戴龍飛

（山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000）

膽管癌是僅次于肝細(xì)胞性肝癌的第二常見肝臟惡性腫瘤，過去幾十年，其發(fā)病率不斷上升[1]。大多數(shù)膽管癌患者早期無顯著的臨床癥狀，被發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)[2]。因此，探究膽管細(xì)胞癌的生物學(xué)特征，尋找新的預(yù)警分子，提高膽管癌患者的檢出率尤為重要。細(xì)胞分裂失敗導(dǎo)致非整倍體可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)展的一個(gè)重要因素。作為細(xì)胞分裂的重要調(diào)節(jié)因子，胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1（protein regulator of cytokinesis 1，PRC1）調(diào)節(jié)反平行微管交聯(lián)，促進(jìn)微管結(jié)構(gòu)的形成，支持細(xì)胞形態(tài)和調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂[3]。PRC1的表達(dá)失調(diào)促進(jìn)了染色體的不穩(wěn)定，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[4]。目前，已有多項(xiàng)研究報(bào)道PRC1在腫瘤中表達(dá)升高，如肝癌[3]、胃癌[5]、結(jié)腸癌[6]、前列腺癌[7]和口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]等，且與患者的預(yù)后相關(guān)。然而，PRC1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制，尤其是在膽管細(xì)胞癌中仍然知之甚少。在本研究中，首先探究了PRC1在正常膽管細(xì)胞與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，進(jìn)一步研究了PRC1在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中對(duì)其生物學(xué)功能的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 ICC細(xì)胞系（CCLP-1）來自衛(wèi)生部多器官聯(lián)合移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的饋贈(zèng)，并在含10%胎牛血清（Gibco，USA）和青霉素/鏈霉素的1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。小干擾RNA的轉(zhuǎn)染是將細(xì)胞接種在生長(zhǎng)至40%的6孔組織培養(yǎng)板上。第2天，使用Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen）根據(jù)制造商的說明書用靶向人PRC1或?qū)φ?siRNA（OriGene，USA）的100 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對(duì)于PRC1的siRNA 的靶編碼序列為5'AGCGCUGCAAUUAGAAGUGGAUCGG 3'和5'CCGAUCCACUUCUAAUUGCAGCGCU 3'。所有患者均知情同意，患者均簽署知情同意書，本研究已獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 蛋白質(zhì)印跡分析 培養(yǎng)細(xì)胞后，將其裂解并超聲處理以獲得可溶性蛋白裂解物。蛋白質(zhì)濃度采用Bradford法（Bio-Rad）測(cè)定。將等量的蛋白加入到10% NuPAGE Bis-Tris凝膠（Invitrogen）上并進(jìn)行電泳。然后，將裂解物轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量不同，轉(zhuǎn)膜時(shí)間60～90 min）。用5%脫脂牛奶封閉細(xì)胞膜后，將其與相關(guān)一抗在4 ℃下孵育過夜。用含有0.05%TWEEN-20的Tris 緩沖鹽水洗滌膜3次，每次洗滌10 min，用 SuperSignal West Pico 化學(xué)發(fā)光底物（Pierce）檢測(cè)信號(hào)。使用 Wayne Rasband（National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA）的 ImageJ 1.44軟件對(duì)波段信號(hào)進(jìn)行量化。使用 GAPDH 作為加載對(duì)照。

1.3 免疫組化 將ICC患者的石蠟包埋組織標(biāo)本切成4 μm厚的切片。切片在二甲苯中脫石蠟，并在一系列分級(jí)酒精稀釋液中再水化。所有切片均用微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。然后將切片與3% H2O2孵育10 min，10%正常山羊血清在室溫下孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶和非特異性抗原。使用以下一抗在4 ℃下對(duì)組織切片進(jìn)行免疫染色：抗PRC1抗體（H70）（1∶50，santa cruz）。用 PBS沖洗3次后，將切片與辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體在室溫下孵育30 min。最后用3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）觀察顏色的發(fā)展，然后用蘇木精復(fù)染切片。同時(shí)，研究小組的兩位獨(dú)立研究者使用 ImagePro Plus 6.0軟件評(píng)估免疫反應(yīng)密度，且對(duì)病理數(shù)據(jù)不知情。石蠟切片半定量評(píng)分如下：0級(jí)，0%免疫反應(yīng)細(xì)胞；1級(jí)，≤10%免疫反應(yīng)細(xì)胞；2級(jí)，＞10%～50%免疫反應(yīng)細(xì)胞；3級(jí)，≥50免疫反應(yīng)細(xì)胞。為了統(tǒng)計(jì)學(xué)的目的，0級(jí)和1級(jí)的病例被分類為低表達(dá)，而2級(jí)和3級(jí)的病例被分類為高表達(dá)。

