吳小燕, 鮑紅春, 李小雷, 于海濱, 王海霞, 于傳宗, 龐 杰, 王 鋒

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 呼和浩特 010000; 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心, 呼和浩特 010000;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院, 呼和浩特 010000;4.鄂爾多斯市東勝區(qū)罕臺(tái)鎮(zhèn)社會(huì)治理綜合服務(wù)中心, 內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

香菇[Lentinulaedodes(Berk.) Pegler]隸屬于真菌界、擔(dān)子菌門(mén)、傘菌綱、傘菌目、口蘑科、小香菇屬[1]。在我國(guó)南北方有不同的俗稱(chēng),北方多稱(chēng)為香菇,南方又稱(chēng)為香蕈、香信、冬菇、花菇等。香菇是一種傳統(tǒng)食、藥用菌,我國(guó)栽培時(shí)間久,現(xiàn)已成為我國(guó)栽培面積最大的食用菌之一,因其富含人體所需的膳食纖維、蛋白質(zhì)、氧化酶和維生素等成分,具有很高的經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。另外,香菇中的香菇嘌呤、不飽和脂肪酸、維生素D原等藥用價(jià)值高,長(zhǎng)期食用能夠增強(qiáng)人體免疫功能、預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤、抗衰老,降低血脂[2]。目前香菇在實(shí)際生產(chǎn)中,品種是影響產(chǎn)量及品質(zhì)的重要因素。近年來(lái),雖然我國(guó)香菇育種工作發(fā)展迅速,培育出了一批質(zhì)優(yōu)、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良品種,但地域小氣候會(huì)對(duì)香菇生長(zhǎng)產(chǎn)生很大影響,現(xiàn)有優(yōu)良品種不能完全滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。內(nèi)蒙古自治區(qū)香菇產(chǎn)業(yè)雖然栽培品種多,但大多數(shù)菌種都是從區(qū)外引進(jìn),真正具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán),可用于大規(guī)模推廣的優(yōu)良品種甚少。生產(chǎn)用菌種普遍退化、老化,綜合性狀差,生產(chǎn)效率低;菌種混雜、種源混亂不清問(wèn)題嚴(yán)重。目前,內(nèi)蒙古自治區(qū)西部地區(qū)栽培的主要菌株仍是808和9608,優(yōu)良品種單一、出菇期相對(duì)集中,生產(chǎn)效益欠佳,優(yōu)良菌株的篩選、鑒定及新品種選育工作迫在眉睫。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat,ISSR)分子標(biāo)記是在Zitkiewicz等[3]的基礎(chǔ)上通過(guò)使用3′或5′錨定引物發(fā)展的一項(xiàng)技術(shù)。ISSR技術(shù)穩(wěn)定、可重復(fù)、符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律、多為顯性標(biāo)記、比其他分子標(biāo)記更實(shí)惠、更有效,而且無(wú)須知道被測(cè)生物體的基因組序列。近年來(lái),廣泛用于香菇的遺傳多樣性分析、品種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、連鎖圖譜的構(gòu)建等研究[4],陳小敏等[5]通過(guò)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)四川省收集的菌株進(jìn)行聚類(lèi)分析,說(shuō)明四川省野生香菇資源遺傳多樣性豐富。宋瑩等[6]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了遼寧省主栽的20個(gè)香菇菌株的遺傳差異性,為遼寧省香菇遺傳育種工作奠定了基礎(chǔ)。使用ISSR技術(shù)明確保存的香菇種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系。本研究以區(qū)內(nèi)外收集的26個(gè)香菇菌株為試驗(yàn)材料,對(duì)26個(gè)香菇菌株進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記分析,了解它們的親緣關(guān)系,為今后的香菇雜交育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

26個(gè)供試菌株來(lái)自全國(guó)不同育種機(jī)構(gòu),現(xiàn)保存于內(nèi)蒙古自治區(qū)園藝研究院,其編號(hào)與來(lái)源見(jiàn)表1。

1.2 研究方法

1.2.1菌種活化

將實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存的香菇菌株取出,將各菌株的菌絲體在25 ℃條件下,置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)7～10 d,收集菌絲[5-7]。

1.2.2DNA提取與檢驗(yàn)

采用真菌基因組提取試劑盒(Biospin)從26份香菇菌絲中提取基因組DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度和濃度,將基因組DNA稀釋至100 ng/μL,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3ISSR分子標(biāo)記引物

試驗(yàn)所用引物來(lái)自參考文獻(xiàn)[8],由上海生工生物工程公司合成。引物具體信息如表2。

表2 ISSR引物產(chǎn)品信息Table 2 ISSR primer product information

1.2.4ISSR-PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增體系(25 μL):稀釋后的ISSR引物和DNA模板各1 μL、12.5 μLTaqPCR Master Mix,剩余部分用ddH2O補(bǔ)齊。

擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,48 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.5引物篩選

以菌株阜平XG-31和XG 168的DNA為模板,24對(duì)ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增后選擇譜帶清晰且間距均勻,多態(tài)性強(qiáng)的引物。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

讀取擴(kuò)增電泳圖數(shù)據(jù),同一遷移位點(diǎn)上清晰條帶記為“1”,無(wú)帶記為“0”,建立“0-1”矩陣[9-10]。使用PopGen 32軟件計(jì)算所有材料的等位基因數(shù)(Observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne)、基因多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity,H)、Shannon信息指數(shù)(Shannon’s Information,I)。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件NTSYS-pc 2.10 e構(gòu)建UPGMA聚類(lèi)圖譜,計(jì)算Nei’s 遺傳距離(Nei’s genetic distance,D)[11-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

