趙菲菲,李 杰,韓 寧,謝仕廷,曾振靈*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642;2.廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室,廣州 510642;3.國家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險評估實驗室,廣州 510642)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia) 屬腸桿菌科、克雷伯菌屬的革蘭陰性菌,兼性厭氧,無鞭毛,有較厚的莢膜,已成為僅次于大腸埃希菌的第二大條件致病菌[1]。近年來,由于飼養(yǎng)管理不規(guī)范、免疫抑制性疾病頻發(fā)、濫用抗生素、畜舍飼養(yǎng)密度不合理等,肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的耐藥性日益嚴(yán)重,不但呈現(xiàn)多重耐藥(multidrug resistant,MDR)現(xiàn)象,且分離率呈逐年上升趨勢[2-3],因而限制了細(xì)菌感染的治療選擇。同時,肺炎克雷伯菌可致使豬、牛、羊、雞、水貂、狐貍等動物及人發(fā)病,臨床上通常表現(xiàn)為腦膜炎、肺炎、敗血癥、支氣管炎等多種病癥,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。

1875年,Edwin Klebs首次在一例肺炎患者的氣道分泌物中分離得到肺炎克雷伯菌;1882年,肺炎克雷伯菌由德國微生物學(xué)家和病理學(xué)家Carl Friedlander首次報道,因此該細(xì)菌一度被稱為Friedl?nder菌[7];1989年和1990年夏秋季,C型肺炎克雷伯氏桿菌病在福建省福州地區(qū)部分豬場暴發(fā)[8];高倞[9]對河南駐馬店地區(qū)患呼吸道疾病豬肺、鼻拭子等74份樣本中分離得到43株肺炎克雷伯菌,研究發(fā)現(xiàn)菌株對氨芐西林、阿莫西林、大觀霉素等7種藥物耐藥性較高,耐藥率均在51.2%以上,且呈現(xiàn)多重耐藥性。歐冠標(biāo)等[10]對廣西南寧地區(qū)采集存欄生豬肛拭子樣品125份及宰后生豬肉類樣品50份,分別分離得到32及4株肺炎克雷伯菌,發(fā)現(xiàn)其對四環(huán)素、氯霉素耐藥性最高。譚耀榮等[11]從發(fā)病母豬組織中分離得到一株肺炎克雷伯菌,菌株接種在血瓊脂培養(yǎng)基上會發(fā)生α溶血現(xiàn)象,且具有多重耐藥性,能夠使小鼠在22 h內(nèi)死亡,表明其具有嚴(yán)重的耐藥性和強(qiáng)致病性。

為了解豬源肺炎克雷伯菌的耐藥情況,本試驗2021年3月從廣州市白云區(qū)某屠宰場采集豬肺樣本150份,通過對菌株的形態(tài)學(xué)觀察、khe基因PCR檢測,篩選并鑒定出116株肺炎克雷伯菌。通過對116株肺炎克雷伯菌血清型、耐藥性、耐藥基因和毒力基因進(jìn)行檢測,為豬源肺炎克雷伯菌的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 本試驗在2021年3月于廣州市白云區(qū)某屠宰場(豬來源于廣東省、湖南省和江西省)采集豬肺樣本150份,質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922由本藥理教研室保存。

1.1.2 主要試劑 LB營養(yǎng)肉湯、麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林均購于海博生物技術(shù)有限公司,MH瓊脂購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,引物、DNA Marker均購于擎科生物技術(shù)有限公司,2×PCR Mix購于東盛生物科技有限公司,核酸染料購于廣州藍(lán)澤生物科技有限公司,革蘭染色液購于北京索萊寶科技有限公司,瓊脂糖購于西班牙Biowest公司,氨芐西林(含量96.0%)、美羅培南(含量98.0%)、四環(huán)素(含量95.0%)等均購于大連美倫生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 渦旋儀購于杭州海沛儀器有限公司,恒溫?fù)u床購于上海智城分析儀器制造有限公司,PCR儀購于蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司,核酸電泳儀購于上海天能科技有限公司,數(shù)控恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)等均購于賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與純化 無菌操作取豬肺樣本置于LB營養(yǎng)肉湯中,恒溫37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)12～16 h用于增菌,再將菌液劃線接種于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂培養(yǎng)基,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)18 h后挑取呈粉色、菌落濕潤、黏液樣、拉動呈絲狀的疑似菌落轉(zhuǎn)接于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行純化,最后挑取純化后的單菌落于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂中進(jìn)行增菌培養(yǎng),刮取菌苔于30%甘油肉湯中,-20 ℃保存,備用。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 一般通過革蘭染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及鑒別菌株。取擦拭干凈的載玻片,滴加一滴生理鹽水,取純培養(yǎng)在麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂培養(yǎng)基中的單菌落涂布在載玻片中,烤片固定,經(jīng)結(jié)晶紫初染(1 min,水洗)、碘液媒染(1 min,水洗)、95%乙醇脫色(20 s,水洗)、番紅液復(fù)染(2 min,水洗)后,鏡檢觀察菌株形態(tài)。

