王磊，張潔，張文馨，崔曉雅

（天津市食品安全檢測(cè)技術(shù)研究院，天津 300308）

克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.），原名為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），2008 年被重新命名劃分為克羅諾桿菌屬，目前共包括7 個(gè)種，是一種革蘭氏陰性無芽胞桿菌，有鞭毛，兼性厭氧，廣泛存在于自然環(huán)境中。阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是該菌屬中最主要的一種條件致病菌，其具有一定的耐熱和耐干燥性，可以在水分含量較低的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間存活，極易在加工生產(chǎn)過程中對(duì)嬰兒配方奶粉造成污染，繼而造成新生兒和嬰幼兒的嚴(yán)重感染[1-3]。為應(yīng)對(duì)此類風(fēng)險(xiǎn)，我國(guó)在現(xiàn)行食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)克羅諾桿菌屬的限量進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定，同時(shí)對(duì)相應(yīng)的檢驗(yàn)方法也作出了要求。傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法較為復(fù)雜，包括增菌、分離、純化、鑒定等步驟，檢驗(yàn)周期過長(zhǎng)的問題限制了其在實(shí)時(shí)快速監(jiān)測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

免疫磁珠分離技術(shù)基于抗原抗體反應(yīng)及磁力學(xué)原理，可以將目標(biāo)微生物從成分復(fù)雜的樣品基質(zhì)中分離出來并保持其生物活性，具有縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢出率等優(yōu)勢(shì)。該項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)已被應(yīng)用于金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌等多種細(xì)菌的檢測(cè)中，與實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附、量子點(diǎn)熒光標(biāo)記等其它分析手段的聯(lián)合研究也取得了良好的進(jìn)展[4-7]。目前用于檢測(cè)致病性大腸埃希氏菌、沙門氏菌、單增李斯特氏菌等致病菌的免疫磁珠已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化，但大多數(shù)為國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品[8]，價(jià)格較高，不易于普及，因此國(guó)產(chǎn)高質(zhì)量的致病菌免疫磁珠生產(chǎn)工藝亟待發(fā)展。對(duì)于該技術(shù)在檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌方面的應(yīng)用，重點(diǎn)則在于突破增菌等前處理環(huán)節(jié)耗時(shí)長(zhǎng)和實(shí)際樣品污染水平低的問題[9-10]，因此制備高特異性免疫磁珠和選擇合適的后續(xù)技術(shù)與之相匹配，成為了需要解決的核心關(guān)鍵點(diǎn)。

本研究利用阪崎克羅諾桿菌顆?？乖庖咝挛魈m大耳兔，獲得特異性多克隆抗體，將抗體純化后，與經(jīng)過活化的納米級(jí)羧基磁珠偶聯(lián)結(jié)合，制備免疫磁珠，并對(duì)其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。以此為基礎(chǔ)，對(duì)免疫磁珠的選擇性捕獲能力進(jìn)行研究，改進(jìn)傳統(tǒng)前處理方式，選用顯色培養(yǎng)基作為后續(xù)分離材料，開發(fā)出免疫磁珠-顯色平板檢測(cè)方法，對(duì)其實(shí)際應(yīng)用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。以期建立一種高特異性、高靈敏度的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)嬰兒配方食品中阪崎克羅諾桿菌的快速定量分析，同時(shí)為免疫磁珠技術(shù)結(jié)合其它檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰兒配方奶粉：市售；新西蘭大耳兔：山東艾萊克生物科技有限公司；Affimag PSC 磁性微球（羧基修飾，0.1～0.5 μm）：天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心；阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）ATCC29544、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC9027、單核細(xì)胞增生增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115：美國(guó)模式菌種收集中心；鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）CMCC（B）50115、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）CMCC（B）44103：中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、嗎啉乙磺酸一水合物[2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid monohydrate，MES]、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 [1-ethyl-3-（3-dimethyllaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC]、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GNP-9270 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MaxQ 6000 制冷型搖床、Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo 公司；WGZ-2-XJ 型細(xì)菌濁度計(jì)：上海昕瑞儀器儀表有限公司；Dynabeads MX Mixer 磁珠混合儀：Life Technologies 公司；Centrifuge 5417R 臺(tái)式離心機(jī)：Eppendorf 公司；明澈-D 24 UV 型超純水機(jī)：美國(guó)Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 多克隆抗體的制備

