變株的孢子囊萌發(fā)率及卵孢子產(chǎn)量均下降，但致病力相當(dāng)?！窘Y(jié)論】荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉敏感，烯酰嗎啉可繼續(xù)作為防治荔枝霜疫病的有效殺菌劑。

關(guān)鍵詞：荔枝霜疫霉；烯酰嗎啉；敏感性；抗性突變株

中圖分類號：S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）06-1226-09

中國是荔枝的生產(chǎn)和消費大國，現(xiàn)有荔枝種植面積55 萬hm2，主要分布在廣東、廣西、福建、四川、云南和海南等省區(qū)[1]。由荔枝霜疫霉（Peronophythoralitchii）引起的荔枝霜疫病是荔枝生產(chǎn)中的重要病害，該病害不僅在生長期發(fā)病，危害果實、花穗和嫩葉，也可在果實貯藏期發(fā)生，造成爛果[2]，嚴(yán)重影響荔枝的品質(zhì)、產(chǎn)量及鮮果外銷。由于缺少農(nóng)藝性狀優(yōu)良、高產(chǎn)且抗病的品種，化學(xué)防治因其防效好、見效快，是生產(chǎn)中防控霜疫病的主要方法。

羧酸酰胺類（carboxylic acid amides，CAAs）殺菌劑以抑菌活性高、內(nèi)吸傳導(dǎo)強、對卵菌特效等特點而受到廣泛的重視。該類殺菌劑具有低至中等的抗藥性風(fēng)險，作用靶點與細(xì)胞壁纖維素的形成及細(xì)胞壁磷脂層的合成相關(guān)[3]。烯酰嗎啉（dimethomorph）屬于CAAs類殺菌劑，兼具保護(hù)和治療的作用，在荔枝霜疫病的防控中普遍應(yīng)用。據(jù)報道，40%的烯酰嗎啉水分散粒劑1000～1500 倍液對霜疫病的防治效果較好[4]；烯酰嗎啉對荔枝霜疫霉孢子囊的萌發(fā)和菌絲生長的抑制效果較顯著[5]，烯酰嗎啉與咪鮮胺以1∶1 質(zhì)量比的比例混配使用可作為防控荔枝霜疫病和炭疽病的優(yōu)選參考[6]。烯酰嗎啉于1996 年開始用于荔枝霜疫病的防控[7]，隨著用量及使用年限的增加，病原菌是否存在抗藥性的問題愈發(fā)引起關(guān)注。Wang 等[8]測定了2007 年來自廣東、廣西和福建省的127 株荔枝霜疫霉菌株對烯酰嗎啉的敏感性，結(jié)果表明，供試菌株對烯酰嗎啉的敏感性高，未發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株。易賽等[9]利用2009—2012 年間采集自廣東、廣西、福建和云南省區(qū)的115 株荔枝霜疫霉菌株對烯酰嗎啉進(jìn)行敏感性測定，未發(fā)現(xiàn)抗藥性亞群體，之后至今未有相關(guān)的抗藥性研究報道。筆者在本研究中檢測2019—2020 年分離自中國5 個省份荔枝主產(chǎn)區(qū)的320 株荔枝霜疫霉單孢子囊菌株對烯酰嗎啉的敏感性，旨在了解中國荔枝主產(chǎn)區(qū)的荔枝霜疫霉群體對烯酰嗎啉的敏感性變化；篩選荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的抗性突變株并對其生物學(xué)適合度進(jìn)行測定；以期為荔枝霜疫霉群體的抗藥性監(jiān)測及抗性治理提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

采集2019—2020 年中國5 個省份（廣東、廣西、四川、福建和云南）荔枝主產(chǎn)區(qū)的病果，經(jīng)組織分離、純化獲得320 株荔枝霜疫霉的單孢子囊菌株。依采集的年份：分離自2019 年的180 株，2020 年的140 株。依采集的省份：分離自廣東的103 株，廣西的30 株，福建的62 株，云南的30 株及四川的95株。菌株均保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)殺菌劑研究室，信息詳見表1。

1.2 供試藥劑

烯酰嗎啉原藥（99%）購自沈陽化工研究院。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，99%）購自上海昂一生物科技有限公司。將烯酰嗎啉原藥溶于二甲基亞砜，配置成質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg·mL-1的藥液備用。

