鄭鑫鑫，黃青*

（1.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230031；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究生院科學(xué)島分院，安徽 合肥 230026）

超氧陰離子是一種活性氧，是細(xì)胞中氧分子受單一電子還原的產(chǎn)物[1-3]，它能夠通過細(xì)胞擴(kuò)散，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等眾多的生理活動，在細(xì)胞的氧化還原代謝中發(fā)揮著重要作用。超氧陰離子在細(xì)胞內(nèi)能夠通過超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）轉(zhuǎn)化為H2O2，但是當(dāng)生物體內(nèi)產(chǎn)生過多的超氧陰離子，超過細(xì)胞所能調(diào)節(jié)的范圍時，可能會引起細(xì)胞壞死、DNA損傷、脂質(zhì)過氧化等。隨著時間的推移，甚至?xí)?dǎo)致神經(jīng)退行性疾病、糖尿病等慢性疾病的發(fā)生[1，4-5]。因此，當(dāng)機(jī)體受到外界不良條件的刺激（如紫外線、環(huán)境污染等）產(chǎn)生過量的超氧陰離子時需要借助外源性物質(zhì)來清除。

蝦青素，又名蝦黃質(zhì)，是一種含氧類胡蘿卜素，其具有脂溶性，不溶于水，可溶于有機(jī)溶劑。蝦青素含有多個共軛雙鍵及2 個含氧的α-羥基酮六元環(huán)，能通過向自由基提供電子或接受自由基未配對電子，淬滅自由基發(fā)揮其抗氧化作用[6-7]。蝦青素可以分為人工合成的蝦青素和天然來源的蝦青素。利用化學(xué)方法合成的蝦青素易于大規(guī)模生產(chǎn)，已成為蝦青素市場的主要組成部分，但因其利用率低及安全性問題限制了其在醫(yī)療、保健以及化妝品等行業(yè)的應(yīng)用[8-9]。天然蝦青素廣泛分布于自然界，尤其是蝦、蟹等水生動物，以及微藻、酵母等微生物中。雨生紅球藻憑借其高蝦青素含量和所含蝦青素的類型被認(rèn)為是天然蝦青素的最佳來源[6，10-12]。雨生紅球藻來源的蝦青素是一種具有多種生理功能的有效抗氧化劑，被廣泛應(yīng)用于健康食品和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[9]。

蝦青素是自然界最強(qiáng)的抗氧化劑之一，能有效清除自由基和活性氧，其抗氧化活性是玉米黃質(zhì)、葉黃素、β-胡蘿卜素的10 倍，是α-生育酚的100 倍[10]。雖然蝦青素的抗氧化作用是公認(rèn)的，但是以往研究大都關(guān)注蝦青素的總體抗氧化能力，而很少探究其針對某一種活性氧或自由基的作用，比如蝦青素對超氧陰離子的作用。對于抗氧化劑的總抗氧化能力的衡量，一般采用氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）測定法[13-16]，它常用于活性物種（如親水過氧基、親脂過氧基、過氧亞硝基、超氧陰離子等）的檢測，但并不區(qū)分對某一種自由基的作用。目前缺乏簡單、經(jīng)濟(jì)實惠的方法檢測蝦青素對超氧陰離子的清除作用。有研究者利用電子自旋共振（electron spinresonance spectroscopy，ESR）法或液質(zhì)聯(lián)用的方法檢測蝦青素或其衍生物對超氧陰離子的作用[17-18]，但這些方法所用到的儀器價格昂貴，不適合常規(guī)的檢測。而其他用于測定抗氧化劑超氧陰離子清除活性的方法，如熒光法[19]、細(xì)胞色素c 還原法[20]、氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）法[21]等，除了對檢測設(shè)備具有一定的要求，還需要特殊的生物制劑。相比這些方法，利用鄰苯三酚自氧化法檢測抗氧化劑的超氧陰離子清除能力是一種經(jīng)濟(jì)實用的方法。該方法利用鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化，產(chǎn)生超氧陰離子的同時，在325 nm 附近會出現(xiàn)一個特征吸收峰，而超氧陰離子又可以進(jìn)一步促進(jìn)鄰苯三酚的氧化，隨著氧化反應(yīng)的深入，該峰的吸收逐漸變強(qiáng)，當(dāng)產(chǎn)生的超氧陰離子被清除后，反應(yīng)被抑制，其在325 nm 附近的吸收就會減少[22-24]。所以，可以根據(jù)325 nm 附近特征吸收峰的變化判斷溶液中超氧陰離子的量的多少，從而判斷抗氧化劑對超氧陰離子的清除作用。鄰苯三酚自氧化法最早由Marklund 為SOD 而設(shè)計[22，25]，后來由于方法的優(yōu)越性被廣泛用于檢測抗氧化劑對超氧陰離子的清除作用。但蝦青素不溶于水，而傳統(tǒng)的鄰苯三酚自氧化法的溶液體系為水相，不適合蝦青素的檢測，因此本研究在傳統(tǒng)的鄰苯三酚自氧化法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，定量檢測蝦青素對超氧陰離子的清除效果，并與典型的抗氧化劑β-胡蘿卜素、維生素C 和α-生育酚進(jìn)行對比，以期為檢測蝦青素等脂溶性抗氧化劑對超氧陰離子的清除作用提供一種簡便可行的方法，同時也為蝦青素的抗氧化應(yīng)用提供一定的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鄰苯三酚（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司；鹽酸、無水乙醇（優(yōu)級純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris-HCl：合肥志宏泰克生物技術(shù)有限公司；α-生育酚（＞99%）、維生素C（≥99%）：生工生物工程（上海）股份有限公司；β-胡蘿卜素（≥97%）、蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（≥97%）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；天然蝦青素（10%）：云南紅青夫生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計（UV-2550）：日本島津公司；電子天平（ALC-110.4）：德國Acculab 公司；超純水機(jī)（RM-220）：美國艾科浦國際有限公司；渦旋儀（MXF）：美國Scilogex 公司。

