聶峰杰，甘曉燕，張 麗，鞏 檑，劉 璇，楊文靜，宋玉霞

（1寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，銀川 750002；2寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750002）

0 引言

沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是豆科冬青屬植物，分布在中國(guó)北方荒漠地區(qū)抗寒抗旱能力極強(qiáng)的常綠闊葉灌木[1]。沙冬青天然種群分布區(qū)狹小，自然更新能力弱，天然種群分布范圍呈逐漸萎縮的趨勢(shì)[2-4]，已被列入第一批珍稀瀕危保護(hù)植物名錄[5]。沙冬青具有耐干旱、耐鹽堿、耐風(fēng)沙、耐低溫、耐高溫的特性，是優(yōu)良的天然抗逆基因資源庫，已有多個(gè)沙冬青耐逆基因研究取得了較大進(jìn)展，如轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF[6]，與抗逆相關(guān)的AmFAD2-1[7]，參與應(yīng)低溫和干旱脅迫Bet v 1基因等[8]。沙冬青枝葉具有活血、散瘀、止痛、祛風(fēng)濕的功效，對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、凍瘡等疾病治療效果顯著[9]，其豐富的生物堿類、黃酮及異黃酮類、有機(jī)酸等生物活性物質(zhì)，具有抗病毒、殺菌、降糖、抗腫瘤、殺蟲等作用[9-12]。沙冬青同時(shí)具有良好的景觀效應(yīng)，是干旱地區(qū)城市園林綠化首選材料。由于其獨(dú)特的研究應(yīng)用價(jià)值，沙冬青在生物科學(xué)研究、城市景觀設(shè)計(jì)、水土保持和改善環(huán)境等方面開展了大量的研究和應(yīng)用，對(duì)中國(guó)西部地區(qū)氣候、其他古地中海第三紀(jì)孑遺植物物種遷移以及荒漠區(qū)動(dòng)植物演替進(jìn)程的研究起重要的推動(dòng)作用。

近年來，沙冬青自然種群和天然分布面積受氣候變暖、地理變遷、人為破壞等因素影響急速減少，處于更加瀕危狀態(tài)。目前，為保護(hù)種質(zhì)資源，擴(kuò)大種群數(shù)量，加大資源開發(fā)利用沙冬青人工種植規(guī)模不斷擴(kuò)大。沙冬青葉部病害發(fā)生于春季葉片返青時(shí)期，發(fā)病率高，侵染速度快，防治不當(dāng)往往集中連片死亡，造成嚴(yán)重?fù)p失。由于沙冬青葉部病害鮮有報(bào)道，病原菌生物學(xué)特性和種類未知，本研究開展沙冬青葉部病害病原菌的分離和鑒定，田間開展藥劑防治研究，以期為沙冬青葉部病害防治提供理論基礎(chǔ)和有效的技術(shù)措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品及沙冬青2021 年在寧夏中寧縣轎子山林場(chǎng)沙冬青種質(zhì)資源圃采集沙冬青發(fā)病葉片，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌。采集中寧轎子山林場(chǎng)種質(zhì)資源圃沙冬青健康幼嫩枝條用于離體接種材料。

1.1.2 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉8 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂8 g，pH 7.4～7.6。PD培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

1.1.3 試劑和儀器Fungal DNA 提取試劑盒，Omega Bio-Tek 公司；DNA 純化回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×Det PCR MasterMix，天根生化科技（北京）有限公司；D2000 DNA Marker、2×GC Buffer II、dNTP、Taq酶、T4 DNA Ligase、pGEM(R)-TEasy載體，寶生物工程（大連）有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。BX53 熒 光 顯 微 鏡，日 本Olympus 公 司；Eppendore 5810R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendore 公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Therom公司；Applied Biosystems 2720 thermal cycler PCR 儀、Applied Biosystems 3730XL測(cè)序儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；君意JY04S-3C 凝膠成像系統(tǒng)及君意JY300C Power Supply電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.1.4 供試藥劑 波爾多液等銅制劑、福美鐵等殺菌劑、75%百菌清可濕性粉劑600 倍液，以清水做對(duì)照。噴孔直徑為0.8 mm的MATABI Super Green 16型背負(fù)式噴霧器。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌的分離與純化 采用組織分離法進(jìn)行病原真菌分離，單孢純化法進(jìn)行病原真菌純化[13]，25℃培養(yǎng)5～7 d，待菌落長(zhǎng)出后用5 mm 打孔器在菌落邊緣打孔，菌餅用于致病性接種，另取菌餅保存于15%甘油中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測(cè)定 采集一年生沙冬青幼嫩枝條，無菌水沖洗晾干，用滅菌脫脂棉包裹枝條基部，滴上無菌水保濕，選取枝條前端完全展開葉片，每片葉子正面接種1 個(gè)菌餅，設(shè)6 次重復(fù)。將消毒后的托盤鋪無菌濾紙，用無菌水浸濕，接種后的枝條斜置于托盤中，噴灑無菌水后用保鮮膜封住托盤，25℃黑暗培養(yǎng)，接種2、5 d后觀察葉片發(fā)病情況。以葉片產(chǎn)生病斑作為致病性評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)發(fā)病組織重新進(jìn)行病原菌分離純化，原接種菌株一致的純化菌株為致病菌株。