1.2.3 樣品DNA提取 利用煮沸法[12]提取細(xì)菌DNA模板。取增菌培養(yǎng)的菌液50 μL復(fù)蘇后,置于103 ℃恒溫金屬浴中加熱15 min,轉(zhuǎn)放-20 ℃冰箱中冰浴15 min,高速冷凍離心機(jī)中12 000 r·min-1離心2 min,吸取上清液,即為DNA模板,-20 ℃保存,備用。

1.2.4 細(xì)菌PCR鑒定 參照參考文獻(xiàn)[13]報道的特異性引物(表1),以提取的樣品DNA模板進(jìn)行khe基因擴(kuò)增,預(yù)擴(kuò)增片段大小為428 bp。PCR擴(kuò)增體系(總體積為20 μL):2×PCR Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環(huán);72 ℃再延伸5 min,4 ℃保存。擴(kuò)增后反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測,將陽性產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 細(xì)菌分離鑒定及血清型分型引物Table 1 Primers for bacterial isolation, identification and serotype identification in this study

1.2.5 血清型分型 根據(jù)文獻(xiàn)[14]設(shè)計合成引物,采用PCR方法擴(kuò)增6種常見的莢膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54、K57),引物序列見表1。PCR擴(kuò)增程序:98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性15 s,Tm退火15 s,72 ℃延伸20 s,共30個循環(huán);72 ℃再延伸5 min,8 ℃保存。擴(kuò)增后反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測,將陽性產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序,結(jié)果提交 NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對。

1.2.6 藥敏試驗 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn),以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌,利用瓊脂擴(kuò)散法檢測13種抗菌藥物對肺炎克雷伯菌分離株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)[15]。檢測的抗菌藥物:氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、美羅培南、黏菌素、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、多西環(huán)素、替加環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、復(fù)方新諾明。

1.2.7 耐藥基因的檢測 根據(jù)文獻(xiàn)[16-19]設(shè)計合成引物,對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)(blaCTX-M1)、碳青霉烯類耐藥基因(blaKPC-2、blaNDM-1、blaNDM-5)、四環(huán)素類耐藥基因(tetA、tetB)、磺胺類耐藥基因(sul1、sul2)、喹諾酮類耐藥基因(oqxA、qnrB、aac(6′)-Ib-cr)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增引物序列見表2。

表2 肺炎克雷伯菌耐藥相關(guān)基因的PCR引物Table 2 PCR primers for drug-resistant genes of Klebsiella pneumoniae

1.2.8 毒力基因的檢測 根據(jù)文獻(xiàn)[16,20-22]設(shè)計合成引物,利用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測8種常見的毒力基因,包括莢膜多糖生成調(diào)節(jié)基因(rmpA),鐵載體基因(entB、iucA、iroN),菌毛定植黏附基因(ycfM、fimH、mrkD),脂多糖形成相關(guān)基因(wabG),PCR擴(kuò)增引物序列見表3。

表3 肺炎克雷伯菌毒力相關(guān)基因的PCR引物Table 3 PCR primers for virulence genes of Klebsiella pneumoniae

