成衍男 潘振宇

糖皮質(zhì)激素(GCs)在臨床上使用十分廣泛,由此誘發(fā)的激素性股骨頭壞死(GA-ONFH)的發(fā)病率逐年上升,發(fā)病年齡亦日趨年輕。國內(nèi)每年報告新發(fā)病例在100～200萬[1]。多數(shù)病人罹患后會在2～3年內(nèi)股骨頭塌陷,隨后髖關(guān)節(jié)發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎。大部分病人最終只能選擇關(guān)節(jié)置換。GCs引起 GA-ONFH的發(fā)病機制可能與骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成脂/成骨分化異常、氧化應激、細胞凋亡與自噬、炎癥和免疫、外泌體調(diào)控、及非編碼RNA的異常表達等因素相關(guān)。本文主要圍繞GA-ONFH致病機制進行綜述。

一、BMSCs成脂/成骨失衡

BMSCs是一種具有自我更新和多能分化潛力的細胞,它們能夠分化為多種不同類型的細胞,包括成骨細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞等。長期大劑量使用糖皮質(zhì)激素可能會破壞BMSCs成骨和成脂分化的平衡,影響骨修復能力,增加髓內(nèi)脂肪的堆積。有研究說明,從皮質(zhì)醇誘導的股骨頭壞死病人體內(nèi)提取的BMSCs的細胞增殖能力及成骨分化能力顯著下降。體外皮質(zhì)類固醇誘導的BMSCs中脂肪細胞數(shù)量增加,脂肪特異性基因表達增強,但成骨基因表達降低[2]。GCs通過糖皮質(zhì)激素受體(GR),激活Wnt/β-catenin、TGF-β/BMP、Notch等信號通路調(diào)控BMSCs成脂或成骨分化[3]。此外,GCs可以正向或負向調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子(Runx2、PPARγ、C/EBP、TAZ)。有研究發(fā)現(xiàn),GCs上調(diào)BMSCs中C/EBPα的表達促進成脂分化是通過抑制組蛋白去乙?；?(HDAC3)來實現(xiàn)的[4]。HDAC3表達降低激活了BMSCs中啟動子區(qū)域中PPARγ的組蛋白H27K1乙?；?這一過程最終導致BMSCs成脂分化增強。

二、氧化應激及活性氧機制

GCs在正常生理水平下對于發(fā)育、代謝、成骨細胞分化和骨形成至關(guān)重要。過量GCs導致活性氧自由基(ROS)積累,產(chǎn)生氧化應激來影響骨代謝相關(guān)細胞(骨細胞、成骨細胞、BMSCs、破骨細胞)及血管內(nèi)皮細胞的功能,最終引起骨組織內(nèi)環(huán)境失衡,細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和線粒體功能損傷。皮質(zhì)類固醇誘導的股骨頭壞死模型的早期就可以發(fā)現(xiàn)氧化應激。有研究表明,GA-ONFH病人氧化應激和(或)抗氧化標志物在體內(nèi)異常表達[5]。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)作為主要應激反應轉(zhuǎn)錄因子在氧化還原穩(wěn)態(tài)中起核心作用,keap1/Nrf2通路失衡是GA-ONFH發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。大量研究表明,GCs耗竭單?；视椭久?MAGL),抑制抗氧化通路keap1/Nrf2的激活,造成BMSCs中ROS過載,發(fā)生氧化損傷和細胞凋亡[6]。GCs可以下調(diào)編碼抗氧化酶相關(guān)基因(NAD(P)H、HO-1)和抗氧化酶(γ-GCS、SOD1)在股骨頭內(nèi)的表達,引起微環(huán)境氧化應激,產(chǎn)生大量的ROS,激活破骨細胞活性,RANKL、組織蛋白酶K表達增加,激活或募集更多破骨細胞,造成骨量減少、骨質(zhì)流失,最終導致GA-ONFH的發(fā)生[7]。

