徐陽(yáng)，辛嘉英，2*，王雨晴，王貴儒，尹一

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000）

過(guò)氧化鈣（CaO2）是一種常見(jiàn)的無(wú)機(jī)化合物，為淡黃色粉末，難溶于水，易溶于乙醚等有機(jī)溶劑，是常見(jiàn)的化工原料，在食品開(kāi)發(fā)、加工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在食品工業(yè)領(lǐng)域還可用作小麥粉增白劑、殺菌劑等[1-3]，天然小麥粉一般呈乳白色或黃色，且不易加工成面團(tuán)[4]，而將過(guò)氧化鈣添加到小麥粉中，既可以提高面筋韌性，還可以有效提高小麥粉的色澤，由于CaO2作為小麥粉添加劑會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成潛在危險(xiǎn)，如食用過(guò)量會(huì)刺激腸道、誘發(fā)癌癥等[5]，自2011 年，我國(guó)衛(wèi)生部門(mén)已經(jīng)全面禁止在小麥粉中添加過(guò)氧化鈣[6]，為了防止一些生產(chǎn)廠商以此獲得利益，進(jìn)一步保障食品安全，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，小麥粉中過(guò)氧化鈣的檢測(cè)受到越來(lái)越多的關(guān)注及重視。常用的過(guò)氧化鈣檢測(cè)方法有物理法、化學(xué)法等[7-8]，但這些方法在操作時(shí)通常會(huì)產(chǎn)生無(wú)法避免的誤差，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果誤差較大、準(zhǔn)確度低。因此，酶法檢測(cè)被廣泛開(kāi)發(fā)。其中，過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）及其模擬酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品和生物領(lǐng)域[9-10]，應(yīng)用前景良好。

張玉榮等[11]提出酶法檢測(cè)小麥粉中CaO2含量，利用辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）為生物催化劑，HRP 是常見(jiàn)的天然過(guò)氧化物酶，CaO2與硫酸反應(yīng)可生成H2O2，在碘化鉀（KI）的存在下，HRP 可催化H2O2氧化季胺，使其快速生成一種黃色物質(zhì)，從而對(duì)小麥粉中CaO2進(jìn)行定量分析。此方法具有較高的精密度、準(zhǔn)確度及高靈敏度，但HRP 是天然過(guò)氧化物酶，易受外界環(huán)境因素如溫度、pH 值的影響。在一般的酶催化反應(yīng)進(jìn)程中，溫度越高，反應(yīng)速度越快，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，天然酶會(huì)失活，降低反應(yīng)溫度，反應(yīng)速度也會(huì)下降。在上述反應(yīng)體系中，酸化后的溶液需將溶液pH 值調(diào)節(jié)至中性，在中性條件下，檢測(cè)才能進(jìn)行，這導(dǎo)致試驗(yàn)操作更加繁瑣、效率降低，從而存在一定局限性[12]。因此，使用穩(wěn)定性好、溫度和pH 值范圍廣的模擬酶替代天然酶，成為實(shí)現(xiàn)酶法檢測(cè)小麥粉中CaO2的關(guān)鍵。