將阪崎克羅諾桿菌顆粒性抗原與佐劑按照體積比1∶1 混合，免疫劑量為106CFU/只。采用耳緣靜脈注射方式，每隔21 d 對(duì)4 只健康雌性新西蘭大耳兔（3～5 kg 左右）進(jìn)行免疫，連續(xù)4 次，最后1 次免疫完成后進(jìn)行頸動(dòng)脈采血，將所得血液立即注入無菌錐形瓶中，4 ℃過夜，次日4 ℃、5 000 r/min 離心30 min 獲得抗血清。將抗血清加入辛酸和硫酸銨進(jìn)行粗純化[11]，采取Protein A/G 親和層析柱法[12]進(jìn)行二次純化，制得純化后的抗體，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫磁珠的制備與偶聯(lián)條件優(yōu)化

取1 mg 羧基修飾磁性微球至離心管，用500 μL MES 吐溫溶液（0.01 mol/L，pH6.0，0.05%吐溫-20）洗滌3 次。之后分別加入100 μL 的5 mg/mL EDC 和NHS溶液，振蕩保持磁珠懸浮，37 ℃活化45 min，磁分離后去除上清液。最后加入500 μL MES 吐溫溶液重新懸浮并洗滌2 次，去除上清液。

將1 mg 已活化的磁珠與500 μg 多克隆抗體混合，用MES 溶液（0.01 mol/L、pH6.0）調(diào)節(jié)總體積至500 μL，37 ℃振蕩反應(yīng)，期間保持磁珠懸浮，經(jīng)不同反應(yīng)時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）后，磁分離并回收上清液，采用BCA 蛋白測(cè)試盒測(cè)定上清液中剩余抗體含量，根據(jù)公式（1）計(jì)算偶聯(lián)率，確定磁珠與抗體的最佳偶聯(lián)時(shí)間。按以上方法，改變溫度（4、15、25、37、42、45 ℃），反應(yīng)至合適時(shí)間，確定最佳偶聯(lián)溫度；改變抗體添加量（50、100、150、200、250、300、350、400 μg），與磁珠在合適溫度和時(shí)間下反應(yīng)，根據(jù)公式（2）計(jì)算偶聯(lián)量，確定抗體最佳添加量，所有試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。

式中：R 為偶聯(lián)率，%；Ca為偶聯(lián)后上清液抗體濃度，mg/mL；Cb為偶聯(lián)前添加抗體濃度，mg/mL。

式中：Mc為偶聯(lián)量，μg；M 為抗體添加量，μg；R 為偶聯(lián)率，%。

磁珠偶聯(lián)后用500 μL MES 溶液洗滌2 次，加入1 mL 0.04 mol/L 含1%BSA 的硼酸鹽吐溫溶液（pH 9.0，0.05%吐溫-20），重懸磁珠，37 ℃振蕩封閉45 min。最后將磁珠洗滌后，加入200 μL 磷酸鹽吐溫溶液（0.01 mol/L，pH7.4，0.05%吐溫-20），重懸磁珠，4 ℃保存[13-16]。

1.3.3 免疫磁珠敏感性的評(píng)價(jià)

利用比濁法調(diào)整阪崎克羅諾桿菌菌液濃度為1010、109、108、107、106、105、104、103CFU/mL，各取100 μL分別與0.4 mg 的免疫磁珠混合于1.5 mL 無菌離心管中，BPW 定容至1 mL；常溫振蕩反應(yīng)45 min，磁分離3 min，棄上清液，加入0.5 mL 磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4）洗滌磁珠3 次，再加入1 mL 緩沖液振蕩重懸磁珠；將磁珠重懸液稀釋至合適梯度后，取100 μL 涂布于阪崎克羅諾桿菌顯色平板36 ℃、24 h 培養(yǎng)計(jì)數(shù)，每個(gè)免疫磁珠添加量設(shè)置3 個(gè)平行，并以不添加免疫磁珠的菌液為空白對(duì)照，根據(jù)公式（3）計(jì)算捕獲率。