三、個人易感性和遺傳

個體易感性和遺傳因素在GA-ONFH中發(fā)揮了某種程度的作用。大量的研究表明,PAI-1、ABCB1、IL1B、MMP2、MMP10和CYP450等基因的多態(tài)性和GA-ONFH密切相關(guān)。一項病例對照研究結(jié)果顯示,PAI-4基因的5 G/1 G多態(tài)性是GA-ONFH的危險因素[8]。還有研究發(fā)現(xiàn),IL1B rs1143630降低了GA-ONFH的風險,IL1B rs2853550增加了類固醇誘導的GA-ONFH的風險[9]。類似研究證實了與ABCB1(C3435T)的TT和TC基因型相比,CC基因型與骨壞死風險增加有關(guān),ABCB1 3435T等位基因降低了GCs誘導的ONFH風險[10]。中國人群中MMP-2rs2241146和rs11646643與單側(cè)GA-ONFH存在患病風險,而MMP-10中rs470154則使得患雙側(cè)類固醇誘導股骨頭壞死的風險增加[11]。

四、細胞凋亡和自噬

GCs導致細胞發(fā)生凋亡是GA-ONFH的主要特征之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡在許多疾病中都被觀察到,而GCs治療會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激并引起各種變化,包括成骨細胞、骨細胞和內(nèi)皮細胞的功能障礙和凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制抗凋亡蛋白BCL-2的表達,導致線粒體中BAX含量增加,從而啟動Caspase9/Caspase3信號通路,最終觸發(fā)細胞凋亡。過量活性氧(ROS)的細胞內(nèi)積累導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激增加,線粒體DNA(mtDNA)損傷,線粒體功能障礙,也能激活BCL-2 / BAX細胞凋亡途徑。大量研究表明,GCs通過抑制PI3K / AKT 通路誘導成骨細胞細胞凋亡和線粒體損傷[12]。

自噬是真核細胞中的溶酶體通過降解細胞中受損的細胞器和蛋白質(zhì)為細胞提供營養(yǎng)的過程。但過度的自噬也會破壞細胞成分。在骨重塑中,成骨細胞和破骨細胞對GA-ONFH有重大意義。自噬所需要的蛋白質(zhì)(Atg4B和LC3)對破骨細胞的分泌功能和體內(nèi)、體外骨吸收非常重要。自噬發(fā)生的關(guān)鍵蛋白FIP200的缺失會抑制成骨細胞自噬,導致骨質(zhì)的流失和骨量下降[13]。 此外,有研究表明,GCs導致BMSCs中Parkin下調(diào)和p53上調(diào),其自噬水平降低,線粒體損傷積累,最終導致凋亡和衰老。通過上調(diào)Parkin并下調(diào)p53的表達水平,可以顯著增強BMSCs的線粒體自噬,并減少受損線粒體在細胞內(nèi)的積累,有效抵御氧化應激所誘導的細胞損傷,從而改善了BMSCs移植對早期類固醇誘導的骨壞死的影響[14]。

五、凝血功能異常及血栓

減少血管數(shù)量和破壞局部血液供應被認為是GCs誘導的股骨頭壞死的重要因素之一。GCs誘發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡,破壞凝血纖維蛋白溶解系統(tǒng),促進股骨頭內(nèi)血管微血栓形成,造成股骨頭內(nèi)血供減少,最終導致GA-ONFH的發(fā)生。纖溶酶原激活物抑制劑1型(PAI-1)是一種糖蛋白,通過與組織纖溶酶原激活劑形成復合物來調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解。高劑量GCs引起股骨頭微環(huán)境PAI-1水平增高,繼而誘發(fā)凝血功能障礙,血流減緩,使微循環(huán)中血液呈現(xiàn)高凝狀態(tài)及血栓形成[15]。Liu等[16]對小鼠進行血管緊張素Ⅱ和天冬酰胺酶聯(lián)合處理后,相關(guān)凝血因子(Ⅲ、Ⅴ、Ⅹ)水平顯著升高,提高了小鼠GA-ONFH的發(fā)生率。

