王敬,王玲朝

卵泡發(fā)育是受多種基因、激素、細(xì)胞因子等相互協(xié)調(diào),共同調(diào)控的動(dòng)態(tài)過(guò)程,歷經(jīng)原始卵泡的啟動(dòng)募集、竇前卵泡的發(fā)育、優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇、排卵和黃體生成4個(gè)階段[1]。這個(gè)生物學(xué)過(guò)程復(fù)雜且漫長(zhǎng),以卵泡直徑增大伴隨顆粒細(xì)胞增殖和功能分化為特征。卵母細(xì)胞周?chē)念w粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育過(guò)程中不僅影響卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟,而且通過(guò)自身特有的卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone,LH)受體,完成對(duì)促性腺激素的應(yīng)答反應(yīng),參與促性腺激素對(duì)卵母細(xì)胞核的促成熟作用[2-3]。因此顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要。Alvarez GM等[4]和Zhang Y等[5]報(bào)道,顆粒細(xì)胞功能受損和能量代謝的異常是造成女性卵泡發(fā)育異常和生育力下降的重要原因之一。因此,本文將著重從顆粒細(xì)胞能量代謝及調(diào)控機(jī)制對(duì)卵泡發(fā)育的影響方面進(jìn)行綜述。

1 卵母細(xì)胞能量需求及對(duì)顆粒細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制

卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟、受精以及胚胎發(fā)育過(guò)程依賴于卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體功能的正常發(fā)揮[6]。在卵母細(xì)胞能量代謝過(guò)程中,大部分葡萄糖首先經(jīng)過(guò)顆粒細(xì)胞糖酵解為丙酮酸,然后通過(guò)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至卵母細(xì)胞的線粒體中[7],為卵母細(xì)胞能量生產(chǎn)提供能量底物[8]。卵母細(xì)胞亦通過(guò)分泌卵母細(xì)胞分泌因子(oocyte-secreted factors,OSFs)包括生長(zhǎng)分化因子-9(growth differentiation factor-9,GDF-9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15(bone morphogenetic protein-15,BMP-15)等成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)-β超家族成員,調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖、分化和代謝活動(dòng)[9-12]。另外卵母細(xì)胞亦分泌FGF7和FGF10等促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖,介導(dǎo)卵泡的募集和發(fā)育[13]。卵母細(xì)胞對(duì)顆粒細(xì)胞增殖與能量代謝的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜多變的過(guò)程[14],受卵泡發(fā)育的不同階段、激素水平、顆粒細(xì)胞能量狀態(tài)等多種因素影響。

2 顆粒細(xì)胞能量代謝與調(diào)控

卵巢顆粒細(xì)胞是卵泡的重要組成細(xì)胞,在女性生殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15]。顆粒細(xì)胞通過(guò)縫隙連接和旁分泌因子為卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟提供營(yíng)養(yǎng)支持[16]。Uyar A等[17]報(bào)道顆粒細(xì)胞受損會(huì)影響激素和細(xì)胞因子的分泌,降低卵母細(xì)胞的質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能。

2.1 糖酵解功能與顆粒細(xì)胞能量代謝

卵泡液將顆粒細(xì)胞分隔成兩個(gè)細(xì)胞亞群,包括襯在卵泡壁上的壁層顆粒細(xì)胞(mural granulosa cells,mGCs)和圍繞在卵母細(xì)胞周?chē)穆亚痤w粒細(xì)胞(cumulus granulosa cells,cGCs)。cGCs包繞在卵母細(xì)胞周?chē)?cGCs的胞膜突起穿過(guò)透明帶與卵子的胞膜形成縫隙連接,從而與卵母細(xì)胞形成緊密結(jié)合的合胞體,通過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞間連接機(jī)制影響著卵泡的發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)豬早期竇卵泡中約有8 000個(gè)顆粒細(xì)胞。這個(gè)數(shù)目隨著卵泡發(fā)育增大逐漸增加,發(fā)展至竇狀卵泡時(shí)含有多達(dá)1.0×106個(gè)顆粒細(xì)胞(直徑3～6 mm)[18]。顆粒細(xì)胞提供維持卵母細(xì)胞基礎(chǔ)代謝活性所需85%的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并發(fā)出調(diào)節(jié)其分化的信號(hào)。基于上述理論,為了獲得高質(zhì)量的卵母細(xì)胞,顆粒細(xì)胞能量代謝穩(wěn)定及代謝方式的適應(yīng)性轉(zhuǎn)變?cè)诼雅萆L(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著重要角色。