1.4 細(xì)胞增殖能力測(cè)定 對(duì)于增殖測(cè)定，首先將ICC細(xì)胞以1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8，Dojindo）來測(cè)定細(xì)胞活力和生長(zhǎng)，根據(jù)制造商的說明書在450 nm處讀取吸光度。EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)根據(jù)試劑商說明書來操作（銳博生物），并在熒光顯微鏡下測(cè)定。

1.5 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 根據(jù)制造商的說明，在 BD Falcon 24孔插入系統(tǒng)（BD Biosciences，San Jose，CA）中進(jìn)行遷移和侵入測(cè)定。對(duì)于遷移測(cè)定，將無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種在上腔中，并且沒有包被膜。對(duì)于侵襲測(cè)定，用35 μL含有基質(zhì)膠（BD Biosciences，USA）和 RPMI 1640的溶液以1∶7的比例預(yù)涂覆過濾器2 h。2個(gè)實(shí)驗(yàn)均將5×104個(gè)ICC細(xì)胞接種于上室，下室加入含10% FBS 的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24 h（遷移試驗(yàn)）和48 h（侵襲試驗(yàn)）。非遷移性或非侵襲性細(xì)胞從過濾器上表面移除。用Wright-Giemsa染色試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）對(duì)膜下表面的細(xì)胞進(jìn)行染色。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞凋亡是用Annexin V來測(cè)定的。細(xì)胞死亡的百分比計(jì)算為總細(xì)胞群中Annexin V陽性/碘化丙啶（PI）陰性細(xì)胞（經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的早期階段）和Annexin V 陽性/碘化丙啶陽性（經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的晚期階段）的百分比的總和。細(xì)胞在6孔板上培養(yǎng)24 h后，加入順鉑1.5 μg/mL來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，用Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件（SPSS）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組之間的差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRC1在人ICC組織中表達(dá)升高 為探討PRC1在ICC中的表達(dá)，研究通過免疫組織化學(xué)測(cè)量了30對(duì)ICC和非癌組織中的PRC1表達(dá)，結(jié)果顯示與相鄰膽管組織中的表達(dá)相比，ICC腫瘤中的PRC1表達(dá)上調(diào)（圖1）。與鄰近組織相比，共有73.3%（22/30）的腫瘤組織顯示PRC1呈過表達(dá)。

圖1 PRC1在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中表達(dá)升高。免疫組織化學(xué)染色（IHC）檢測(cè)30例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌和癌旁組織中PRC1的表達(dá)（紅色箭頭指向正常膽管）

2.2 敲低PRC1后抑制ICC細(xì)胞的增殖 為了進(jìn)一步探究PRC1在ICC細(xì)胞中的生物學(xué)功能，本研究用小干擾RNA敲低了PRC1的表達(dá)，而Westernblot證實(shí)本研究敲低PRC1成功（圖2A）。接下來用CCK-8法檢測(cè)了細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，敲低PRC1后，會(huì)抑制CCLP-1細(xì)胞的增殖（圖2B）。通過EdU檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步驗(yàn)證PRC1對(duì)增殖的影響，結(jié)果同樣顯示，敲低PRC1后，會(huì)抑制CCLP-1細(xì)胞的增殖（圖2C）。

圖2 敲低PRC1會(huì)抑制肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的表達(dá)

2.3 敲低PRC1后抑制ICC細(xì)胞的遷移和侵襲 轉(zhuǎn)移也是腫瘤進(jìn)展的重要因素，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此，本文研究了敲低PRC1對(duì)ICC細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。Transwell測(cè)定的結(jié)果顯示敲低PRC1后抑制了CCLP-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力（二者均P＜0.05，圖3）。

圖3 敲低PRC1會(huì)抑制肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的遷移和侵襲

2.4 敲低PRC1后ICC細(xì)胞的凋亡增加及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)改變情況 為了進(jìn)一步探究PRC1影響增殖的原因，本研究使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)了CCLP-1的凋亡情況。結(jié)果顯示，敲低PRC1后，ICC細(xì)胞的凋亡增加（圖4A）。而對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，敲低PRC1后，活化的cle-caspase8、cle-caspase9與BAX表達(dá)升高（圖4B）。

