程曉艷

（萊陽市漁業(yè)技術(shù)服務中心，山東 煙臺 265200）

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高密度、規(guī)?；?、集約化高速發(fā)展，病害已成為產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重大挑戰(zhàn)。目前來看，對水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類使用疫苗，是最理想的疫病防控手段，既可以防控魚類病害發(fā)生，減少產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟損失，又可以減少或消除由于大量使用抗生素帶來的健康危害、生態(tài)風險和水產(chǎn)品食品安全等問題，從而支撐水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康、綠色發(fā)展?，F(xiàn)介紹目前魚類細菌性疫苗的具體制備方法、免疫方法、評價體系和開發(fā)存在的問題，旨在從根本上提高魚體的免疫力，減少病害發(fā)生頻率，以獲得最大經(jīng)濟效益。

1 我國魚類細菌性疫苗的研究現(xiàn)狀

20 世紀40 年代開始，歐美等發(fā)達國家開展了魚類疫苗的研究[1]。魚類疫苗包括細菌疫苗、病毒疫苗和寄生蟲疫苗。其中，細菌疫苗由滅活或減毒活菌制成，用于主動免疫接種。相比于病毒疫苗和寄生蟲疫苗，細菌疫苗的研制方法相對簡單、應用相對廣泛，但大多數(shù)疫苗僅停留在試驗階段，大規(guī)模商用較少。

20 世紀60 年代末，我國首個魚用疫苗——草魚出血病組織漿滅活疫苗研制成功。2002 年，李愛華等[2]研制了淡水魚類出血性致病菌嗜水氣單胞菌和河弧菌的二聯(lián)疫苗。2006 年，曹宏梅等[3]研制了海水魚類致病菌鰻弧菌和溶藻弧菌的二聯(lián)疫苗，發(fā)現(xiàn)二聯(lián)疫苗免疫對大菱鲆（Scophthalmus maximus）鰻弧菌和溶藻弧菌的免疫保護率分別為83.52%和83.24%。2009 年，潘燕華等[4]用肌內(nèi)注射和浸泡免疫方式，分析鰻弧菌減毒活疫苗對牙鲆（Paralichthys olivaceus）的免疫保護作用，發(fā)現(xiàn)注射或浸泡減毒活疫苗的牙鲆的免疫保護率達到100%，明顯高于滅活疫苗的60%。隨著基因工程技術(shù)的應用，2014 年，龐歡瑛等[5]構(gòu)建了溶藻弧菌vscO基因缺失的減毒活疫苗ZJ03ΔvscO，可有效提高石斑魚對溶藻弧菌的免疫力。

2 制備與檢測

2.1 制備

2.1.1 菌液的培養(yǎng)

選取毒力較強、已經(jīng)確定保藏的菌種，將其接種于瓊脂平皿，在菌種的最適生長溫度（不同的細菌最適生長溫度不同，一般28~30 ℃）下培養(yǎng)24 h，生產(chǎn)出菌落，挑取適量單菌落，接種于液體培養(yǎng)基，在最適生長溫度下，震蕩培養(yǎng)24 h，得到菌液。

2.1.2 菌液檢驗

于無菌條件下，取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面，將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，在最適生長溫度下培養(yǎng)24 h，觀察細菌的生長情況，要求無雜菌生長。

2.1.3 菌含量測定

平板計數(shù)測定，將菌液稀釋后，用分光光度法測定細菌的吸光度（OD 值），計算細菌濃度，菌液濃度≥50×108cfu/mL。

2.1.4 菌液滅活

采用化學滅活和熱滅活2 種方法?；瘜W滅活法多使用甲醛、苯酚和三氯甲烷溶液。熱滅活法多使用60 或65 ℃水浴法。后進行分裝，石蠟封口，貼標簽，即可制成滅活菌苗。

2.2 檢測

2.2.1 無菌檢驗

將滅活的菌苗經(jīng)28 ℃培養(yǎng)，設2 個平行，24 h后，檢查有無菌落形成。如果所接平板均無菌落生長，說明疫苗中無活菌存在。

2.2.2 安全性檢驗

將滅活的菌苗濃度稀釋至5×108cfu/mL，對20 尾健康活魚的腹部注射，劑量為0.2~0.5 mL/尾。正常投喂14 d，同時設置空白對照組，觀察魚體反應。如果接種魚其運動、攝食等活動無異常，成活率為100%，說明所制備的疫苗安全。