1.3 荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的有效抑制中濃度值（the median effective concentration，EC50），配置不同濃度的含藥胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（carrots agar，CA）平板，從新鮮菌落邊緣打取直徑5.0 mm菌餅置于含藥平板中央，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，以加入等體積量二甲基亞砜的處理為對照，每個處理3 次重復(fù)。采用十字交叉法測量各處理的菌落生長直徑，計算其菌絲生長抑制率。

以殺菌劑濃度的對數(shù)和抑制率的概率值建立毒力回歸方程，計算抑制菌落生長的有效抑制中濃度（EC50）。采用Kolmogorov- Smirnov 檢驗（K- S 檢驗），就供試菌株對殺菌劑的lg（EC50）值進(jìn)行正態(tài)性檢驗（p＞0.05 符合正態(tài)分布），利用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行異常值檢測，以剔除異常值后符合正態(tài)分布的EC50 均值作為敏感性基線。以lg（EC50）值為橫坐標(biāo)、供試菌株的分布頻率為縱坐標(biāo)，繪制敏感性頻率分布圖。通過計算抗性指數(shù)進(jìn)行供試菌株的抗性評價。根據(jù)Food and Agriculture Organization（FAO）的抗藥性評價標(biāo)準(zhǔn)[10]，抗性突變株的EC50值比野生型菌株高5 倍為敏感菌株（S）；＞5～10 倍為低抗菌株（low resistance，LR）；＞10～100 倍為中抗菌株（mediumresistance，MR）；100 倍以上的為高抗菌株（highresistance，HR）。

抗性指數(shù)（resistance factor，RF）= 供試菌株EC50值/敏感性基線EC50值。

1.4 藥劑馴化誘導(dǎo)抗性突變株及抗藥穩(wěn)定性測定

將荔枝霜疫霉（野生型）單孢子囊菌株接種于質(zhì)量濃度依次為0.25、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1的含藥平板進(jìn)行多代馴化誘導(dǎo)，將能在含5 μg·mL-1烯酰嗎啉的CA培養(yǎng)基上正常生長的視為抗性突變株進(jìn)行編號保存。將獲得的抗性突變株在不含藥的CA平板上繼代培養(yǎng)9 代，測定第1、3、5、7 和9 代的抗性突變株對烯酰嗎啉的敏感性并進(jìn)行抗藥穩(wěn)定性的分析。

1.5 抗性突變株的生物學(xué)適合度測定

1.5.1 孢子囊的產(chǎn)生、萌發(fā)及形態(tài)變化參考任德春[11]的方法，進(jìn)行孢子囊產(chǎn)生及萌發(fā)的測定。孢子囊產(chǎn)量的測定：將親本及其抗性突變株在無藥CA平板上25 ℃培養(yǎng)4 d，配制孢子囊懸浮液，用血球計數(shù)板進(jìn)行孢子囊產(chǎn)量的計數(shù)，每個處理3次重復(fù)。孢子囊萌發(fā)率的測定：吸取孢子囊懸浮液涂布于水瓊脂（water agar，WA）平板上于28 ℃培養(yǎng)，觀察孢子囊的萌發(fā)并計算萌發(fā)率，每個處理3 次重復(fù)（300 個孢子囊·菌株-1）。休止孢萌發(fā)率：吸取適量的孢子囊懸浮液，待孢子囊釋放游動孢子，取游動孢子懸浮液振蕩，獲得休止孢的懸浮液，觀察休止孢的萌發(fā)并計算萌發(fā)率，每個處理3 次重復(fù)（300 個休止孢·菌株-1）。

以水為浮載劑，對各菌株的孢子囊制片，用顯微鏡觀察其形態(tài)并測量其長和寬（100 個孢子囊·菌株-1）。1.5.2 卵孢子的產(chǎn)生參考Flier 等[12]方法，將親本及其抗性突變株的菌餅接種于CA平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)14 d 至卵孢子產(chǎn)生，配制卵孢子的懸浮液進(jìn)行觀測計數(shù)，每個處理3 次重復(fù)。