式中：E 為捕獲率，%；N 為磁珠重懸液菌落總數(shù)，CFU/mL；N0為空白對(duì)照液菌落總數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 免疫磁珠特異性的評(píng)價(jià)

將阪崎克羅諾桿菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌菌株于營(yíng)養(yǎng)肉湯36 ℃培養(yǎng)過夜，比濁法調(diào)整菌濃度至106～107CFU/mL，按1.3.3 的方法操作，與免疫磁珠進(jìn)行混合反應(yīng)，磁珠重懸液涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板36 ℃、48 h 培養(yǎng)，計(jì)算捕獲率。

1.3.5 免疫磁珠-顯色平板檢測(cè)方法的建立及對(duì)嬰兒配方奶粉的應(yīng)用

取100 g 市售嬰兒配方奶粉（阪崎克羅諾桿菌陰性）加入到900 mL 緩沖蛋白胨水中，模擬樣品實(shí)際污染情況，接種1 mL 稀釋至相同數(shù)量級(jí)濃度的阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌混合菌液，使樣品目標(biāo)菌及背景菌濃度為102、103、104CFU/g；取0.4 mg 免疫磁珠與1 mL 模擬樣品液均勻混合，按1.3.3 操作，最終將免疫磁珠完全涂布顯色平板，培養(yǎng)并計(jì)算捕獲率。每個(gè)菌濃度設(shè)置3 個(gè)平行，以不添加免疫磁珠的樣品液為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁珠與抗體偶聯(lián)條件優(yōu)化

2.1.1 偶聯(lián)時(shí)間對(duì)偶聯(lián)量的影響

圖1 為偶聯(lián)時(shí)間對(duì)活化磁珠與抗體偶聯(lián)量的影響。

圖1 偶聯(lián)時(shí)間對(duì)偶聯(lián)效果的影響Fig.1 Influence of coupling time on coupling effect

用BCA 法蛋白測(cè)試盒檢測(cè)上清液中剩余抗體的含量，因?yàn)槲舛扰c蛋白質(zhì)濃度成正比[17]，所以用吸光度表征抗體含量，剩余抗體含量越低，則偶聯(lián)效果越好。由圖1 可知，偶聯(lián)時(shí)間在0.5～1.5 h 內(nèi)，上清液剩余抗體量遞減迅速，當(dāng)超過2.0 h 后，上清液抗體量趨向穩(wěn)定，說明結(jié)合到磁珠表面的抗體量在2.0 h 左右達(dá)到飽和。因此，選擇2.0 h 作為活化磁珠與抗體的偶聯(lián)時(shí)間。

2.1.2 偶聯(lián)溫度對(duì)偶聯(lián)量的影響

圖2 為偶聯(lián)溫度對(duì)活化磁珠與抗體偶聯(lián)量的影響。

圖2 偶聯(lián)溫度對(duì)偶聯(lián)效果的影響Fig.2 Influence of coupling temperature on coupling effect

由圖2 可知，在偶聯(lián)溫度為4～15 ℃時(shí)，活化磁珠與抗體之間的偶聯(lián)反應(yīng)受到抑制，吸光度變化不明顯，且觀察到磁珠不易分散，甚至產(chǎn)生顆粒狀沉淀的情況，不利于原料的充分利用。在偶聯(lián)溫度為15～37 ℃時(shí)，吸光度明顯降低，表明偶聯(lián)到磁珠上的抗體量開始增加。當(dāng)偶聯(lián)溫度超過37 ℃，吸光度再次趨向穩(wěn)定，表明偶聯(lián)溫度高于37 ℃時(shí)可有效促進(jìn)抗體在磁珠表面的結(jié)合，達(dá)成最佳反應(yīng)效果，從節(jié)能角度考慮，選擇37 ℃作為偶聯(lián)的最適溫度，同時(shí)37 ℃時(shí)抗體能保持較好活性，制得的免疫磁珠在溶液中分散性良好。