甲烷氧化菌是一類(lèi)以甲烷為能量來(lái)源及碳源的細(xì)菌，甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）是一種由甲烷氧化菌發(fā)酵分泌的菌素，具有抗氧化、抗菌作用[13-15]。它是一種小分子熒光肽，對(duì)銅有很強(qiáng)的親和力[16]，Mb可以通過(guò)其來(lái)自2 個(gè)惡唑酮環(huán)的氮和來(lái)自2 個(gè)烯硫醇基團(tuán)的硫來(lái)配位單個(gè)Cu（II）離子[17]，且與Cu 配位后具有良好的過(guò)氧化物酶活性，配位后的Mb-Cu 能在更寬的溫度和pH 值范圍內(nèi)催化反應(yīng)[18]。Xin 等[19]基于在Mb-Cu 的催化下，H2O2能快速氧化苯酚和4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine，4-AAP）生成紅色醌亞胺的原理，建立了一種新的催化體系檢測(cè)小麥粉中CaO2。Mb 非常穩(wěn)定，在酸性介質(zhì)及50 ℃下也能保持良好的催化活性[20]。因此試驗(yàn)過(guò)程可省略調(diào)節(jié)pH 值這一步驟。此條件下，Mb 表現(xiàn)出較高的POD 活性，此檢測(cè)方法速度更快、操作過(guò)程更簡(jiǎn)單，并且試驗(yàn)結(jié)果良好、準(zhǔn)確度高，已成功應(yīng)用于小麥粉中過(guò)氧化鈣的測(cè)定。季胺是一類(lèi)可測(cè)定多種物質(zhì)的靈敏試劑，可作為底物被過(guò)氧化氫氧化從而顯色，并且可很好地溶于微酸性水溶液[21-22]，由于過(guò)氧化鈣在酸性介質(zhì)中可生成H2O2，因此季胺作為底物可更好地應(yīng)用于小麥粉中過(guò)氧化鈣的檢測(cè)。

基于Mb-Cu 的良好POD 活性，本文建立了Mb-Cu-KI-季胺新體系，利用Mb-Cu 催化過(guò)氧化氫氧化季胺顯色的原理檢測(cè)小麥粉中CaO2含量并優(yōu)化反應(yīng)條件，方法操作簡(jiǎn)單、速度快，可應(yīng)用于小麥粉CaO2的檢測(cè)，為小麥粉中過(guò)氧化鈣的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉：市售；甲烷氧化菌：清華大學(xué)環(huán)境生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供；甲烷（99.99%）：哈爾濱黎明氣體有限公司；甲醇、季胺（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；大孔樹(shù)脂：美國(guó)Supelco 公司；五水合硫酸銅（分析純）：汕頭市西隴化工工廠有限公司；過(guò)氧化鈣（75%）：上虞潔華化工有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）：蘇州力坤精細(xì)化工有限公司；碘化鉀（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；濃硫酸（分析純）：北京化學(xué)試劑公司；試驗(yàn)用水均為二級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；FDU-1200 冷凍干燥機(jī)：東京理化器械公司；HL-2S 恒流泵：上海滬西分析儀器廠；HDL 組合式紫外檢測(cè)器：上海金達(dá)公司；BLBI0-HYG-FJ2 生物反應(yīng)器搖床：上海百侖生物科技有限公司；RV8V 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA 公司；BCD-215GM 冰箱：合肥美的電冰箱有限公司；DF-101S 磁力攪拌器：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；HWS24 電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；800XL 顏色掃描器：上海中晶科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甲烷氧化菌素的分離與純化

參考文獻(xiàn)[13]的方法，配制無(wú)機(jī)鹽（nitrate mineral salt，NMS）培養(yǎng)基，以甲基彎菌（Methylosinus trichosporium）OB3b 為菌種，使用NMS 培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行121 ℃高溫滅菌、換氣，時(shí)間為5～6 d，將得到的發(fā)酵液離心30 min（8 000 r/min，4 ℃），離心后所得到的菌液上清液經(jīng)已活化的大孔樹(shù)脂吸附，在組合式紫外檢測(cè)器的檢測(cè)下，用60%甲醇溶液對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，獲得Mb，通過(guò)34 ℃、130 r/min 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，液體狀Mb 再經(jīng)過(guò)冷凍干燥后得到粉末狀Mb，放入-30 ℃冰箱中備用。

1.3.2 Mb-Cu 的制備

將凍干后的Mb 配制成各個(gè)濃度的溶液置于比色皿中，放入紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，使用微量進(jìn)樣器向比色皿中每隔30 s 加入5 μL 濃度為10 nmol/L 的CuSO4溶液，觀察紫外光譜曲線，當(dāng)曲線逐漸趨于一致時(shí)，減少CuSO4溶液的加入量，改為加入2 μL，直至曲線峰型不再變化，Mb-Cu 制備完成。