1.5.3 致病力的測定將親本及其抗性突變株在CA平板上培養(yǎng)活化，配制濃度為1×104 個·mL-1的孢子囊懸浮液，采集生長度和大小較一致的嫩葉（妃子笑），用解剖針在葉片背部主葉脈兩側(cè)刺傷葉表皮，吸取孢子囊懸浮液10 μL 滴于刺傷處，每個菌株接種6 枚葉片，設(shè)置3 次重復(fù)。以等量無菌水接種為空白對照。對葉片的發(fā)病情況進(jìn)行逐日觀察并記錄，利用ImageJ 軟件測量并計算病斑面積占比及發(fā)病率。

發(fā)病率（%）=發(fā)病葉片數(shù)/總?cè)~片數(shù)×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 23.0、Duncan 新復(fù)極差法（DMRT）及獨立樣本t檢驗進(jìn)行差異顯著性分析（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性測定

利用2019—2020 年分離自廣東、廣西、福建、四川和云南等5 個荔枝主產(chǎn)區(qū)獲得的荔枝霜疫霉單孢子囊菌株（320 株）對烯酰嗎啉進(jìn)行敏感性測定，結(jié)果表明，敏感性頻率分布不呈連續(xù)單峰曲線。經(jīng)正態(tài)性檢驗表明，供試菌株對烯酰嗎啉的敏感性頻率分布不符合正態(tài)分布（p＜0.05），檢測到3 個敏感性升高的異常值。剔除異常值后的317 株荔枝霜疫霉的敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線（圖1）。317 株供試菌株對烯酰嗎啉的EC50 值范圍為0.086 3～0.173 3 μg·mL-1，最值之間相差2.01 倍，平均EC50值為（0.122 2±0.000 9）μg·mL-1，以此作為荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性基線。

以317 株荔枝霜疫霉的EC50 值與敏感性基線的比值計算抗性倍數(shù)。317 株菌株的抗性倍數(shù)均小于5，未發(fā)現(xiàn)荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的田間抗性菌株。

2.2 2019—2020 兩年間荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性比較

利用2019—2020 兩年間獲得的荔枝霜疫霉菌株對烯酰嗎啉的敏感性進(jìn)行比較，結(jié)果表明，2019年180 株荔枝霜疫霉菌株對烯酰嗎啉的EC50 值范圍為0.080 8～0.144 3 μg ·mL-1，最值之間相差1.79倍，平均EC50 值為（0.117 5 ± 0.001 2）μg · mL- 1。2020 年140 株荔枝霜疫霉菌株對烯酰嗎啉的EC50值范圍為0.0974～0.1733 μg · mL- 1，最值之間相差1.78 倍，平均EC50值為（0.127 3±0.001 1）μg ·mL-1。

經(jīng)獨立樣本t 檢驗表明，分離自2020 年的荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的EC50均值較2019 年顯著提高了8.34%（p＜0.05，圖2）。與2019 年的相比較，2020 年荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的抗藥性風(fēng)險有所增加。

2.3 不同省區(qū)荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性差異

將來自不同省份的荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性進(jìn)行比較，結(jié)果表明，來自廣東和廣西的荔枝霜疫霉菌株群體對烯酰嗎啉的敏感性較低，而來自福建、云南和四川的荔枝霜疫霉菌株群體的敏感性相對較高，兩個群體之間存在顯著性差異（表2）。其中，來自四川的荔枝霜疫霉菌株EC50 均值最低（0.115 4±0.001 7 μg·mL-1），對烯酰嗎啉的敏感性相對較高。而來自廣東的荔枝霜疫霉菌株EC50均值最高（0.128 9±0.001 5 μg·mL-1），對烯酰嗎啉的敏感性相對低。

2.4 烯酰嗎啉抗性突變株的抗性水平及抗藥穩(wěn)定性

經(jīng)藥劑馴化獲得3 株荔枝霜疫霉的抗烯酰嗎啉突變株（GZ3-3R、DH1-9R和LZ4-10R），經(jīng)敏感性測定表明，抗性突變株對烯酰嗎啉的抗性指數(shù)范圍為77.17～360.11，第9 代較第1 代的抗性指數(shù)均升高（表3），其中GZ3-3R和DH1-9R在第1 代和第9 代均為高抗突變株；LZ4-10R在第1 代為中抗突變株，在第9 代為高抗突變株。3 株抗性突變株的抗藥性均能夠穩(wěn)定遺傳。

