李國(guó)烈

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，四川 南充 637000)

1 概述

地西泮(Diazepam)又叫苯甲二氮卓，屬苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥。苯二氮卓類藥物具有良好的鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、抗焦慮以及促食欲過盛等優(yōu)點(diǎn)，在20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)，并逐漸取代了巴比妥類藥物[1，2]?！妒称穭?dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》(第193號(hào)公告)規(guī)定地西泮不準(zhǔn)以抗應(yīng)激、提高飼料報(bào)酬、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)為目的在食品動(dòng)物飼養(yǎng)過程中使用。《GB 31650-2019 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定允許作治療用，但不得在動(dòng)物性食品中檢出地西泮。

地西泮具有能夠使動(dòng)物體重增加，提高出肉率，降低動(dòng)物感知外界的能力，減少應(yīng)激和在畜禽養(yǎng)殖中提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用[3，4]。因此，在生產(chǎn)過程中存在非法使用的情況，近年來(lái)我國(guó)多地檢出動(dòng)物性食品中地西泮殘留。王守英等[5]對(duì)上海2018年市售水產(chǎn)品地西泮殘留狀況及其風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了調(diào)查分析，在市售水產(chǎn)品中檢測(cè)出地西泮殘留；四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局于2020年10月9日發(fā)布關(guān)于26批次食品不合格情況的通告(2020年第42號(hào))，3家水產(chǎn)店的鳙魚和鰱魚中檢出地西泮；天津市薊州區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局于2020年12月8日發(fā)布2020年第7期食品安全監(jiān)督抽檢信息，2家水產(chǎn)店的鯽魚和鯉魚中檢出地西泮[6]。地西泮不易被動(dòng)物機(jī)體代謝出去，從而蓄積在食品動(dòng)物體內(nèi)，當(dāng)長(zhǎng)期攝入含有地西泮及其代謝物殘留的食物后，會(huì)對(duì)人身體健康造成危害[7，8]，動(dòng)物排泄物進(jìn)入土壤和水中導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境問題，同時(shí)會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生間接危害。因此，快速高效的檢測(cè)方法對(duì)動(dòng)物源性食品中地西泮殘留監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。本文擬綜述動(dòng)物性食品中地西泮殘留檢測(cè)研究進(jìn)展，以期為動(dòng)物性食品中地西泮的殘留檢測(cè)提供參考。

2 檢測(cè)方法

目前，動(dòng)物性食品中地西泮殘留檢測(cè)的分析方法主要包括免疫分析方法、色譜法和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等檢測(cè)方法。

2.1 免疫分析方法

免疫分析方法是利用抗原與抗體特異性結(jié)合而建立的高選擇性生物化學(xué)方法，目前報(bào)道應(yīng)用在動(dòng)物性食品中地西泮殘留檢測(cè)的方法有酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金免疫層析法。該類方法不需要昂貴儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單快捷，可對(duì)現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品進(jìn)行快速檢測(cè)。但該類方法不能準(zhǔn)確定量，只能作為初篩方法。賈濤[9]報(bào)道了采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)測(cè)試盒檢測(cè)豬肝中地西泮的殘留量，該方法不需要有機(jī)溶劑，并在10～30min完成提取過程，檢測(cè)過程不到2h；該方法檢測(cè)下限為0.01μg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(r值)達(dá)到0.9959，高于規(guī)定的0.98，離散系數(shù)(CV值)不高于3.9%，陽(yáng)性添加回收率平均達(dá)到97.4%，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠；另外，其還提出了酶聯(lián)免疫法測(cè)定過程中8個(gè)方面的注意事項(xiàng)，對(duì)采用酶聯(lián)免疫吸附法開展檢測(cè)工作具有很強(qiáng)的指導(dǎo)性。