六、炎癥和免疫

在以前的研究中,炎癥已被證明在GA-ONFH的發(fā)展和進展中起著不可或缺的作用。已有研究表明,通過收集GA-ONFH病人血清后檢測基因表達譜,將8個基因(BIRC5、CBL、CCR1、LYN、PAK1、PTEN、RAF4和TLR10)確定為GA-ONFH的候選血清生物標志物,而在功能上,這些候選血清生物標志物在GA-ONFH進展過程中參與幾種病理過程,例如免疫調(diào)節(jié)和炎癥,骨代謝和血管生成[17]。而在GA-ONFH的動物模型中,骨壞死組織中中性粒細胞和巨噬細胞升高,同時壞死骨可以通過激活Toll樣受體4(TLR4)和上調(diào)下游轉(zhuǎn)錄因子包括核因子-κB(NF-κB)和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)刺激巨噬細胞調(diào)節(jié)炎癥反應[18]。單核細胞起源于骨髓中的造血干細胞并在骨髓中發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn),相比于其他原因?qū)е碌墓晒穷^壞死,類固醇導致的骨壞死病人骨髓標本中的單核細胞數(shù)量高3倍[19]。GCs可以在體內(nèi)和體外直接作用于單核細胞,誘導單核細胞擴增,同時通過增加細胞因子信號傳導抑制因子3(SOCS3)、FOS樣1(Fosl1)、Forsb、白細胞介素-1受體1型(IL1R1)、白細胞免疫球蛋白樣受體成員3A(Lilrb3a)、配對的Ig樣受體B(Pirb)和破骨細胞相關(guān)的Ig樣受體(Oscar)的表達,使單核細胞向破骨細胞分化,發(fā)揮其炎癥反應和碎骨能力,最后導致骨量流失,血供減少[19]。

七、非編碼RNA在GA-ONFH中的作用

1．MicroRNA:miRNA在多種生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,包括發(fā)育、細胞增殖、分化、代謝、遷移和凋亡,同時也參與了GA-ONFH的發(fā)生和發(fā)展。

在GA-ONFH病人(對照組為股骨頸骨折病人)中壞死骨、骨髓血及外周血中均存在miRNA的表達譜差異[20]。Li等[21]在3例類固醇誘導的ONFH病人的股骨頭的坍塌區(qū)和非坍塌區(qū)發(fā)現(xiàn)了8個miRNA上調(diào)(has-miR-4472,has-miR-4306,has-miR-4747-5p,has-miR-4441,has-miR-4709-3p,ebv-miR-BHRF1-2-3p,has-miR-585-3p和has-miR-5572),兩個miRNA下調(diào)(has-miR-195-5p和has-miR-645)。目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA直接或者間接參與GA-ONFH的致病過程,主要是參與調(diào)節(jié)脂肪生成、細胞凋亡、成骨和血管生成相關(guān)通路。Cao等[22]發(fā)現(xiàn),miR-224-5p在GC處理的BMSCs中上調(diào),miR-224-5p可以抑制BMSCs的成骨,但促進BMSCs的成脂分化。GCs通過上調(diào)miR-30b-5p的表達,抑制RUNX2通路及下游基因(MMP3、MM9、Col10a1),介導股骨頭軟骨細胞發(fā)生凋亡[23]。