2 結(jié) 果

2.1 肺炎克雷伯菌分離及鑒定結(jié)果

無菌狀態(tài)下將分離株劃線培養(yǎng)于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林平板,可見紅色、較大且黏稠的菌落,用接種環(huán)挑取時有拉絲的現(xiàn)象。革蘭染色鏡檢菌體呈現(xiàn)紅色短桿狀,單個排列,偶見兩個鏈狀排列,符合肺炎克雷伯菌的形態(tài)特征(圖1A);樣本通過DNA提取及PCR鑒定,116個樣品擴(kuò)增出大小約428 bp的特異性條帶,分離率為77.3%,測序結(jié)果經(jīng)過比對分析,確定分離株為肺炎克雷伯菌(圖1B),其中,共84株檢出常見的血清型,以K57型(59株,50.9%)為主,其次為K5型(20株,17.2%)和K2型(4株,3.5%),未檢出K1、K20和K54型(圖1C)。

A.革蘭染色鏡檢結(jié)果(100×);B.部分分離菌株khe基因鑒定結(jié)果(M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～7.分離菌株);C.常見血清型鑒定結(jié)果A. The results of Gram stain microscopy (100×); B. The results of khe gene identification in some isolates(M.DNA marker; 1-7. Isolates);C. The results of common serotype identification圖1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Fig.1 The results of bacterial isolation and identification

2.2 藥敏試驗

通過瓊脂擴(kuò)散法,對116株肺炎克雷伯菌進(jìn)行13種抗菌藥物的MIC檢測。結(jié)果顯示,116株肺炎克雷伯菌分離株對四環(huán)素、多西環(huán)素、氨芐西林及復(fù)方新諾明的耐藥率較高,分別為96.6%、95.7%、95.7%及94.0%;其次是慶大霉素和環(huán)丙沙星,耐藥率均為25.0%;對頭孢噻肟、替加環(huán)素、頭孢他啶和阿米卡星的耐藥率較低,分別為4.3%、2.6%、1.7%和1.7%;對美羅培南、黏菌素和恩諾沙星均敏感(見圖2)。藥物敏感性試驗結(jié)果表明分離株多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重,其中耐4種抗生素的菌株最多,占比59.5%,且僅有一株菌表現(xiàn)為對所有檢測藥物敏感(表4)。

圖2 肺炎克雷伯菌藥敏試驗結(jié)果Fig.2 The results of Klebsiella pneumoniae drug sensitivity test

表4 分離株多重耐藥攜帶率分析結(jié)果Table 4 The results of multidrug resistance carrying rate analysis of isolates

2.3 耐藥基因檢測

本研究對116株肺炎克雷伯菌進(jìn)行了常見的11個耐藥基因的檢測,結(jié)果顯示,磺胺類耐藥基因sul2的檢出率為60.3%(70/116),碳青霉烯酶基因blaNDM-1和blaNDM-5的檢出率均為0.9%(1/116),與藥敏結(jié)果中復(fù)方新諾明的高耐藥率以及美羅培南高敏感一致;喹諾酮類耐藥基因oqxA的檢出率為59.5%(69/116)(圖3)。

圖3 耐藥基因檢測結(jié)果Fig.3 The result of drug resistance genes

2.4 毒力基因檢測結(jié)果

116株肺炎克雷伯菌中8種毒力基因檢出率:莢膜多糖生成調(diào)節(jié)基因rmpA的檢出率為7.8%,鐵載體基因entB、iucA、iroN的檢出率分別為78.4%、61.2%及1.7%,菌毛定值與黏附基因ycfM、fimH、mrkD的檢出率分別為87.1%、35.3%及62.9%,脂多糖形成相關(guān)基因wabG的檢出率為56.0%(圖4)。

圖4 毒力基因檢測結(jié)果Fig.4 The result of virulence genes

3 討 論

近年來,隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展,由感染肺炎克雷伯菌而引發(fā)臨床動物發(fā)病的報道也越來越多,給養(yǎng)殖企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[23]。由于肺炎克雷伯菌的感染與呼吸道疾病相關(guān)[24],因此本試驗以豬肺為采集對象,共分離到116株肺炎克雷伯菌,分離率(77.3%)較高。血清型檢測發(fā)現(xiàn),其中84株(72.4%)為常見血清型,有32株(27.6%)為未分型菌株,表明存在其他血清分型,需進(jìn)一步鑒定。根據(jù)毒力特點肺炎克雷伯菌可分為經(jīng)典型和高毒力型。因此,本研究通過PEG-344基因[25]鑒定高毒力肺炎克雷伯菌,然而在116株臨床分離株中無高毒力型肺炎克雷伯菌(結(jié)果未顯示)。這表明該屠宰場雖然肺炎克雷伯菌的分離率偏高,但分離株致病性弱。