2.2.3 相對免疫保護率測定

取上述菌苗，對同規(guī)格20~40 尾活魚注射，劑量為0.2~0.5 mL/尾。投喂30~60 d 后捕撈，用同源強毒株菌種攻毒，攻毒后，正常喂養(yǎng)7 d，統(tǒng)計死亡率。若浸泡免疫的保護率為70%以上、注射免疫保護率為80%以上，則為合格疫苗。相對免疫保護率計算公式為：相對免疫保護率（%）=(對照組平均死亡率-免疫組平均死亡率）/對照組平均死亡率×100%

3 免疫方法

免疫方法主要有浸泡免疫、注射免疫和口服3 種。

3.1 浸泡免疫

浸泡免疫是將疫苗配成適當濃度，加到水體中，魚體通過鰓和體表黏膜的吸收進行免疫。其優(yōu)點是對魚體創(chuàng)傷小，有利于水生動物群體免疫?？赏ㄟ^優(yōu)化氯化鈉浸泡液濃度、浸泡時間和溫度等免疫條件，提高浸泡免疫效果。蔣昕彧等[6]采用超聲波輔助浸泡法，導入草魚嗜水氣單胞菌疫苗，相比單純浸浴法，可獲得較好的免疫保護效果。

3.2 注射免疫

注射免疫是將疫苗直接注入魚體內(nèi)，其所需疫苗量少，受環(huán)境影響小。張麗等[7]以浸泡和注射2 種免疫方法，用遲緩愛德華氏菌對養(yǎng)殖大菱鲆進行全菌疫苗免疫，發(fā)現(xiàn)注射和浸泡接種2 種方法，均使大菱鲆對腹水病產(chǎn)生免疫效果，且注射免疫效果優(yōu)于浸泡免疫。2019 年，洪楊等[8]設計了一種魚類疫苗自動注射設備，可有效提高注射作業(yè)效率，降低人工接種強度，有利于魚苗注射接種技術(shù)的推廣。

3.3 口服免疫

口服免疫是將疫苗添加到飼料中，通過口服進行免疫。魚用疫苗最理想的接種途徑，是把疫苗混合到餌料中進行口服免疫，但其免疫效果遠不及注射法和浸浴免疫，主要原因是魚吸收疫苗前，胃內(nèi)的消化酶已將疫苗分解。因此，邊慧慧等[9]將鰻弧菌滅活疫苗制備成微囊口服疫苗，對牙鲆進行免疫，發(fā)現(xiàn)其免疫效果優(yōu)于普通口服疫苗。

4 魚類免疫佐劑

免疫佐劑是指能非特異增強抗原的免疫原性或改變免疫應答類型的物質(zhì)。按照來源，可分為動植物提取物（蜂膠、皂角苷、甘草素）、微生物類衍生物（葡聚糖、肽聚糖、脂多糖）、人工合成的有機物和無機鹽（鋁鹽）、生物活性分子類（細胞類因子CK）等。張念慈等[10]通過試驗證明，只要在疫苗中加入少量莨菪堿，即可明顯增強疫苗的浸泡免疫效果。韓雯等[11]用皂角苷浸泡大菱鲆，證明皂角苷具有提高魚類非特異免疫效果。任燕等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蓖麻油聚乙二醇單酯葡萄糖苷，可提高異育銀鯽嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫效果。

5 疫苗效果評價方法

由于魚種、環(huán)境等差異，目前還沒有統(tǒng)一的魚用疫苗效果評價方法。疫苗效果評價指標分為非特異性免疫評價指標、特異性免疫評價指標和相對免疫保護率。非特異性免疫評價指標有溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、血清抑菌活性、外周白細胞數(shù)量變化、外周紅細胞數(shù)量變化和非特異性免疫相關(guān)基因的表達量（補體系統(tǒng)中C3、補體C4 基因表達量、細胞因子基因表達量變化）等；特異性免疫評價指標有血清抗體效價、主要組織相容性復合體基因表達量變化。相對免疫保護率是在免疫試驗后進行攻毒試驗，統(tǒng)計免疫組和對照組的死亡率，計算相對免疫保護率，它更直接地表明疫苗免疫效果。相對免疫保護率越高，表示疫苗免疫效果越好。