2．長鏈非編碼RNA(lncRNA):lncRNA對于許多疾病的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。有研究顯示,從GA-ONFH病人獲取的BMSCs中l(wèi)ncRNA的差異表達譜,其中有1 878個lncRNA上調(diào)和1 842個lncRNA下調(diào)[24]。這些lncRNA的靶基因參與細胞增殖、分化和遷移等過程。某些lncRNA具有某些miRNA的“種子序列”,它們能夠像海綿一樣結(jié)合miRNA,從而阻止miRNA與其靶mRNA結(jié)合。最近的研究發(fā)現(xiàn),lncRNA Tmem235能夠結(jié)合miR-3a-5p,抑制miR-3a-5p對下游基因BIRC的調(diào)控,有效抑制了缺氧環(huán)境下BMSCs的凋亡,并提高了BMSCs在GA-ONFH的早期移植療效[25]。lncRNA LINC00473可以通過激活miR-23a-3p/LRP5/Wnt/β- catenin信號通路軸來促進成骨并抑制BMSCs的脂肪生成,同時,通過激活miR-23a-3p/PEBP1/Akt/Bad/Bcl‐2信號通路軸從Dex誘導的細胞凋亡中拯救BMSCs[26]。

3.環(huán)狀RNA(circRNA) :與lncRNA相似,circRNA包括多個miRNA結(jié)合位點,類似于海綿吸附水,將miRNA與靶mRNA“隔離”,從而影響miRNA對靶mRNA的負調(diào)控。已有研究使用circRNA微陣列分析篩選了類固醇誘導的GA-ONFH中的circRNA表達譜,鑒定出多達182個差異表達的circRNA,其中108個circRNA顯著上調(diào)。而上調(diào)最明顯的circRNA(稱為circHGF)可以通過靶向miR-25-3p/SMAD7軸抑制GA-ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化[27]。Chen等[28]通過GA-ONFH來源BMSCs中篩選出了820種差異表達的circRNA,其中circRNA CDR1as通過調(diào)控miR-7-5p-WNT5B促進BMSCs發(fā)生成脂分化,而敲低circRNA CDR1as增強了BMSCs成骨分化能力,同時減弱 BMSC 的成脂分化能力。

八、外泌體在GA-ONFH中的應用

外泌體是由細胞形成的直徑為50～100nm的細胞外脂質(zhì)結(jié)構(gòu)囊泡,這些囊泡將生物活性蛋白、脂質(zhì)和RNA傳遞到靶細胞進行細胞間通訊,其發(fā)揮的作用與其來源的細胞功能相似。外泌體治療GA-ONFH具有顯著的潛力,這些外泌體主要來源于脂肪間充質(zhì)干細胞、滑膜間充質(zhì)干細胞、CD34陽性干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞、BMSCs和尿液來源間充質(zhì)干細胞。除此之外,血小板來源的外泌體可以減少GA-ONFH中細胞凋亡的發(fā)生。來自GA-ONFH壞死骨的外泌體可導致CD41蛋白表達降低,通過調(diào)控整合素β3-FAK-Akt-Runx2通路,抑制BMSCs的成骨分化和遷移從而誘導GA-ONFH發(fā)生[29]。在此病理過程中,GA-ONFH壞死骨的外泌體導致BMSCs缺乏CD41成骨能力下降而無法修復壞死骨可能是GA-ONFH加重的主要原因[29]。而更值得注意的是,Li等[30]發(fā)現(xiàn)與健康的小鼠同住可以延緩GCs處理導致的股骨頭壞死,同時挽救GCs誘導的腸道動物乳桿菌減少,而口服補充動物乳桿菌通過增加血管生成、增強成骨和減少細胞凋亡來減輕GCs誘導的 GA-ONFH,來自動物乳桿菌(L.animalis-EVs)的細胞外囊泡含有豐富的功能蛋白,可以進入股骨頭發(fā)揮促血管生成、促成骨和抗凋亡作用。

GA-ONFH發(fā)病機制仍在持續(xù)研究之中。一般認為,GA-ONFH的發(fā)生并不是單因素所致,而是多因素并存,破壞了股骨頭局部微環(huán)境的骨代謝平衡,使骨質(zhì)流失、骨量下降、血管內(nèi)皮細胞損傷和血供受損。GA-ONFH的早期癥狀并不明顯,癥狀明顯時多處于進展期和終末期,治療十分棘手。因此,早期預防和治療的研究具有重要的臨床意義。深入探討GA-ONFH的致病靶標可能會成為治療GA-ONFH的新方向。