1.3.3 過(guò)氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)量1.55 g 過(guò)氧化鈣，加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的稀硫酸，磁力攪拌4 min，轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶，蒸餾水定容，再稀釋100 倍，獲得0.1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取3 只10 mL 比色管，分別加入0、0.5、1.0 mL CaO2標(biāo)準(zhǔn)使用液，再依次加入100 μL 季胺溶液、15 μL KI溶液、2 mL 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、Mb-Cu 溶液，蒸餾水定容至10 mL，置于50 ℃恒溫水浴中10 min，進(jìn)行紫外全光譜掃描。

1.3.5 反應(yīng)條件的選擇

以Mb-Cu 濃度（1.5×10-5～7.5×10-5mol/L）、季胺用量（0～200 μL）、KI 用量（0～30 μL）、反應(yīng)溫度（30～70 ℃）、體系pH 值（1～5）、反應(yīng)時(shí)間（0～20 min）為變量，探討其對(duì)催化反應(yīng)體系顯色的影響。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取標(biāo)準(zhǔn)工作液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 加入到10 mL 比色管中，再分別加入0.02 mol/L 季胺溶液60 μL、0.05 mol/L KI 溶液12 μL、50 μL Mb-Cu 溶液以及2 mL PBS 緩沖溶液（0.2 mol/L，pH4.7），蒸餾水定容至10 mL。50 ℃恒溫水浴10 min，于462 nm 處測(cè)定其吸光度，以過(guò)氧化鈣濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制過(guò)氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 精密度與準(zhǔn)確度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)量1 g 小麥粉，加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的稀硫酸，攪拌均勻后，加蒸餾水定容至100 mL，混合均勻后轉(zhuǎn)入離心管，以5 000 r/min 離心10 min，離心結(jié)束后吸取上清液8 mL，依次加入100 μL 季胺、15 μL KI、50 μL Mb-Cu 溶液、2 mL PBS 緩沖溶液，再于50 ℃水浴中反應(yīng)10 min，于462 nm 處測(cè)定其吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比可讀出過(guò)氧化鈣的含量。加標(biāo)濃度為100、200、400 mg/kg，試驗(yàn)以不添加過(guò)氧化鈣的小麥粉作為空白樣品，試驗(yàn)重復(fù)6 次，測(cè)定方法的精密度與準(zhǔn)確度。過(guò)氧化鈣含量的計(jì)算公式如下。

式中：C 為小麥粉中過(guò)氧化鈣含量，μg/g；c 為標(biāo)準(zhǔn)曲線中過(guò)氧化鈣的濃度，mg/L；m 為樣品質(zhì)量，g；10 為定容體積，L；100 為稀釋倍數(shù)。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制備

在最佳條件下進(jìn)行顯色后，使用顏色掃描器收集顯色后的圖像，使用Photoshop 將顏色按照漸變規(guī)律合成圖像，制備過(guò)氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)比色卡。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)6 次，采用SPSS 19.0 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析，采用Origin 8.5 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mb 的表征

Mb 呈淡黃色液體，其在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的檢測(cè)下吸收光譜如圖1 所示。

由圖1 可知，在258、302、338、398 nm 四處有明顯吸收峰，表明Mb 結(jié)構(gòu)完整。

2.2 Mb-Cu 的結(jié)合

圖2 為Mb-Cu 配位的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。

圖2 Mb-Cu 配位的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.2 UV-visible absorption spectrum of Mb-Cu complex

