袁紫晴，陶芷茵，孫曉霞，潘錦蓉，林 沁，林綺琪，鄭倩望＊

1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510640

2 合生元（廣州）健康產(chǎn)品有限公司，廣東廣州 510610

0 引言

牛奶中含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)（尤其是鈣和磷）和多種維生素族群等基礎(chǔ)營養(yǎng)元素，是嬰幼兒發(fā)育重要的營養(yǎng)補(bǔ)充劑，在增強(qiáng)免疫力、提升骨質(zhì)健康上有重要作用。一些隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，青少年日常飲食中補(bǔ)充牛奶可有效增強(qiáng)整個(gè)臀部和脊柱的骨骼密度[1]；12 歲的青春期女性連續(xù)18 個(gè)月每天攝入1 份（568 mL）的全脂或低脂牛奶，可顯著提高骨礦物質(zhì)的獲取能力[2]。還有研究發(fā)現(xiàn)，低免疫力斑馬魚連續(xù)食用一些與牛奶含量相似的乳制品，如低溫酸奶、常溫純牛奶和冷凍酸奶冰淇淋等，4 d后，動(dòng)物體內(nèi)的免疫細(xì)胞，如吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等數(shù)量顯著增加，免疫能力也顯著增強(qiáng)[3]。

兒童成長過程需要補(bǔ)充其他營養(yǎng)元素來滿足發(fā)育需要、提高身體素質(zhì)和增強(qiáng)免疫力。中國《GB19644—2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳粉》規(guī)定了兒童配方奶粉的產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，但與2021年落實(shí)的《GB 10765—2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》有所不同，它針對(duì)大于36月齡以上的人群食用，產(chǎn)品的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)不及嬰幼兒奶粉嚴(yán)格[4]。一般來講，配方食品中蛋白質(zhì)、碳水化合物含量的要求，目的是讓兒童能更科學(xué)、更均衡地生長，避免體重過度增長[5]。如在兒童配方奶粉中添加功能性物質(zhì)，例如低聚半乳糖、乳鐵蛋白和二十二碳六烯酸（DHA）等。低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是一種常見的益生元，能刺激人體腸道益生菌群生長，促進(jìn)對(duì)礦物質(zhì)吸收，從而調(diào)節(jié)人體骨骼發(fā)育，增強(qiáng)免疫能力[6，7]。乳鐵蛋白是來自母乳中的一種活性成分，能與鐵離子結(jié)合[8]，顯著提升人體免疫能力和改善機(jī)體營養(yǎng)結(jié)構(gòu)[9，10]。另外，飲食中合理添加DHA也能有效提高機(jī)體免疫功能[11]。

調(diào)查顯示，市面上的兒童奶粉很少在原料上添加GOS等活性物質(zhì)[12，13]。因臨床試驗(yàn)周期長、構(gòu)建模型難度大準(zhǔn)確度低，所以本研究使用了更加方便精準(zhǔn)的動(dòng)物試驗(yàn)，對(duì)比兩款奶粉在體重、骨密度、骨強(qiáng)度、血清鈣和增強(qiáng)大鼠免疫力的作用情況，從而為該年齡段兒童提供更科學(xué)、優(yōu)良的配方奶粉。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

21 只4 周齡SD雄性大鼠，飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SYXK（粵）2022-0136；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明編號(hào)為No.00317301。飼料為輻照滅菌實(shí)驗(yàn)鼠生長繁殖飼料，除雞肉粉、魚粉、豆粕等粗糧外，還添加一些微量元素、維生素。

喂養(yǎng)奶粉為委托方公司提供的合生元兒童成長奶粉（金蓋）（簡稱“金蓋組”）和合生元兒童成長奶粉（藍(lán)蓋）（簡稱“藍(lán)蓋組”）。

大鼠白細(xì)胞介素2（Interleukin，IL-2）ELISA試劑盒、大鼠免疫球蛋白M（Immunoglobulin，IgM）ELISA試劑盒、大鼠骨鈣素（Osteocalcin BGP）OCN ELISA試劑盒、大鼠組織蛋白酶K（Cathepsin-K，Cath-K）ELISA試劑盒、大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）ELISA試劑盒，泉州睿信生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Super Nova?Micro-CT，平山醫(yī)療科技（昆山）有限公司；動(dòng)物牽拉系統(tǒng)Electroforce 323，美國TA儀器沃斯特公司；超純水系統(tǒng)FastPure-B，聯(lián)羽有限公司；臺(tái)式離心機(jī)，德國艾本德有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 奶粉的配方和營養(yǎng)成分

金蓋組配料表：全脂乳粉、脫脂乳粉、固體玉米糖漿、乳糖、低聚半乳糖、二十二碳六烯酸油脂（DHA）、乳鐵蛋白、酒石酸氫膽堿、?；撬?、動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12（活性益生菌的活菌數(shù)≥1×106CFU/g）、醋酸視黃酯、膽鈣化醇、dl-α-醋酸生育酚、植物甲萘醌、硝酸硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、氰鈷胺、L-抗壞血酸鈉、煙酰胺、葉酸、D-泛酸鈣、D-生物素、碳酸鈣、檸檬酸鈣、硫酸銅、硫酸亞鐵、碳酸鎂、硫酸錳、亞硒酸鈉、檸檬酸鋅。