圖4 敲低PRC1會(huì)促進(jìn)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的凋亡

3 討 論

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（ICC）是肝臟第二原發(fā)腫瘤，且近年來發(fā)病率逐年升高，其與多種膽道或肝臟疾病有關(guān)，如原發(fā)性硬化性膽管炎、卡羅里病、肝內(nèi)膽管結(jié)石、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、肝吸蟲感染、炎癥性腸病、暴露于有機(jī)溶劑等。此外，肥胖、非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎可能是導(dǎo)致其發(fā)病率不斷上升的原因[9]。ICC患者的臨床癥狀往往是非特異性的，大部分患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于腫瘤晚期，僅有約20%的ICC患者尚有手術(shù)的可能，并且術(shù)后5年的生存率僅為30%[10]。因此，尋找新的腫瘤標(biāo)志物，提高ICC患者的檢出率，探究肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的作用機(jī)制，制定有效的診斷和治療策略尤為重要。

眾所周知，適當(dāng)?shù)陌|(zhì)分裂是基因組穩(wěn)定所必需的，而胞質(zhì)分裂失敗可能導(dǎo)致染色體的非整倍體出現(xiàn)而促進(jìn)癌癥發(fā)展[11]。PRC1對(duì)胞質(zhì)分裂和正常細(xì)胞分裂至關(guān)重要。PRC1是細(xì)胞裂解所必需的有絲分裂紡錘體相關(guān)微管結(jié)合蛋白，PRC1失調(diào)導(dǎo)致胞質(zhì)分裂缺陷，從而促進(jìn)染色體不穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性和癌癥進(jìn)化[12]。PRC1在多種腫瘤中被證實(shí)存在表達(dá)異常，并且與預(yù)后相關(guān)。最新的研究發(fā)現(xiàn)，PRC1的表達(dá)異常與肝細(xì)胞肝癌的臨床分期相關(guān)，PRC1的表達(dá)升高預(yù)示著患者的預(yù)后更差[13]。而本文研究發(fā)現(xiàn)，在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中，PRC1表達(dá)較癌旁的正常組織升高，提示其可能在ICC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。因此本研究推測(cè)，進(jìn)一步探討PRC1在ICC發(fā)生、發(fā)展中的作用及具體機(jī)制有重要的臨床意義。

Xu等[5]發(fā)現(xiàn)，沉默PRC1可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的活力，并促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。Liu等[14]研究表明，降低PRC1表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖，并通過p53通路增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PRC1在胃癌組織中異常表達(dá)，并與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)。敲低PRC1促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，阻礙胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低PRC1的表達(dá)后，會(huì)抑制ICC細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲，并增加細(xì)胞的凋亡。為進(jìn)一步探究其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，本文又研究了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

細(xì)胞凋亡是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡過程，在腫瘤的化學(xué)治療中已被廣泛研究[15]。細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡，在基因水平上受到精細(xì)調(diào)控，細(xì)胞凋亡的機(jī)制是復(fù)雜的，涉及許多信號(hào)通路。細(xì)胞凋亡可以通過caspase介導(dǎo)的外在途徑或內(nèi)在途徑觸發(fā)。這兩種途徑匯聚在一起激活效應(yīng)因子凋亡caspases，最終導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和生化發(fā)生改變[16]本研究發(fā)現(xiàn)，敲低PRC1后，會(huì)使凋亡啟動(dòng)因子即活化的cle-caspase8和cle-caspase9升高，同時(shí)促凋亡蛋白 BAX的表達(dá)也升高。這些研究發(fā)現(xiàn)，PRC1參與了ICC的凋亡過程，從而影響了腫瘤細(xì)胞的活性。

總之，本研究表明PRC1在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中表達(dá)升高，并且PRC1能夠促進(jìn)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的增殖，促進(jìn)ICC的遷移和侵襲。同時(shí)，敲低PRC1后會(huì)促進(jìn)ICC的凋亡。因此，本研究推測(cè)PRC1通過抑制ICC細(xì)胞的凋亡進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的活性。因此，PRC1的表達(dá)可能為提高ICC患者的檢出率提供一個(gè)新的可能。