在卵母細(xì)胞成熟的過(guò)程中,因卵母細(xì)胞內(nèi)糖酵解酶表達(dá)低,大部分葡萄糖首先經(jīng)過(guò)顆粒細(xì)胞糖酵解為丙酮酸,后者通過(guò)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至卵母細(xì)胞的線粒體中,成為卵母細(xì)胞能量產(chǎn)生的底物[7-8,19]。多項(xiàng)研究表明,顆粒細(xì)胞的代謝功能直接影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量和發(fā)育潛能,進(jìn)而影響卵泡的發(fā)育。Jahromi BN等[3]研究卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中發(fā)現(xiàn),未經(jīng)顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的人未成熟卵母細(xì)胞碎片率增加,胚胎發(fā)育延遲,影響胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能。另外,有多項(xiàng)涉及人類及動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育的研究均證實(shí)此觀點(diǎn),即與未經(jīng)顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的卵母細(xì)胞相比,加入顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的未成熟卵母細(xì)胞在成熟率和胚胎發(fā)育能力方面顯著提高。顆粒細(xì)胞含有多種糖酵解相關(guān)酶,在糖酵解代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生丙酮酸并轉(zhuǎn)運(yùn)給卵母細(xì)胞,為卵母細(xì)胞提供能量底物,進(jìn)而為胞漿及胞核的成熟提供能量支持。Munakata Y等[19]觀察牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程發(fā)現(xiàn),卵母細(xì)胞的能量狀態(tài)包括脂質(zhì)和ATP含量以及H4K12乙?；脚c顆粒細(xì)胞數(shù)量及葡萄糖的消耗量密切相關(guān)。Bao Y等[7]研究發(fā)現(xiàn),將豬卵冠丘復(fù)合物及裸卵體外培養(yǎng),在豬卵冠丘復(fù)合物培養(yǎng)體系中加入5.6 mM葡萄糖或2 mM丙酮酸,囊胚形成率得到明顯改善,而裸卵體外培養(yǎng)過(guò)程中加入葡萄糖不會(huì)影響卵母細(xì)胞成熟及胚胎形成率,但加入丙酮酸后卻能明顯改善卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。說(shuō)明顆粒細(xì)胞糖代謝對(duì)于卵母細(xì)胞發(fā)育成熟有協(xié)同促進(jìn)作用,并且顆粒細(xì)胞通過(guò)自身糖酵解功能為卵母細(xì)胞發(fā)育提供能量底物。張玲等[20]對(duì)卵巢組織中各級(jí)卵泡間磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)蛋白的表達(dá)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),原始卵泡和初級(jí)卵泡中顆粒細(xì)胞上PFK和LDH表達(dá)量均高于卵母細(xì)胞,而且竇卵泡中顆粒細(xì)胞PFK和LDH的表達(dá)量高于原始卵泡和初級(jí)卵泡,進(jìn)一步說(shuō)明從卵泡發(fā)育初期,顆粒細(xì)胞就表現(xiàn)出較強(qiáng)的糖酵解活性,通過(guò)高糖酵解活性,維持卵母細(xì)胞能量代謝穩(wěn)定。

2.2 顆粒細(xì)胞線粒體功能與能量代謝

線粒體是真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器之一,是細(xì)胞內(nèi)主要ATP的生成中心。線粒體被稱為細(xì)胞的能量加工工廠,以三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生ATP維持細(xì)胞生命活動(dòng)。葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等轉(zhuǎn)化為(乙酰輔酶A)乙酰CoA,最終都會(huì)進(jìn)入線粒體的氧化呼吸鏈,合成ATP為細(xì)胞提供能量,并且通過(guò)調(diào)節(jié)代謝、鈣離子動(dòng)態(tài)平衡、調(diào)節(jié)膜電位控制細(xì)胞程序性死亡,參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等細(xì)胞活動(dòng)[21]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中線粒體通過(guò)產(chǎn)生能量的關(guān)鍵反應(yīng)氧化磷酸化、代謝方式和代謝底物的轉(zhuǎn)換、以及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)事件,對(duì)細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境壓力改變做出適應(yīng)性調(diào)整。線粒體膜電位是細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。因此,破壞線粒體功能,對(duì)細(xì)胞增殖和存活有負(fù)面影響。