1.2.3 致病真菌形態(tài)學(xué)觀察 將純化后的致病菌株接種于PDA 平板上，25℃黑暗培養(yǎng)5 d 后測(cè)量菌落直徑，觀察并記錄菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地等[14]。采用玻片培養(yǎng)檢視法進(jìn)行觀察，待致病菌株產(chǎn)生分生孢子與附著胞時(shí)，顯微鏡觀測(cè)分生孢子形態(tài)、菌絲附著胞形態(tài)與產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。

1.2.4 致病真菌的分子生物學(xué)鑒定 參照Fungal DNA提取試劑盒說明書提取菌株基因組DNA，DNA濃度和純度用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，以濃度為50 ng/μL 的標(biāo)準(zhǔn)液備用。采用真菌ITS 序列通用引 物 ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG) 和 ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物由北京奧維森基因科技有限公司合成。

50 μL PCR 擴(kuò) 增 體 系：2×TsingKE MasterMix 25 μL、正反向引物(10 μm)各1 μL、50 ng/μL DNA 1 μL、ddH2O 22 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)30次；72℃保溫10 min。

取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR 產(chǎn)物純化后由北京奧維森基因科技有限公司測(cè)序，使用3730xl對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行收集。

1.2.5 沙冬青真菌病害的田間防治

（1）施藥方法。防治試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，重復(fù)3次，藥劑處理區(qū)和對(duì)照區(qū)面積均為30 m2，清水處理作對(duì)照。試驗(yàn)期為春季沙冬青返青長(zhǎng)出3～5 片新葉的發(fā)病初期。以清水均勻噴施空白為對(duì)照區(qū)，另劃定藥劑處理區(qū)，以低濃度噴霧處理完成后，洗凈噴霧器再進(jìn)行高濃度噴霧處理，于2021年3月25日、4月4日間隔10 d各噴藥1次，共噴2次。

（2）調(diào)查方法。第2次施藥14 d后調(diào)查病情指數(shù)，共調(diào)查3次。每小區(qū)調(diào)查10株，記錄病葉數(shù)和葉片發(fā)病指數(shù)。

（3）藥效計(jì)算方法。沙冬青葉斑病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[15]統(tǒng)計(jì)。0 級(jí)—無病斑，1 級(jí)—病斑面積占葉面積的10%以下，2級(jí)—病斑面積占葉面積的11%～30%，3 級(jí)—病斑面積占葉面積的31%～50%，4 級(jí)—病斑面積占葉面積的50%以上。藥效按式(1)～(2)計(jì)算。

式中，DI為病情指數(shù)，LN為病葉數(shù)，RE為相對(duì)極值，Ln為調(diào)查總?cè)~數(shù)，CE為防治效果，DICK為對(duì)照區(qū)病情指數(shù)，DIET為處理區(qū)病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌分離與致病性測(cè)定

對(duì)采集到的沙冬青病葉進(jìn)行病原菌分離純化，經(jīng)沙冬青嫩枝接種驗(yàn)證獲得1 株致病菌株SDQ。由SDQ 引起的沙冬青病害主要侵染葉部（圖1a、1b），造成葉部產(chǎn)生凸起斑點(diǎn)，斑點(diǎn)周圍葉片變黃干枯（圖1c、1d）。葉部凸起斑點(diǎn)在體式顯微鏡下觀察（圖1e、1f）呈不規(guī)則盤座狀，內(nèi)部密生分生孢子。將SDQ接種至沙冬青幼嫩枝條葉片上進(jìn)行致病性測(cè)定，接種2 d后接種點(diǎn)可見壞死斑點(diǎn)（圖1g），接種5 d后葉部病斑擴(kuò)大，表現(xiàn)與田間相似癥狀（圖1h）。

圖1 沙冬青葉部病害癥狀

2.2 病原菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征

SDQ 菌株在PDA 和高氏1 號(hào)培養(yǎng)基平板上正常生長(zhǎng)，28℃黑暗培養(yǎng)5 d 菌落直徑8 cm，絨毛狀、灰白色、致密氣生菌絲，背面呈灰黑色輪紋狀（圖2a、2b）。經(jīng)玻片黑暗保濕培養(yǎng)5 d 后菌絲直柔曲狀，有隔（圖2c、2d）；培養(yǎng)7 d 后產(chǎn)生深色分生孢子梗，以合軸式延伸，頂端單生褐色分生孢子（圖2e、2f）。