1.3 方法

1.3.1 測量原理

蝦青素對超氧陰離子清除能力的檢測采用鄰苯三酚自氧化法。該方法利用鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化，產(chǎn)生超氧陰離子的同時，在325 nm 附近會出現(xiàn)一個特征吸收峰，根據(jù)特征吸收峰的變化判斷溶液中超氧陰離子的量的多少，從而判斷抗氧化劑對超氧陰離子的清除作用[22-24]。

1.3.2 測量方法的改進(jìn)

一般通過鄰苯三酚自氧化法檢測抗氧化劑對超氧陰離子的清除作用多采用偏堿性的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）或Tris-HCl 等水相溶液作為反應(yīng)體系[26-29]，這種方法更適合于水溶性抗氧化劑的檢測，而蝦青素是一種脂溶性抗氧化劑，不溶于水，因此常規(guī)方法不適合蝦青素。有研究者利用正丁醇飽和水溶液作為Tris-HCl 的溶劑改進(jìn)鄰苯三酚自氧化法用于對脂溶性抗氧化劑的檢測[22]，而在試驗的過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以正丁醇飽和的水溶液作為Tris-HCl 的溶劑時，加入微量鄰苯三酚即可使溶液變渾濁，嚴(yán)重影響檢測結(jié)果。天然蝦青素能較好地溶解于無水乙醇中，而β-胡蘿卜素和α-生育酚皆可溶解于無水乙醇中，因此，向反應(yīng)中引入無水乙醇可解決蝦青素及其他抗氧化劑的溶解性問題。

利用1 mmol/L 的鹽酸制備成濃度為30 mmol/L 的鄰苯三酚溶液。分別向5 mL 的離心管中加入900、1 200、1 500、1 800、2 250 μL 無水乙醇，然后利用pH 8.0 的Tris-HCl 緩沖液補(bǔ)足至2 975 μL，混合均勻后，加入25 μL 30 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，使無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、75%，充分混合后立即在200～750 nm 的范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光吸收光譜的掃描，每隔3 min 掃描1 次，試驗共進(jìn)行9 min，考察反應(yīng)溶液在325 nm 附近的吸收變化。

1.3.3 蝦青素及其它抗氧化劑對超氧陰離子清除能力的測定

精密稱取一定質(zhì)量的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成不同濃度的蝦青素溶液，然后利用紫外可見分光光度計測量其在最大吸收峰處的吸收值，根據(jù)測得的數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取一定質(zhì)量的天然蝦青素、β-胡蘿卜素、α-生育酚和維生素C 標(biāo)準(zhǔn)品，利用無水乙醇分別制備濃度為600 μmol/L 的蝦青素母液、濃度為120 μmol/L 的β-胡蘿卜素母液、濃度為12.5mmol/L 的α-生育酚母液，制備濃度為11.25 mmol/L 的維生素C水溶液，用于后續(xù)試驗。具體方法如下：向5 mL 的離心管中依次加入pH8.0 的Tris-HCl 緩沖液，不同濃度的蝦青素溶液或β-胡蘿卜素、維生素C、α-生育酚溶液，一定體積的無水乙醇，混合均勻后，加入25 μL 30 mmol/L的鄰苯三酚溶液，充分混合后立即在200～750 nm 的范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光吸收光譜的掃描，每隔3 min 掃描1 次，試驗共進(jìn)行9 min，考察反應(yīng)溶液在325 nm 附近的吸收變化，記為ΔA。蝦青素等抗氧化劑對超氧陰離子的清除率（R，%）按照以下公式進(jìn)行計算。

式中：ΔAct為不加樣品時反應(yīng)溶液在325 nm 處吸光度的變化量；ΔAs為加入樣品溶液后反應(yīng)溶液在325 nm 處吸光度的變化量；T 為反應(yīng)時間，9 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗采用Origin 2021b、Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并分析作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 無水乙醇對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的影響

不同無水乙醇濃度對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的影響見圖1。

圖1 無水乙醇對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)影響的紫外可見光吸收光譜Fig.1 Ultraviolet-visible absorption spectra of the effect of ethanol on pyrogallol autoxidation