肺炎克雷伯菌感染機(jī)體的過程與其存在的毒力基因相關(guān),如鐵載體、菌毛、莢膜、脂多糖等。因此本試驗通過PCR對116株分離株進(jìn)行8個毒力基因檢測,毒力基因檢測結(jié)果顯示,菌毛定值與黏附基因ycfM檢出率最高(87.1%),其次是鐵載體基因entB(78.4%),這與Farzana等[26]報道的1株致新生兒極高病死率的高毒力多重耐藥天花克雷伯菌類似,鐵攝取系統(tǒng)、菌毛等典型毒力因子檢出率都較高。此外,翟祎夢等[27]研究表明,鐵攝取對細(xì)菌毒力至關(guān)重要,ent基因?qū)Υ龠M(jìn)細(xì)菌生長和提高其在特定條件的競爭優(yōu)勢具有重要作用。

近年來,由于大量使用抗生素,肺炎克雷伯菌會產(chǎn)生抗生素水解酶,耐藥菌株不斷出現(xiàn),導(dǎo)致使用抗生素防治肺炎的難度逐漸加大[28]。通過藥敏結(jié)果發(fā)現(xiàn),116株肺炎克雷伯菌對四環(huán)素、多西環(huán)素、氨芐西林、復(fù)方新諾明耐藥率較高,耐藥率均在90%以上,與此4種抗菌藥物大量用于豬的疾病防治密切相關(guān);對美羅培南、黏菌素和恩諾沙星均敏感;對其他藥物耐藥率為1.7%～25.0%。董瑞和孫曉[29]對滄州地區(qū)養(yǎng)豬場中分離出的肺炎克雷伯菌耐藥性進(jìn)行研究時,發(fā)現(xiàn)對氨芐西林、多西環(huán)素和磺胺類藥物的耐藥率均超過90%;劉海林[30]研究表明,從河南新鄉(xiāng)分離的肺炎克雷伯菌對一代頭孢類、磺胺類藥物和四環(huán)素耐藥性較強(qiáng),均與本研究結(jié)果一致。從分離菌株的多重耐藥結(jié)果來看,耐4種抗生素的分離菌株最多,占分離菌的59.5%,與林星宇等[31]報道的結(jié)果一致。

鑒于豬場耐藥情況嚴(yán)重,為了解肺炎克雷伯菌分離株耐藥基因攜帶情況,本試驗共測定ESBLs、碳青霉烯類、四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類5大類耐藥基因,其中,磺胺類耐藥基因檢出率最高,sul2檢出率為60.3%,oqxA為59.5%。有趣的是,喹諾酮類耐藥基因的高檢出率和低耐藥率表現(xiàn)不一致,可能是這些耐藥基因在菌體內(nèi)未表達(dá)。此現(xiàn)象與尹澤東等[32]報道的大腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因檢出率與耐藥相關(guān)性的研究一致。

綜上所述,目前肺炎克雷伯菌在豬場中有一定的流行趨勢,并且出現(xiàn)不同程度的耐藥現(xiàn)象。尤其是對四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類以及磺胺類抗生素耐藥嚴(yán)重,且呈多重耐藥現(xiàn)象。因此建議在生產(chǎn)實踐中要合理使用抗生素,選用敏感藥物如恩諾沙星、黏菌素,避免耐藥性的產(chǎn)生。同時應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,創(chuàng)造良好的養(yǎng)殖環(huán)境,提高動物機(jī)體免疫力,完善飼養(yǎng)程序,提高經(jīng)濟(jì)效益。

4 結(jié) 論

通過對廣東省廣州市某屠宰場豬源肺炎克雷伯菌進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)來自廣東省、湖南省、江西省的養(yǎng)殖場中肺炎克雷伯菌感染較為嚴(yán)重。定期對養(yǎng)殖場開展致病性肺炎克雷伯菌的檢測和耐藥性檢測,有助于減少疾病的發(fā)生,并為豬源肺炎克雷伯菌感染的防控提供參考依據(jù)。