顆粒細(xì)胞線粒體功能的穩(wěn)定對(duì)維持顆粒細(xì)胞糖酵解功能以及維持卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[22]。有文獻(xiàn)報(bào)道,接受控制性促排卵的女性顆粒細(xì)胞線粒體DNA(mtDNA)含量降低將伴隨卵巢儲(chǔ)備減少,顆粒細(xì)胞呈低ATP水平的子宮內(nèi)膜異位癥患者體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)妊娠率下降[23-24]。在卵巢發(fā)育周期過(guò)程中,顆粒細(xì)胞線粒體的功能正常對(duì)卵母細(xì)胞的成熟、質(zhì)量提高及女性生育能力的維持至關(guān)重要[25-26]。另有研究發(fā)現(xiàn),在控制性超排卵過(guò)程中,卵丘線粒體膜電位與獲卵數(shù)和MII數(shù)呈正相關(guān),cCGs中mtDNA拷貝數(shù)可作為胚胎著床潛能的生物標(biāo)志物[26]。改善顆粒細(xì)胞線粒體功能可以有效提高卵母細(xì)胞活性及IVF-ET成功率[27]。所以,顆粒細(xì)胞能量代謝穩(wěn)定對(duì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量、胚胎的發(fā)育潛能、妊娠率等都有重要影響[28]。

3 低氧促進(jìn)顆粒細(xì)胞能量代謝模式轉(zhuǎn)換

低氧是機(jī)體在能量代謝、血管生成、細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡等過(guò)程中遇到的一種生理應(yīng)激。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)被認(rèn)為是在細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程中起核心作用的轉(zhuǎn)錄因子,機(jī)體在缺氧的情況下激活轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)低氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,并參與低氧反應(yīng)信號(hào)的傳遞過(guò)程[29]。HIF-1由120 kD的HIF-1α亞單位和91-94 kD的HIF-1β亞單位組成。HIF-1α主要表達(dá)于細(xì)胞核中,在常氧條件下可迅速降解,HIF-1β亞基穩(wěn)定表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,不受外界環(huán)境影響[30]。在低氧條件下,羥基化作用被抑制,HIF-1α不斷積累,與穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1β亞基形成異源二聚體HIF-1,并與其靶基因如糖酵解基因和血管形成基因上的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合,通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能[31-32],參與細(xì)胞代謝、自分泌、氧穩(wěn)態(tài)、能量維持及增生等活動(dòng),從而調(diào)解機(jī)體炎癥、發(fā)育、腫瘤發(fā)生、缺氧適應(yīng)等生理和病理過(guò)程。目前已知HIF-1可以和超過(guò)70種基因的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合,調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白,調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄激活。研究較多的HIF-1的靶基因主要包括以下種類:① 血管生成相關(guān)基因,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和纖溶酶原激活物抑制劑1;② 控制細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的基因,如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子 1(glucose transporter-1,GLUT-1)、GLUT-3和糖酵解酶,乳酸脫氫酶 A(1actate dehedrogenase A,LDHA),磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFKP)等;③ 調(diào)節(jié)增殖的基因,如胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(insulin like growth factor-2,IGF-2)和p21等等,還有新的被調(diào)控的基因不斷被發(fā)現(xiàn)。另外,迄今為止,多種作用機(jī)制被描述為低氧條件下糖酵解的重要調(diào)節(jié)機(jī)制,包括HIF途徑[33]、PI3K/Akt途徑[34]和缺氧依賴性糖酵解酶的翻譯后修飾途徑[35]。通過(guò)對(duì)HIF通路的藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞水平上激活HIF途徑促進(jìn)了糖酵解活性,且對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用[36],進(jìn)一步證明HIF在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝中發(fā)揮顯著作用。因此,HIF對(duì)細(xì)胞能量代謝的穩(wěn)定作用是值得進(jìn)一步研究的領(lǐng)域。