膠體金免疫層析法是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型檢測(cè)方法，通過將抗原抗體特異性免疫反應(yīng)和色譜層析分離技術(shù)相結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)物的快速檢測(cè)，因其無(wú)需特殊設(shè)備，結(jié)果直觀，操作簡(jiǎn)便，現(xiàn)已成為食品安全快速檢測(cè)的常用方法。桑麗雅等[10]報(bào)道了采用膠體金免疫層析法快速檢測(cè)水產(chǎn)品中地西泮殘留量；該方法利用免疫磁珠選擇性吸附、分離水產(chǎn)品中地西泮殘留，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，可在25min內(nèi)完成單個(gè)樣本檢測(cè)；方法檢出限為0.5μg·kg-1，在加標(biāo)濃度為1.0μg·kg-1、5.0μg·kg-1、10.0μg·kg-1和15.0μg·kg-1時(shí)，方法的回收率為78.34%～90.40%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.03%～8.96%，在添標(biāo)檢測(cè)試驗(yàn)和盲樣檢測(cè)試驗(yàn)中，該方法的檢測(cè)結(jié)果與儀器分析方法(氣相色譜-質(zhì)譜法)的檢測(cè)結(jié)果一致，可用于樣品中地西泮殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2.2 色譜法

色譜法是利用混合物中各組分在流動(dòng)相和固定相兩相間的分配系數(shù)的不同而獲得分離的方法，目前報(bào)道應(yīng)用在動(dòng)物性食品中地西泮殘留檢測(cè)的方法有氣相色譜法和液相色譜法。該類方法具有分離效率高，分析速度快，易于自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，但存在定性分析易受基質(zhì)干擾，無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析的問題，在檢測(cè)過程中一般都要采用不同極性的色譜柱或改變流動(dòng)相極性等方式來(lái)輔助定性。

近年來(lái)，關(guān)于采用氣相色譜法和液相色譜法檢測(cè)動(dòng)物組織中地西泮殘留量的報(bào)道較少。張玉潔等[11]報(bào)道了采用氣相色譜-微電子捕獲(GC-μECD)檢測(cè)法測(cè)定豬肉中地西泮殘留量；樣品經(jīng)乙腈超聲提取，正己烷除脂，C18固相萃取小柱凈化，甲醇-水(體積比70+30)洗脫，外標(biāo)法定量；該方法在1～1000μg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9994)，檢出限和定量限分別為0.31μg·kg-1和1μg·kg-1，對(duì)空白豬肉進(jìn)行1～50μg·kg-1范圍的藥物添加回收試驗(yàn)，結(jié)果平均回收率(83.5%～94.9%)、日內(nèi)變異系數(shù)(2.4%～8.1%)和日間變異系數(shù)(3.9%～6.4%)均滿足分析試驗(yàn)要求；該報(bào)道還對(duì)提取溶劑的選擇進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明，相對(duì)于乙酸乙酯和乙腈-水(80+20)，乙腈的提取效果最好，且過程穩(wěn)定易控制。丁宇琦等[12]采用高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了豬肉、雞肉、魚肉和牛肉樣品中地西泮的殘留量；樣品的提取溶劑和凈化小柱與張玉潔等[11]方法相同，提取溶液未經(jīng)正己烷除脂，洗脫溶液為甲醇-乙酸溶液(體積比70+30)，外標(biāo)法定量；該方法質(zhì)譜儀器的檢出限為0.5μg·kg-1，HPLC的檢出限為10.0μg·kg-1；在4種組織樣品中添加15.0μg·kg-1、30.0μg·kg-1、60.0μg·kg-13個(gè)濃度水平下，質(zhì)譜類儀器檢測(cè)的回收率范圍為84.6%～99.0%，精密度(RSD)均小于10%；在4種組織樣品中添加100.0μg·kg-1、300.0μg·kg-1、500.0μg·kg-13個(gè)濃度水平下，液相色譜儀器檢測(cè)的回收率范圍為87.0%～97.3%，精密度(RSD)均小于3.5%。

2.3 色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

色譜質(zhì)譜聯(lián)用法利用質(zhì)譜的定性能力強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)克服了色譜法的不足，提高了分析的靈敏度和準(zhǔn)確性，具有多組分同時(shí)分析和微量分析等優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)工作中被廣泛應(yīng)用。

譚磊等[13]報(bào)道了采用UPLC-MS/MS測(cè)定豬肉中地西泮殘留量，樣品在全程嚴(yán)格避光操作的條件下，經(jīng)乙酸鈉溶液和β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，用碳酸鈉-酸氫鈉緩沖溶液和乙酸乙酯提取凈化，電噴霧離子源負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量；該方法的檢出限為0.048μg·kg-1，線性范圍為1～30ng·mL-1(r=0.999578)；在添加濃度為1.00μg·kg-1、2.00μg·kg-1、4.00μg·kg-13個(gè)濃度水平下，方法的變異系數(shù)分別為7.82%、4.79%和8.14%，方法的回收率范圍為81.00%～96.00%、70.50%～81.50%和77.00%～89.75%。