2.1.3 抗體添加量對(duì)偶聯(lián)率和偶聯(lián)量的影響

圖3 和圖4 為抗體添加量對(duì)偶聯(lián)率和偶聯(lián)量的影響。

圖3 抗體添加量與偶聯(lián)率的關(guān)系Fig.3 Relationship between the dosage of antibody and the coupling efficiency

圖4 抗體添加量與實(shí)際偶聯(lián)量的關(guān)系Fig.4 Relationship between the dosage of antibody and the actual coupling amount

由圖3 和圖4 可知，當(dāng)抗體添加量在50～200 μg時(shí)，每毫克活化磁珠偶聯(lián)上的抗體量逐漸增加，當(dāng)抗體添加量大于200 μg 時(shí)，磁珠和抗體的偶聯(lián)率不再上升，并開始下降，此時(shí)1 mg 磁珠實(shí)際結(jié)合的抗體量為182.77 μg，且隨著抗體量的增加而穩(wěn)定在200 μg 左右，不再明顯增加或減少，說明1 mg 磁珠與200 μg 抗體偶聯(lián)已接近飽和狀態(tài)。對(duì)于單位質(zhì)量的磁珠，其表面的活性基團(tuán)有限，在抗體添加到一定程度后，磁珠表面所偶聯(lián)的數(shù)量已達(dá)到最大值，偶聯(lián)量不會(huì)繼續(xù)增加，再加入過多的抗體則造成浪費(fèi)[18]，所以選取200 μg作為偶聯(lián)1 mg 磁珠的最佳抗體添加量。

2.2 免疫磁珠敏感性評(píng)價(jià)

圖5 為不同菌濃度下免疫磁珠對(duì)阪崎克羅諾桿菌的捕獲率。

圖5 菌濃度與捕獲率的關(guān)系Fig.5 Relationship between bacterial concentration and capture efficiency

由圖5 可知，當(dāng)菌濃度對(duì)數(shù)值為1.58（菌濃度為38 CFU/mL）時(shí)，菌體捕獲率較低，僅為54.4%，但免疫磁珠仍能有效分離出目標(biāo)菌，這可能是由于目標(biāo)菌在磁珠清洗和吸取過程中有所損失。當(dāng)菌濃度對(duì)數(shù)值為2.49～7.63（菌濃度為3.12×102～4.24×107CFU/mL）時(shí)，免疫磁珠對(duì)阪崎克羅諾桿菌的捕獲率為68.4%～82.4%，且捕獲效果穩(wěn)定。當(dāng)菌濃度對(duì)數(shù)值大于7.63（菌濃度為4.24×107CFU/mL）時(shí)，實(shí)際捕獲量達(dá)到飽和，捕獲率開始急劇下降，結(jié)果顯示在1 mL 純培養(yǎng)體系中，免疫磁珠有效捕獲目標(biāo)菌的菌濃度范圍為102～107CFU/mL，表明免疫磁珠對(duì)阪崎克羅諾桿菌具有良好的靈敏度。

2.3 免疫磁珠特異性評(píng)價(jià)

圖6 為免疫磁珠和阪崎克羅諾桿菌及各種非目標(biāo)菌的交叉反應(yīng)情況。

圖6 免疫磁珠與各菌種的交叉反應(yīng)情況Fig.6 Cross-reaction of immunomagnetic beads with various bacteria

在菌濃度為106CFU/mL 的條件下，對(duì)免疫磁珠的抗干擾性能進(jìn)行測(cè)定。由圖6 可知，免疫磁珠對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特氏菌交叉反應(yīng)率均低于5%；同時(shí)和大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌存在一定的交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率低于10%，此類和非目標(biāo)菌較低的干擾反應(yīng)，可進(jìn)一步通過其它手段排除影響；而相同條件下，免疫磁珠對(duì)于目標(biāo)菌的有效捕獲率高達(dá)78.8%，具有明顯的優(yōu)勢(shì)性，表明其針對(duì)阪崎克羅諾桿菌的特異性良好。