藍(lán)蓋組配料表：全脂乳粉、脫脂乳粉、固體玉米糖漿、乳糖、二十二碳六烯酸油脂（DHA）、酒石酸氫膽堿、牛磺酸、動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12（活性益生菌的活菌數(shù)≥1×106CFU/g）、醋酸視黃酯、膽鈣化醇、dl-α-醋酸生育酚、植物甲萘醌、硝酸硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、氰鈷胺、L-抗壞血酸鈉、煙酰胺、葉酸、D-泛酸鈣、D-生物素、碳酸鈣、檸檬酸鈣、硫酸銅、硫酸亞鐵、碳酸鎂、硫酸錳、亞硒酸鈉、檸檬酸鋅。

兩款奶粉的成分區(qū)別主要為：金蓋組含有低聚半乳糖，而藍(lán)蓋組不含；藍(lán)蓋組中的DHA含量比金蓋組高出90.5%。

合生元兒童成長奶粉（金蓋）和合生元兒童成長奶粉（藍(lán)蓋）的營養(yǎng)成分如表1所示。

表1 金蓋組和藍(lán)蓋組營養(yǎng)成分表

1.3.2 動(dòng)物試驗(yàn)及采食量和體重記錄

21 只4 周齡SD雄性大鼠進(jìn)入動(dòng)物房后隨機(jī)分為3 組，分別為對(duì)照組、奶粉組（金蓋組和藍(lán)蓋組），每組7 只進(jìn)行1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)，自由采食及飲水，每天進(jìn)行12 h 交替光照，室內(nèi)溫度設(shè)置為恒溫（24±2）℃。適應(yīng)性喂養(yǎng)后對(duì)大鼠進(jìn)行為期8 周的奶粉補(bǔ)充。

奶粉每天現(xiàn)配現(xiàn)用。分別稱取金蓋組、藍(lán)蓋組適量加入50 ℃溫水中，使其終濃度為300 mg/mL，具體灌胃劑量根據(jù)大鼠體重增長情況調(diào)整，為2～3 mL/次，灌胃時(shí)間為每天9：00及15：00。

每天記錄大鼠采食量，每周記錄大鼠體重。

1.3.3 樣品采集

對(duì)大鼠注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉處理，取大鼠全血，在4 ℃下4000 r/min離心10 min，吸取上清液得到血清，放入-20 ℃待測(cè)。測(cè)量大鼠體長（鼻尖至肛門），取兩側(cè)股骨，剔除多余肌肉筋膜及結(jié)締組織后放于10%的福爾馬林固定液中待測(cè)。

1.3.4 大鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)測(cè)量

將保存于固定液中的股骨取出，通過Micro-CT掃描影像系統(tǒng)對(duì)股骨的骨小梁和骨皮質(zhì)部分進(jìn)行掃描。測(cè)量計(jì)算得出骨密度、骨小梁分離度、骨小梁厚度、骨皮質(zhì)厚度。采用三點(diǎn)彎曲測(cè)定大鼠股骨骨強(qiáng)度。

1.3.5 血清中對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)的測(cè)量

取存于-20 ℃的待測(cè)大鼠血清，采用生化方法測(cè)得樣品中的鈣磷含量，并且采用 ELISA試劑盒測(cè)定大鼠血清鈣含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，試驗(yàn)相關(guān)結(jié)果以平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）表示；采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用S-N-K和LSD事后檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶粉干預(yù)對(duì)大鼠體重、體長及攝食量的影響

由圖1A和圖1B可知，三組大鼠的體重和體長均無顯著差異。與該品系雄性大鼠體重相比（試驗(yàn)周期第8 周時(shí)，大鼠周齡為12 周，參考體重為460 g），三組大鼠體重均處于該品系大鼠正常范圍的上限，并未顯現(xiàn)超重、營養(yǎng)不良癥狀。

圖1 兩款奶粉干預(yù)對(duì)大鼠體重、體長及大鼠每日攝食量的影響

三組大鼠的飼料攝食量變化結(jié)果如圖1C可知，與對(duì)照組相比，兩款奶粉組大鼠的飼料攝食量下降。含有GOS的金蓋組下降幅度更大，并有顯著差異性，但三組的大鼠體重均處于正常水平且無明顯差異。張園園指出，GOS作為一種益生元能增強(qiáng)大鼠飽腹感，減少大鼠對(duì)飼料進(jìn)食[14]，從而避免大鼠肥胖風(fēng)險(xiǎn)。而奶粉本身含有能量和蛋白質(zhì)等其他營養(yǎng)元素足以支撐健康發(fā)育，所以大鼠降低飼料攝入沒有出現(xiàn)體重下降或因食量減少而誘導(dǎo)其他健康問題。