2.5 烯酰嗎啉抗性突變株的生物學(xué)適合度

2.5.1 孢子囊的產(chǎn)量、萌發(fā)率及形態(tài)變化對3 株荔枝霜疫霉的抗烯酰嗎啉突變株（GZ3-3R、DH1-9R和LZ4-10R）及其親本菌株（GZ3-3S、DH1-9S和LZ4-10S）進(jìn)行孢子囊的產(chǎn)量、萌發(fā)率及形態(tài)變化的測定，結(jié)果（表4）表明，抗性突變株與其親本相比較，孢子囊的產(chǎn)量不具有顯著性差異（p＞0.05）；抗性突變株的孢子囊萌發(fā)率均較其親本下降，其中，抗性突變株GZ3-3R和DH1-9R的孢子囊萌發(fā)率比其親本分別降低了32%和41%。3 株抗性突變株的孢子囊大小均比其親本大，其中，抗性突變株GZ3-3R和LZ4-10R的孢子囊的大?。ㄩL和寬）均較其親本菌株顯著增大（p＜0.05）?？剐酝蛔冎闓Z3-3R休止孢的萌發(fā)率較其親本顯著下降（p＜0.05）。

2.5.2 卵孢子的產(chǎn)量對3 株荔枝霜疫霉的抗烯酰嗎啉突變株及其親本菌株進(jìn)行有性卵孢子產(chǎn)量的測定表明，與親本相比較，3 株抗性突變株的卵孢子產(chǎn)量均下降，其中，抗性突變株DH1-9R的卵孢子產(chǎn)量比其親本降低了40%，經(jīng)獨立樣本t 檢驗顯示，抗性突變株與其親本的卵孢子產(chǎn)量之間差異不顯著（p＞0.05，圖3）。

2.5.3 致病力測定對3 株荔枝霜疫霉的抗烯酰嗎啉突變株及其親本菌株進(jìn)行致病力測定表明，抗性突變株及其親本均能侵染荔枝新鮮嫩葉引起發(fā)病。接種48 h 之后，以接種點為中心形成褐色病斑，并向外擴展（圖4）。抗性突變株GZ3-3R 及LZ4-10R 接種葉片后發(fā)病的病斑面積占比分別為（11.52±2.32）%和（19.75±3.03）%，較其各自親本菌株[分別為（13.88±3.38）%和（20.59±3.87）%]略低；而抗性突變株DH1-9R接種發(fā)病的病斑面積占比（21.28 ± 2.52）% 與其親本接種發(fā)病的（21.18 ±2.62）%相當(dāng)。獨立樣本t 檢驗表明3 株抗性突變株與其親本的致病力之間差異不顯著（p＞0.05）。

3 討論

病原菌對CAAs類殺菌劑的抗性遺傳由一對隱性基因控制[13]，靶標(biāo)基因發(fā)生突變后經(jīng)有性雜交形成純合體表現(xiàn)抗藥性[14]。已有卵菌（如霜霉菌）對烯酰嗎啉產(chǎn)生田間抗藥性的相關(guān)報道。Gisi 等[13]檢測到分離自法國、德國果園的葡萄霜霉菌（Plasmoparaviticola）對烯酰嗎啉具有抗性，抗性菌株的頻率為42%。路粉等[15]測定了2011—2016 年來自河北和山東的1821 個黃瓜霜霉菌（Pseudoperonosporacubensis）菌株對烯酰嗎啉的敏感性，表明抗性頻率為88.5%。有關(guān)荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉抗性風(fēng)險的研究報道甚少。易賽等[9]測定了2009—2012 年來自廣東、廣西、福建和云南4 個省份的115 株荔枝霜疫霉菌株對烯酰嗎啉的敏感性，表明EC50 均值為（0.170 2±0.002 6）μg ·mL-1，無抗藥性亞群體產(chǎn)生。筆者測定了2019—2020 年來自廣東、廣西、福建、四川和云南5 個省份的320 株荔枝霜疫霉菌株對烯酰嗎啉的敏感性，EC50 均值為（0.122 2±0.000 9）μg·mL-1，未發(fā)現(xiàn)田間抗藥性菌株。與易賽等[9]的結(jié)果相比較，2019—2020 年來自中國荔枝主產(chǎn)區(qū)的荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性有所增加；且來自2020 年的荔枝霜疫霉菌株對烯酰嗎啉的敏感性較2019 年的顯著升高，抗藥性風(fēng)險相應(yīng)有所增加。烯酰嗎啉仍可作為防治荔枝霜疫病的有效殺菌劑繼續(xù)使用，但應(yīng)加強荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的連年抗藥性動態(tài)監(jiān)測，為田間荔枝霜疫病的防控及科學(xué)用藥提供重要的指導(dǎo)。