2.4 免疫磁珠-顯色平板檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用分析

為更好的覆蓋到微量目標(biāo)菌，設(shè)計(jì)保留了樣品接種量、稀釋液[19]等傳統(tǒng)方法框架，并且以制備的高敏感性和特異性免疫磁珠為主體，直接利用富集分離技術(shù)代替國(guó)標(biāo)方法的增菌培養(yǎng)過程。考慮到捕獲過程中與其他背景菌可能產(chǎn)生的交叉反應(yīng)，采用了選擇性較好且結(jié)果直觀的阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基[20]作為后續(xù)分離目標(biāo)菌菌落的載體，從而建立了免疫磁珠-顯色平板檢測(cè)方法，以達(dá)到有效區(qū)分和抑制其他菌株生長(zhǎng)并提高檢出率的目的。

在日常檢測(cè)中，嬰兒配方奶粉中微生物及阪崎克羅諾桿菌的污染水平較低，所以人工污染樣品使其目標(biāo)菌及背景菌濃度達(dá)到102、103、104CFU/g，模擬實(shí)際樣品的檢測(cè)情況。

表1 為免疫磁珠分別在1 mL 目標(biāo)菌純培養(yǎng)體系和模擬樣品體系中對(duì)阪崎克羅諾桿菌的捕獲效果比較。

表1 不同樣品基質(zhì)中免疫磁珠捕獲效果的比較Table 1 Comparison of the capture effect of immunomagnetic beads in different sample matrices

由表1 可知，當(dāng)奶粉中添加的阪崎克羅諾桿菌濃度為104～105CFU/g 時(shí)，免疫磁珠的捕獲率為66.2%，與純培養(yǎng)條件下相比，出現(xiàn)了較大幅度的降低；阪崎克羅諾桿菌濃度為102～104CFU/g 時(shí)，樣品體系中的捕獲率下降幅度較小，維持在70%左右；免疫磁珠在不同基質(zhì)中的捕獲效果存在一定差距，說明其特異性捕獲能力在一定程度上，受到了奶粉樣品基質(zhì)和背景雜菌因素的干擾影響，但其捕獲率仍在有效范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本研究在篩選免疫磁珠的最適反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和抗體添加量時(shí)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)在30～45 ℃時(shí)偶聯(lián)2.0 h即可完成，表明制備工藝對(duì)控制溫度要求并不苛刻，其實(shí)際偶聯(lián)率大于90%，偶聯(lián)量大于180 μg/mg 磁珠，對(duì)抗體的利用程度較高，制備工藝簡(jiǎn)便。在檢測(cè)方面，免疫磁珠具有良好的敏感性，對(duì)阪崎克羅諾桿菌的有效捕獲濃度范圍為102～107CFU/mL，檢測(cè)范圍較為寬泛，有利于在低污染量樣品中使用；此外，所制備的磁珠在交叉反應(yīng)試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性，對(duì)目標(biāo)菌捕獲率高達(dá)78.8%，而對(duì)其它常見細(xì)菌的反應(yīng)率低于10%。當(dāng)以免疫磁珠-顯色平板檢測(cè)方法處理模擬污染樣品時(shí)，在復(fù)雜的背景和基質(zhì)條件下，可直接捕獲收集目標(biāo)菌，在102～105CFU/g 的菌濃度范圍內(nèi)，免疫磁珠捕獲率為65%以上，方法中樣品前處理用時(shí)僅需1～2 h，相比GB 4789.40—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)》中的18 h+24 h 兩次增菌步驟，縮短了該項(xiàng)目的檢測(cè)周期。綜上，本研究建立的檢測(cè)方法對(duì)于快速實(shí)時(shí)監(jiān)控嬰兒配方食品中阪崎克羅諾桿菌具有重要的應(yīng)用價(jià)值。