在評價疫苗效果時，可選取1 個或多個敏感指標進行評價。隋虎辰等[13]用添加多糖佐劑的遲緩愛德華氏菌滅活疫苗，來免疫大菱鲆。通過測定血清中溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、血清抗體效價和相對免疫保護率4 個指標，評價各疫苗組的免疫效果。刁菁等[14]通過檢測牙鲆抗體效價、6 種免疫相關(guān)基因表達變化及相對免疫保護力指標，對脂多糖和酵母β 葡聚糖的免疫保護效果進行評價。

6 疫苗開發(fā)存在的問題

6.1 思想保守，疫苗使用率低

部分水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)人員缺乏防病意識，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中不愿意投入較多的資金進行疫苗免疫。發(fā)生病害時，養(yǎng)殖人員也傾向于使用價格較低的抗生素類藥物治療，導致大量耐藥菌出現(xiàn)，造成藥物殘留，對食品安全及人類健康造成重大威脅。

6.2 疫苗研發(fā)成本較高，商業(yè)疫苗開發(fā)少

我國魚類養(yǎng)殖品種較多，病害類型及病原也不同，其免疫系統(tǒng)對不同病害的抵抗力和感受性不同，因此適用疫苗也不同，增加了疫苗研發(fā)成本。此外，目前疫苗審核需要臨床試驗，而自發(fā)使用疫苗的養(yǎng)殖從業(yè)人員較少，試驗基地養(yǎng)殖魚類的品種和數(shù)量，均無法滿足細菌性疫苗臨床試驗需求。若將疫苗免費發(fā)放，既增加了研發(fā)成本，又承擔了極大風險，使得企業(yè)研發(fā)商業(yè)疫苗的積極性不高。

6.3 影響免疫應答的因素較多

影響免疫應答的因素較多。首先，魚的年齡和體質(zhì)量、性別、營養(yǎng)狀況、生理狀態(tài)和群體效應等，均影響免疫應答，體格強壯的魚免疫機能旺盛，魚處于應激狀況下免疫應答會受到影響。其次，抗原的劑量和進入機體途徑均顯著影響免疫應答。再次，溫度對魚類免疫應答的影響也很大。當環(huán)境溫度高于免疫臨界溫度時，魚類才能產(chǎn)生免疫應答，而且在適宜的生長溫度內(nèi)，溫度越高，免疫應答越快。最后，除溫度外，季節(jié)、光周期、可溶性污染物及藥物、佐劑的選擇也影響免疫效果。

7 建議

7.1 加大推廣宣傳力度

建議科研院所、高校、漁業(yè)技術(shù)推廣機構(gòu)借助網(wǎng)絡、媒體等平臺，推廣疫苗防病技術(shù)，增強養(yǎng)殖者的環(huán)境保護和水產(chǎn)品質(zhì)量安全意識，提高其健康養(yǎng)殖水平，使魚用疫苗逐步替代藥物，實現(xiàn)健康養(yǎng)殖。

7.2 簡化審批手續(xù)

魚用疫苗審批是一個復雜的系統(tǒng)工程，需要科研機構(gòu)與養(yǎng)殖企業(yè)相互合作。建議簡化疫苗審批手續(xù)，加快魚用疫苗成果快速向產(chǎn)業(yè)端轉(zhuǎn)化。

7.3 研究方向

目前，我國已經(jīng)建立了滅活疫苗、減毒活疫苗等成熟的漁用疫苗技術(shù)開發(fā)路線，并成功開發(fā)了漁用疫苗產(chǎn)品[15]。在此基礎上，構(gòu)建以疫苗接種為核心的水產(chǎn)病害免疫綜合防控體系，是今后魚類疫苗研究工作中的主要方向。通過加強對病原的血清學和流行規(guī)律、佐劑、免疫增強劑、抗原載體、疫苗體外評估系統(tǒng)、疫苗自動化接種設備等方面的系統(tǒng)研究，形成完備的魚類病害免疫綜合防控體系，推進我國魚類多聯(lián)、高效疫苗的開發(fā)和應用。此外，還需加強重點魚品種主要疫苗的全覆蓋接種工作。