由圖1 可知，反應(yīng)混合液在325 nm 附近吸光度在0～9 min 內(nèi)均隨著無水乙醇濃度的增加而降低，這表明無水乙醇會抑制反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)無水乙醇濃度較大時，鄰苯三酚自氧化反應(yīng)被明顯抑制，產(chǎn)生的超氧陰離子較少，不利于后續(xù)的清除試驗，因此，選擇無水乙醇濃度30%用于后續(xù)的試驗。

2.2 不同濃度的蝦青素對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的影響

圖2 為不同濃度的蝦青素對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的影響。通過蝦青素對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的抑制作用間接判斷其清除超氧陰離子的抗氧化能力。

圖2 不同濃度蝦青素對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)影響的紫外可見光吸收光譜Fig.2 Ultraviolet-visible absorption spectra of the effect of astaxanthin with different concentrations on the autoxidation ofpyrogallol

由圖2 可知，與不加蝦青素相比，當(dāng)蝦青素的終濃度為4 μmol/L 時，鄰苯三酚的自氧化產(chǎn)物在325 nm附近的特征吸收峰的變化較小，說明該濃度的蝦青素對反應(yīng)條件下鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)抑制作用不明顯。隨著蝦青素濃度的增加，鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的程度有所降低，當(dāng)蝦青素的濃度為8 μmol/L 時，在325 nm附近的特征吸收峰的變化最小，鄰苯三酚從0 min 到9 min 內(nèi)自氧化反應(yīng)的進(jìn)程被顯著抑制，說明該濃度的蝦青素能明顯清除超氧陰離子。

2.3 不同抗氧化劑對超氧陰離子的清除能力

為了進(jìn)一步量化4 種抗氧化劑對超氧陰離子的清除能力，對它們在9 min 內(nèi)的超氧陰離子清除率與其濃度的關(guān)系進(jìn)行線性擬合，并計算出各自清除超氧陰離子作用的線性回歸方程，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 抗氧化劑的濃度與超氧陰離子清除率關(guān)系的擬合曲線Fig.3 Fitting curve of the relationship between the concentration of antioxidants and superoxide anion scavenging rate

由圖3 可知，蝦青素、β-胡蘿卜素、維生素C 和α-生育酚的超氧陰離子清除率與其濃度關(guān)系的線性回歸方程分別為y=2.021 7x-0.481 4，R2=0.987 1；y=0.527 2x+0.061 3，R2=0.996 2；y=2.270 1x-0.414 3，R2=0.995 3；y=0.071 4x-0.054 4，R2=0.997 8。由此可見，不同濃度的抗氧化劑與其清除率之間的線性關(guān)系良好。

2.4 不同抗氧化劑對超氧陰離子清除作用的半數(shù)效應(yīng)濃度

根據(jù)抗氧化劑各自的線性回歸方程分別計算出其超氧陰離子清除率的半數(shù)效應(yīng)濃度（median effective concentration，EC50），從而判斷不同抗氧化劑抗氧化能力的強(qiáng)弱，結(jié)果見表1。

表1 不同抗氧化劑對超氧陰離子清除作用的EC50 Table 1 EC50 of different antioxidants for scavenging superoxide anion μmol/L

由表1 可知，當(dāng)pH8.0 的Tris-HCl 與無水乙醇的體積比為7∶3，鄰苯三酚的終濃度為0.25 mmol/L 時，蝦青素、β-胡蘿卜素、維生素C 和α-生育酚對超氧陰離子清除作用的半數(shù)效應(yīng)濃度分別為25.0、94.7、22.2 μmol/L 和701.0 μmol/L。蝦青素對超氧陰離子的清除作用的EC50與維生素C 接近，明顯小于β-胡蘿卜素和α-生育酚，這說明清除相同數(shù)量的超氧陰離子所需的蝦青素或維生素C 的濃度較小，所需的β-胡蘿卜素或α-生育酚的濃度較大，由此可見，蝦青素對超氧陰離子的清除作用與維生素C 接近，明顯高于β-胡蘿卜素和α-生育酚，在本試驗條件下，其清除超氧自由基的能力是β-胡蘿卜素的3.8 倍，是α-生育酚的28.0 倍。由于反應(yīng)條件的不同，這與先前研究者檢測的β-胡蘿卜素和維生素C 對超氧陰離子的清除作用不完全一致[22]，但對于抗氧化劑之間清除能力的比較，本研究與前人的試驗結(jié)果是一致的，說明本研究檢測方法可靠。

3 結(jié)論

在本研究中，利用改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法檢測蝦青素對超氧陰離子的清除作用，結(jié)果表明，蝦青素的超氧陰離子清除能力與維生素C 接近，明顯高于β-胡蘿卜素和α-生育酚。本研究不僅提供了一種測定蝦青素抗氧化能力的方法，而且為蝦青素的抗氧化應(yīng)用提供了一定的試驗依據(jù)。