易賽等[9]對不同地理來源的荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性分析表明，4 個不同省份的荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性差異不顯著。本研究結(jié)果表明，來自廣東、廣西兩省份的荔枝霜疫霉群體與來自福建、云南和四川三省的菌株群體對烯酰嗎啉的敏感性差異顯著，其中來自四川省的荔枝霜疫霉EC50均值最低，而來自廣東省的EC50均值最高，則敏感性最低。不同地域的施藥水平、年限及栽培管理等因素均會影響病原菌對殺菌劑抗藥性風(fēng)險水平。在荔枝生產(chǎn)中應(yīng)注意合理使用藥劑，選擇與烯酰嗎啉無交互抗性的殺菌劑交替或混合使用，從而延緩抗藥性的發(fā)生。

生物學(xué)適合度是抗性突變株及其親本菌株單獨存在時的生存力或致病力的反映[16]。Stein 等[17]的研究表明致病疫霉（Phytophthora infestans）抗烯酰嗎啉的突變株與親本相比較，生長速率和致病性降低。袁善奎等[18]通過紫外誘變獲得3 株P. infestans對烯酰嗎啉的抗性突變株，突變株的生長速率和產(chǎn)孢子囊的能力顯著下降。Zhu 等[19]利用紫外誘導(dǎo)獲得的黃瓜霜霉菌抗烯酰嗎啉突變株的孢子囊產(chǎn)率及致病力均下降。崔曉嵐等[20]通過紫外誘變獲得抗烯酰嗎啉的辣椒疫霉突變株，抗性指數(shù)介于16.38～132.15 之間，致病力與親本菌株相當(dāng)。筆者在本研究中通過藥劑馴化獲得荔枝霜疫霉抗烯酰嗎啉的突變株，抗性指數(shù)介于77.17～360.11 之間，抗藥性可穩(wěn)定遺傳，突變株的孢子囊萌發(fā)率及卵孢子產(chǎn)量均下降。較低的孢子囊萌發(fā)率及卵孢子產(chǎn)量不利于荔枝霜疫霉群體在田間形成優(yōu)勢菌群，這與Stein 等[17]研究結(jié)果較一致。筆者在本研究中荔枝霜疫霉抗烯酰嗎啉突變株的致病力與其親本菌株略低或相當(dāng)，有必要在后續(xù)研究中獲得更多的抗性突變株，擴大群體評估荔枝霜疫霉對CAAs 類殺菌劑的抗藥性風(fēng)險。卵菌對CAA類殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生可能與編碼纖維素合成酶復(fù)合體的CesA1、CesA2、CesA3 和CesA4 等基因突變有關(guān)[21-24]。筆者在本研究中獲得的荔枝霜疫霉抗烯酰嗎啉突變株的抗性機制有待深入研究，結(jié)合田間抗藥性風(fēng)險的持續(xù)監(jiān)測，以期為烯酰嗎啉等CAAs類殺菌劑持久發(fā)揮良好防效提供重要的依據(jù)。

4 結(jié)論

建立了荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉的敏感性基線，荔枝霜疫霉對烯酰嗎啉仍保持較高的敏感性，未檢測到田間抗性菌株，烯酰嗎啉仍可作為防治荔枝霜疫病的有效藥劑。通過馴化測定表明，荔枝霜疫霉抗烯酰嗎啉的突變株孢子囊的萌發(fā)率及卵孢子產(chǎn)量均下降，致病力相當(dāng)，但存在一定風(fēng)險。筆者將繼續(xù)加強荔枝霜疫霉群體對烯酰嗎啉的抗藥性監(jiān)測及風(fēng)險評估。

致謝：國家荔枝龍眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系各綜合試驗站提供病樣采集支持，謹(jǐn)此致謝。

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