圖2 菌株SDQ的菌落和形態(tài)特征

2.3 病原真菌分子生物學(xué)鑒定

采用真菌ITS 序列通用引物，對(duì)菌株SDQ 進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖3），得到有效序列587 bp（圖4）。測(cè)序后對(duì)rDNA ITS序列在NCBI中進(jìn)行序列比對(duì)，下載相似性99%及以上序列，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，SDQ 與Alternaria alstroemeriaeCBS 118809 ITS region(NR_163 686.1)相似性為99.82%，與Alternaria eichhorniaeATCC 22255 ITS region(NR _111832.1)相似性為99.46% ；與Alternaria destruensATCC 204363(NR_13714 3.1)相似性達(dá)到100%。

圖3 SDQ ITS擴(kuò)增結(jié)果

圖4 沙冬青病原菌ITS序列

圖5 基于ITS序列構(gòu)建的沙冬青病原菌及相關(guān)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 沙冬青葉部病害的田間防治

沙冬青葉部病害田間藥劑防治試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，75%百菌清可濕性粉劑和波爾多液2000倍液對(duì)病害均有一定的防治效果，其中75%百菌清可濕性粉劑噴施2 次對(duì)沙冬青葉部病害的防治效果達(dá)到87%，波爾多液2000 倍液的防治效果為57.9%，75%百菌清可濕性粉劑的防治效果優(yōu)于波爾多液2000倍液。

表1 第2次施藥后7 d沙冬青葉部病害防治效果

3 結(jié)論

沙冬青具有獨(dú)特的研究應(yīng)用價(jià)值，在生物科學(xué)研究、城市景觀設(shè)計(jì)、水土保持和改善環(huán)境等方面對(duì)其開展了大量的研究和應(yīng)用，但對(duì)沙冬青的病害鮮有報(bào)道。寧夏轎子山林場(chǎng)建立的沙冬青種質(zhì)資源圃，春季返青時(shí)期葉部發(fā)生病害，流行性較強(qiáng)，發(fā)病速度快，易造成毀滅性危害。本研究從沙冬青葉部斑狀組織中分離病原菌，經(jīng)形態(tài)和ITS序列鑒定與A.destruensATCC 204363(NR_13714 3.1)相似性達(dá)到100%，初步確定為半知菌亞門絲孢綱絲孢目鏈格孢屬。

由于沙冬青葉部病害在葉部返青時(shí)期流行性較強(qiáng)，易造成毀滅性危害。作為首次報(bào)道的病害，本研究主要采用不同藥劑對(duì)沙冬青葉部病害進(jìn)行田間防治。沙冬青返青長(zhǎng)出3～5 片新葉時(shí)期，在發(fā)病初期連續(xù)噴藥2 次，間隔10 d，75%百菌清可濕性粉劑噴施2 次的田間防治效果優(yōu)于波爾多液2000 倍液，防治效果達(dá)到87%，可作為沙冬青葉部病害防治藥劑選擇使用。

4 討論

鏈格孢菌A. destruens作為植物病原菌僅在2019年首次報(bào)道在中國(guó)引起女貞葉斑病[16]，尚無其侵染其他植物的報(bào)道。作為夾竹桃科龍膽屬植物的內(nèi)生真菌[17]，A.destruens產(chǎn)生的α-葡萄糖苷酶抑制劑可作為抗菌和抗生物膜制劑。同時(shí)，A.destruens已注冊(cè)為控制菟絲子生物除草劑的有效成分之一[18]，可以與草甘膦、硫酸銨綜合治理菟絲子。鏈格孢屬中包括許多植物病原菌，如馬鈴薯早疫病病原菌A alternate[19-20]，引起胡蘿卜黑腐病的A radicina、A carotiincultae、A.atrocariis[21]等病原菌，引起紅棗黑斑病的A.alternate和A.tenuissima[22]。鏈格孢屬也是一些植物內(nèi)生真菌，如在月季上分離到A.alternate和A.tenuissima，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物細(xì)交鏈格孢菌酮酸在適合濃度對(duì)月季沒有傷害而對(duì)月季長(zhǎng)管蚜有趨避作用[23]。

A.destruens作為沙冬青葉部病害的病原真菌為首次報(bào)道，其致病機(jī)理尚不清楚，有必要進(jìn)一步開展生物學(xué)特性、生理生化特性等研究，系統(tǒng)研究病原菌致病機(jī)理，為病害的防治奠定理論基礎(chǔ)。