宿書芳等[14]報(bào)道了采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水產(chǎn)品中地西泮殘留量，樣品經(jīng)乙腈提取，Prime HLB固相萃取小柱凈化，在正離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式檢測(cè)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量；該方法在0.1～10ng·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.99)，檢出限為0.5μg·kg-1；通過在黃花魚和蝦樣品中做添加回收試驗(yàn)，得出該方法在1.5μg·kg-1、3.0μg·kg-1、15.0μg·kg-1添加濃度水平下，回收率范圍為88.2%～101.1%，方法的日內(nèi)和日間精密度均小于10%；該研究還對(duì)提取方式、提取溶劑、凈化方式、SPE規(guī)格和上樣溶液的選擇、濃縮方式和基質(zhì)效應(yīng)等關(guān)鍵因素進(jìn)行了考察與評(píng)價(jià)。

何連軍等[15]以通過型固相萃取柱Captiva EMR-Lipid(EMR)為凈化手段，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中地西泮殘留量；該方法通過內(nèi)標(biāo)法定量，檢出限為0.03μg·kg-1，在2μg·kg-1、4μg·kg-1、10μg·kg-13個(gè)添加濃度水平下，草魚、中華鱉、南美白對(duì)蝦、大黃魚和貽貝樣品組織的的添加回收范圍為90.9%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%～6.68%。

崔瑞霞等[16]報(bào)道了物源性食品中地西泮殘留快速篩的方法，樣品經(jīng)乙二胺四乙酸二鈉溶液螯合后，加入5mL乙腈渦旋離心，取乙腈層經(jīng)Cleanert LipoNo凈化后，取上清液乙腈層過濾上機(jī)，采用UPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析；該方法出檢出限為0.05μg·kg-1，定量限為0.15μg·kg-1，在0.1～20ng·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9997)；在1μg·kg-1添加濃度水平下，分別對(duì)牛蛙、雞蛋、羊肉、鯽魚等樣品進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，回收率在93.1%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.4%～6.7%。曾軍杰等[17]報(bào)道了水產(chǎn)品樣品經(jīng)分散固相萃取技術(shù)進(jìn)行前處理，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定樣品中地西泮殘留量。該方法的檢出限和定量限分別為0.5μg·kg-1和1.0 μg·kg-1，在0.5～50μg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.997)，添加樣品的平均回收率為92.5%～95.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.2%～7.3%。張璇等[18]報(bào)道了采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水產(chǎn)品中地西泮藥物殘留量的方法，樣品加入NaOH(1mol·L-1)溶液后，采用乙酸乙酯提取，C18和PSA分散固相萃取材料進(jìn)行凈化，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中添加內(nèi)標(biāo)的方法進(jìn)行定量分析；該方法地西泮藥物的檢出限為0.5μg·kg-1。在1μg·kg-1、5μg·kg-1、10μg·kg-1添加濃度水平下，分別對(duì)鳊魚等14種水產(chǎn)品樣品進(jìn)行地西泮藥物的加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度(加標(biāo)回收率)和精密度均滿足分析要求，對(duì)不同種類的水產(chǎn)品適用性較好。

綜上所述，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物性食品中地西泮殘留量，樣品采用液液萃取、固相萃取小柱和QuEChERS分散固相萃取等方式凈化，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)電噴霧離子源正離子模式和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。樣品的前處理方式各不不同，但方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，檢出限高(0.03～0.5μg·kg-1)，能滿足實(shí)驗(yàn)室殘留分析檢測(cè)要求。

3 小結(jié)

在地西泮殘留檢測(cè)過程中，快速高效的前處理方法和定性定量能力好的檢測(cè)技術(shù)起著至關(guān)重要的作用。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因其高靈敏度、準(zhǔn)確度和高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物性食品中地西泮殘留檢測(cè)。另外，固相萃取小柱凈化和QuEChERS分散固相萃取凈化方法因其操作簡(jiǎn)便，快速、高效、穩(wěn)定性好，在地西泮殘留檢測(cè)的前處理中展現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。