缺氧條件下HIF-1α在哺乳動(dòng)物和人體細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)和聚集,參與細(xì)胞內(nèi)多種病理生理過(guò)程,包括細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化和細(xì)胞缺氧耐受、細(xì)胞內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生。卵泡的發(fā)育、生長(zhǎng)、排卵及隨后的黃體早期發(fā)育均將處于局部低氧或缺氧的條件下[37]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),HIF-1α在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育過(guò)程中會(huì)通過(guò)VEGF促進(jìn)血管的生成,間接提示卵泡發(fā)育過(guò)程中存在低氧過(guò)程,而且促性腺激素誘導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)度增殖促進(jìn)了HIF-1α的積累,HIF-1α又對(duì)顆粒細(xì)胞增殖具有保護(hù)作用[38]。Thompson JG等[39]報(bào)道,卵泡發(fā)育前的竇狀卵泡期氧濃度處于正常水平,當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育成熟時(shí),周?chē)ぜ?xì)胞層中血管的密度減少,氧濃度降低,激活促性腺激素、低氧誘導(dǎo)因子及血紅蛋白等信號(hào)因子。因此,在卵泡發(fā)育成熟期維持短暫的低氧環(huán)境。而且卵泡發(fā)育成熟后脫離卵泡壁導(dǎo)致脈管系統(tǒng)脫落,以及黃體形成時(shí)脈管系統(tǒng)的重塑都會(huì)降低氧濃度。

為了適應(yīng)低氧環(huán)境,細(xì)胞內(nèi)代謝方式亦發(fā)生變化,從氧化代謝向糖酵解代謝模式轉(zhuǎn)換。糖酵解本質(zhì)上比氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生ATP效率低,因此,為了補(bǔ)償降低的效率,HIF-1α激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1和GLUT3的表達(dá),以增加糖酵解底物的傳遞,另一方面降低了線粒體對(duì)葡萄糖的氧化速率[40]。Shiratsuki S等[41]對(duì)誘導(dǎo)低氧環(huán)境體外培養(yǎng)牛顆粒細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn),低氧環(huán)境促進(jìn)HIF-1α基因的表達(dá)和HIF-1α蛋白累積增加,促進(jìn)顆粒細(xì)胞代謝模式從線粒體氧化磷酸化向糖酵解代謝模式轉(zhuǎn)換,這與低氧激活糖酵解活性、抑制線粒體氧化磷酸化有關(guān)。并且其研究發(fā)現(xiàn),低氧條件糖酵解活性增加有助于卵泡成熟過(guò)程中顆粒細(xì)胞增殖。這一過(guò)程對(duì)于高質(zhì)量的卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育也是必不可少的。另外,Kitagawa Y等[42]研究指出,低氧濃度通過(guò)降低過(guò)氧化氫的含量,減少DNA碎片來(lái)提高胚胎的活力,促進(jìn)胚胎發(fā)育。

卵泡的正常發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,良好的卵巢內(nèi)環(huán)境需要全身內(nèi)分泌系統(tǒng)和卵巢旁分泌系統(tǒng)共同參與維持。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),促性腺激素誘導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)度增殖促進(jìn)了HIF-1α的積累,HIF-1α又對(duì)顆粒細(xì)胞增殖具有保護(hù)作用[38]。然而,目前關(guān)于HIF-1α的表達(dá)對(duì)人顆粒細(xì)胞能量代謝方式的影響鮮有報(bào)道。研究人顆粒細(xì)胞代謝功能與HIF-1α的相關(guān)性,為更深入研究人卵巢局部調(diào)控機(jī)制對(duì)卵子質(zhì)量的影響不失為一個(gè)更直接、有效的方向。

4 展望

卵子質(zhì)量的降低與不孕患者輔助生殖不良結(jié)局之間有密切聯(lián)系。隨著對(duì)卵巢局部調(diào)控機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),顆粒細(xì)胞的功能紊亂,是導(dǎo)致卵子質(zhì)量下降的關(guān)鍵因素。顆粒細(xì)胞代謝穩(wěn)定對(duì)維持卵巢內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,促進(jìn)卵母細(xì)胞的后期發(fā)育及最后成熟起著至關(guān)重要的作用,對(duì)于改善不孕患者妊娠結(jié)局有重要意義。