由圖2 可知，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的檢測(cè)下，隨著Cu2+的加入，在338 nm 和398 nm 處的吸收峰值逐漸下降，說(shuō)明Cu2+分別與Mb 中的4-羥基-5-硫酰咪（4-hydroxy-5-thioimidazole，HTI）和4-硫酰-5-羥基咪唑（4-thioyl-5-hydroxyimidazole，THI）結(jié)合，398 nm處吸收峰值降低說(shuō)明Cu2+與THI 中的S 原子配位；338 nm 處吸收峰值降低表明Cu2+與HTI 基團(tuán)中的S原子配位。當(dāng)338 nm 和398 nm 處的吸收峰值下降停止時(shí)，表明配位結(jié)束，Mb 與Cu 配位完成，結(jié)合為Mb-Cu。

2.3 反應(yīng)機(jī)理

CaO2與硫酸反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，在Mb-Cu 的催化下，以KI 為增敏劑可加快反應(yīng)速度，提高反應(yīng)效率，季胺作為反應(yīng)底物被氧化并伴有顯黃色反應(yīng)，試驗(yàn)反應(yīng)方程式如下。

總反應(yīng)（1）+（2）+（3）+（4）+（5）為：

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

圖3 為紫外光譜吸收曲線。

圖3 紫外光譜吸收曲線Fig.3 UV absorption spectra of the color system

如圖3 所示，不含CaO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的曲線趨勢(shì)平穩(wěn)，無(wú)吸收峰出現(xiàn)，而含有CaO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的2 條曲線在462 nm 處均出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰，且隨著CaO2標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的增加，其吸光度也隨之增大，說(shuō)明在462 nm 處該顯色體系具有較高靈敏度，因此，測(cè)定波長(zhǎng)為462 nm。

2.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.5.1 Mb-Cu 濃度對(duì)顯色的影響

Mb-Cu 濃度對(duì)反應(yīng)顯色的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 Mb-Cu 濃度對(duì)顯色的影響Fig.4 Influence of the Mb-Cu concentration on the absorbancy

由圖4 可知，當(dāng)Mb-Cu 濃度在0～4.5×10-5mol/L時(shí)，吸光度隨著Mb-Cu 濃度的增加而增大，說(shuō)明Mb-Cu 濃度越高，酶促反應(yīng)進(jìn)行的越快，當(dāng)Mb-Cu 濃度超過(guò)4.5×10-5mol/L 時(shí)，吸光度呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)酶促反應(yīng)已經(jīng)結(jié)束，當(dāng)Mb-Cu 的濃度為4.5×10-5mol/L時(shí)，體系吸光度最高，因此Mb-Cu 的最適濃度為4.5×10-5mol/L。

2.5.2 季胺用量對(duì)顯色的影響

季胺用量對(duì)顯色的影響如圖5 所示。

圖5 季胺用量對(duì)顯色的影響Fig.5 Influence of the quaternary ammonium dosage on the absorbancy

季胺作為反應(yīng)底物，其用量在一定程度上會(huì)影響反應(yīng)顯色，如圖5 所示，在季胺用量為0～60 μL 時(shí)，吸光度迅速增加，此時(shí)，季胺用量與吸光度成正比，吸光度隨底物的增加而增大，當(dāng)季胺用量超過(guò)60 μL 時(shí)，吸光度呈下降趨勢(shì)，此時(shí)，酶以及增敏劑消耗完畢，底物過(guò)多會(huì)造成吸光度降低，因此，試驗(yàn)選取季胺用量為60 μL。

2.5.3 KI 用量對(duì)顯色的影響

KI 用量對(duì)顯色的影響如圖6 所示。

圖6 KI 用量對(duì)顯色的影響Fig.6 Influence of the KI dosage on the absorbancy

KI 在體系中為增敏劑，可增加體系靈敏度，提高反應(yīng)速度，如圖6 所示，在0～12 μL 時(shí)，吸光度快速增加，說(shuō)明在此區(qū)間內(nèi)，KI 與反應(yīng)速度成正比；在12～18 μL時(shí)，體系吸光度達(dá)到較高水平，此時(shí)反應(yīng)已達(dá)到飽和；超過(guò)18 μL 時(shí)，吸光度逐漸降低，因此試驗(yàn)選取KI 用量為12 μL。