DNA電泳檢測(cè)結(jié)果(圖1)表明,各材料均出現(xiàn)了1條清晰、無(wú)拖尾的DNA條帶,這說(shuō)明用試劑盒提取的DNA純度高,完整性好,無(wú)降解現(xiàn)象,能夠滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 26個(gè)香菇材料基因組DNA純度檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Genomic DNA purity test results of 26 Lentinula edodes materials

2.2 ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果

篩選出的10條引物在26個(gè)香菇菌株中共擴(kuò)增出67條多態(tài)性片段(圖2、圖3),多態(tài)性比率為95.71%(表3)。每個(gè)引物擴(kuò)增條帶范圍5～12條,平均每個(gè)引物7條。其中引物P 3和P 5分別擴(kuò)增9條和12條條帶,是擴(kuò)增條帶最多且多態(tài)性達(dá)到100%的引物;引物P 12和P 17擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶最少,只有4條,多態(tài)性為80%。綜合表明,26個(gè)香菇菌株具有豐富的遺傳多樣性。

圖2 引物P 1對(duì)部分香菇菌株擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Primer P 1 amplification results of partial Lentinula edodes materials

圖3 引物P 17對(duì)部分香菇菌株擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Primer P 17 amplification results of partial Lentinula edodes strains

表3 26份供試香菇材料的ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果Table 3 ISSR primer amplification results of 26 test Lentinula edodes materials

2.3 遺傳多樣性分析

26個(gè)供試菌株的有效等位基因數(shù)變幅介于1.630 6～1.958 0之間,均值為1.807 2,基因多樣性指數(shù)變幅介于0.387 9～0.489 3之間,均值為0.445 0,Shannon信息指數(shù)變幅介于0.576 4～0.682 4之間,均值為0.630 8(表4)。

表4 26份供試香菇材料的遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity analysis of 26 test Lentinula edodes materials

26個(gè)供試菌株的遺傳距離變幅介于0～0.749 9之間(表5),各材料間的遺傳差異較大。

表5 26份供試香菇材料的遺傳距離矩陣Table 5 Genetic distance matrix of 26 test Lentinula edodes materials

2.4 ISSR聚類(lèi)分析

聚類(lèi)分析圖結(jié)果(圖4)表明,26個(gè)菌株間的遺傳相似水平變化范圍在0.51～0.99之間,總體相似性為51%,相似系數(shù)越小,親緣關(guān)系越遠(yuǎn),遺傳多樣性越明顯。遺傳相似系數(shù)小于0.51時(shí),所有的供試菌株聚為一類(lèi)。其中,XG-Y和阜平香菇0912;HXG-8 L 1和慶元香菇;遵化香菇168和平泉香菇168之間的遺傳相似系數(shù)最大,表明遺傳相似程度最高,遺傳距離最近,遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.99。在遺傳相似系數(shù)為0.678時(shí)將供試菌株分成4個(gè)類(lèi)群,第一類(lèi)群包括XG 168、MXG-4、XG-12、JXG-238、林西香菇、XG-Y、阜平香菇0912、MXG-1669、河南雨花、WYXG-215、冬香4號(hào)、冬香5號(hào)、香菇808、臺(tái)灣香菇60、HXG-8 L 1、慶元香菇、X-0912、MXG-148 abc、LXXG-1611、遵化香菇-808、平泉香菇-168、遵化香菇-168、阜平XG-31;第二類(lèi)群由沁陽(yáng)雨花組成;第三類(lèi)群由靈仙香菇組成;第四類(lèi)群由寶林2號(hào)組成。沁陽(yáng)雨花、靈仙香菇、寶林2號(hào)與其他香菇菌株間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 26份香菇材料的ISSR遺傳關(guān)系聚類(lèi)分析Fig.4 ISSR genetic relationship cluster plot of 26 Lentinula edodes materials

3 討論與結(jié)論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于香菇菌株的鑒定,為分子水平上識(shí)別鑒定菌株提供了技術(shù)支持。肖東來(lái)等[14]利用ISSR技術(shù)對(duì)17個(gè)栽培菌株和3個(gè)野生菌株進(jìn)行遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn),多態(tài)性條帶占90.82%。郭金英等[15]用6個(gè)引物對(duì)40個(gè)香菇菌株進(jìn)行擴(kuò)增,平均每條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)在10～15條之間。本試驗(yàn)用10對(duì)引物對(duì)26個(gè)菌株進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)引物擴(kuò)增條帶5～12條,參試菌株多態(tài)性條帶占比為95.71%,這與肖東來(lái)等[14]、郭金英等[15]的研究結(jié)果一致,表明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)使用較少引物可獲得的多態(tài)性條帶較多。供試菌株遺傳距離變幅介于0～0.749 9之間,名稱(chēng)相似或來(lái)自同一地區(qū)栽培的品種大多數(shù)會(huì)聚為一類(lèi),親緣關(guān)系較近。

在遺傳相似系數(shù)為0.99時(shí),XG-Y和阜平香菇0912、HXG-8 L 1和慶元香菇、遵化香菇168和平泉香菇168親緣關(guān)系最近,在遺傳相似系數(shù)為0.678時(shí)將供試菌株分成4個(gè)類(lèi)群,沁陽(yáng)雨花、靈仙香菇、寶林2號(hào)各自為一個(gè)類(lèi)群,與其他香菇菌株遺傳差異較大,可作為香菇品種選育的基礎(chǔ)材料。但其他23個(gè)菌株間遺傳相似系數(shù)高,說(shuō)明供試菌株遺傳背景較單一。在今后的育種工作中,需收集更多優(yōu)質(zhì)菌株,拓寬遺傳基礎(chǔ),通過(guò)育種材料合理配置,為香菇主栽品種的遺傳改良和培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良菌株奠定基礎(chǔ)。