2.5.4 反應(yīng)溫度對(duì)顯色的影響

反應(yīng)溫度對(duì)顯色的影響如圖7 所示。

圖7 反應(yīng)溫度對(duì)顯色的影響Fig.7 Influence of reaction temperature on the absorbancy

酶催化反應(yīng)中，反應(yīng)溫度對(duì)酶催化速度產(chǎn)生重要影響，模擬酶通?？梢酝ㄟ^(guò)提高反應(yīng)溫度加快反應(yīng)速度，比天然酶更耐高溫。由圖7 可知，吸光度隨著溫度的升高而增加，50 ℃時(shí)到達(dá)最高，且溫度過(guò)高M(jìn)b-Cu可能發(fā)生部分變性，最終導(dǎo)致失活，高溫也易發(fā)生副反應(yīng)，因此試驗(yàn)選擇50 ℃作為反應(yīng)溫度。

2.5.5 pH 值對(duì)顯色的影響

pH 值對(duì)顯色的影響如圖8 所示。

圖8 pH 值對(duì)顯色的影響Fig.8 Influence of pH on the absorbancy

由圖8 可知，催化反應(yīng)需要在適宜pH 值環(huán)境下進(jìn)行，本試驗(yàn)選取pH 值范圍為1～5，采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值，結(jié)果表明，pH 值對(duì)顯色體系影響較小，可忽略不計(jì)，說(shuō)明Mb-Cu 模擬酶不易受環(huán)境因素影響。因此，模擬酶催化反應(yīng)可省略調(diào)節(jié)pH 值這一過(guò)程，使試驗(yàn)更加簡(jiǎn)便。

2.5.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色的影響如圖9 所示。

圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色的影響Fig.9 Influence of reaction time on the absorbancy

由圖9 可知，體系吸光度在反應(yīng)10 min 時(shí)達(dá)到最大，10 min 后幾乎不變，因此反應(yīng)時(shí)間為10 min。

2.5.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在最佳反應(yīng)條件下，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖10 所示。

圖10 CaO2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 CaO2 standard curve

由圖10 可知，體系中的CaO2濃度為0～10 mg/L時(shí)，CaO2濃度與462 nm 處的吸光度呈正相關(guān)。線性方程為y=0.078 1x+0.019 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6。計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.75×10-4，檢出限（limit of detection，LOD）為1.82×10-2mg/L（相當(dāng)于2.25 mg/kg 小麥粉）。

2.5.8 精密度與準(zhǔn)確度

加標(biāo)回收結(jié)果如表1 所示。

表1 加標(biāo)回收結(jié)果（n=6）Table 1 Results of spike recovery（n=6）

由表1 可知，平均加標(biāo)回收率為99.21%～100.35%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.31%～1.22%，試驗(yàn)結(jié)果表明上述檢測(cè)小麥粉中過(guò)氧化鈣含量的方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

2.5.9 標(biāo)準(zhǔn)比色卡

過(guò)氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)比色卡如圖11 所示。根據(jù)反應(yīng)后的顏色變化，可直接將過(guò)氧化鈣含量與標(biāo)準(zhǔn)色卡進(jìn)行比較，實(shí)現(xiàn)過(guò)氧化鈣含量的可視化檢測(cè)。

圖11 CaO2 標(biāo)準(zhǔn)比色卡Fig.11 CaO2 standard colorimetric card

3 結(jié)論

本文建立并優(yōu)化了甲烷氧化菌素模擬酶催化顯色法測(cè)定小麥粉中過(guò)氧化鈣的方法，根據(jù)過(guò)氧化鈣與硫酸反應(yīng)生成過(guò)氧化氫的原理，利用Mb-Cu 模擬過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫，并在碘化鉀存在的條件下氧化季胺顯色，建立了對(duì)小麥粉中過(guò)氧化鈣含量測(cè)定的目視比色法，本方法可操作性強(qiáng)、操作步驟簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠，適用于過(guò)氧化鈣的檢測(cè)。