2.2 奶粉組干預(yù)對(duì)大鼠骨強(qiáng)度和骨密度的影響

三點(diǎn)彎曲原理是將待測(cè)樣品放在兩個(gè)支撐點(diǎn)上，向中點(diǎn)施加一個(gè)向下的載荷，當(dāng)3 個(gè)接觸點(diǎn)在樣品上形成2 個(gè)相等的力矩時(shí)即發(fā)生三點(diǎn)彎曲，樣品的中點(diǎn)處隨即斷裂（圖2）。該原理也適合測(cè)量生物的骨骼強(qiáng)度，是研究骨骼生物力學(xué)性能的重要檢測(cè)手段。

圖2 三點(diǎn)彎曲力學(xué)示意圖

骨強(qiáng)度是人體抗骨折能力的評(píng)估指標(biāo)，代表骨的韌性和載荷能力。骨強(qiáng)度提高時(shí)，可減少骨折的發(fā)生可能。本試驗(yàn)利用三點(diǎn)彎曲測(cè)量3 組大鼠的兩側(cè)股骨骨強(qiáng)度，結(jié)果如圖3-A所示。與對(duì)照組相比，奶粉組結(jié)果均有提高，其中金蓋組大鼠股骨骨強(qiáng)度比對(duì)照組增加了15.2%，藍(lán)蓋組比對(duì)照組增加了4.1%。該結(jié)果說明了兩種奶粉都能有效增強(qiáng)大鼠的股骨骨強(qiáng)度。

圖3 兩款奶粉干預(yù)對(duì)大鼠股骨骨強(qiáng)度和骨密度的影響

本試驗(yàn)采用Micro-CT分別掃描大鼠股骨骨皮質(zhì)及骨小梁，得到骨密度（3B和3C）。結(jié)果顯示，奶粉組大鼠的骨皮質(zhì)骨密度和骨小梁骨密度與對(duì)照組相比，均無顯著性差異（P＞0.05），說明兩款奶粉對(duì)骨皮質(zhì)骨密度及骨小梁骨密度增強(qiáng)效果不明顯。

2.3 奶粉組對(duì)大鼠骨代謝的影響

雖然骨密度是影響骨強(qiáng)度和骨折的主要因素，但大多數(shù)患有脆骨病患者的骨密度數(shù)值變化在合理范圍內(nèi)波動(dòng)[15]，只從骨密度數(shù)值變化判斷骨骼健康情況不精確，應(yīng)從骨骼的微觀結(jié)構(gòu)探究其對(duì)骨折是否產(chǎn)生重要影響。

對(duì)采用Micro-CT掃描大鼠股骨骨皮質(zhì)及骨小梁的結(jié)果進(jìn)一步分析，得到骨小梁厚度、骨皮質(zhì)厚度、骨小梁分離度及結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（圖4）。由圖4A可知，奶粉組均顯著增加大鼠的骨小梁厚度，其中藍(lán)蓋組比對(duì)照組增加25.7%，金蓋組比對(duì)照組增加20.8%。三組大鼠的骨皮質(zhì)厚度結(jié)果如圖4B所示，與對(duì)照組相比，奶粉組在骨皮質(zhì)厚度方面沒有顯著變化；在骨小梁分離度方面，由圖4C可知，與對(duì)照組相比，奶粉組都減少了大鼠的骨小梁分離度，其中金蓋組骨小梁分離度降低23.6%，與對(duì)照組具有顯著性差異，而藍(lán)蓋組和對(duì)照組沒有顯著性差異。

圖4 奶粉組對(duì)大鼠骨代謝的影響

骨皮質(zhì)和骨小梁的結(jié)構(gòu)關(guān)系如圖5所示。骨皮質(zhì)和骨小梁是人體骨骼的重要結(jié)構(gòu)，兩者相互依存。骨皮質(zhì)（紅色區(qū)域）為骨小梁提供堅(jiān)硬的外部保護(hù)，骨小梁（白色區(qū)域）為骨皮質(zhì)提供內(nèi)部支撐。當(dāng)骨皮質(zhì)骨厚度和骨小梁厚度增加時(shí)，骨小梁的分離度隨之下降，而骨骼的硬度增強(qiáng)，發(fā)生骨折的概率降低。其中，骨小梁骨密度是骨代謝的反映指標(biāo)[16]，當(dāng)骨密度增加時(shí)，骨合成代謝大于分解代謝，反之亦然。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)中，皆反映大鼠骨骼強(qiáng)度增強(qiáng)（圖4A、4B、4C），且奶粉干預(yù)組的大鼠骨小梁骨密度增加（圖3C），說明奶粉攝入有利于大鼠骨骼的合成代謝。

圖5 骨皮質(zhì)和骨小梁的結(jié)構(gòu)關(guān)系

本試驗(yàn)用結(jié)構(gòu)模型指數(shù)SMI定義骨小梁的板狀和桿狀程度，即對(duì)于擁有相同厚度的骨小梁，通過其“板”和“桿”的形態(tài)分析骨骼疏松情況，其數(shù)值介于0～3之間。當(dāng)骨小梁為板狀結(jié)構(gòu)時(shí)，SMI為0，桿狀時(shí)為3。當(dāng)骨骼發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，骨小梁結(jié)構(gòu)則從板狀轉(zhuǎn)為桿狀，SMI值也隨之增大[17]。由圖4D可知，與對(duì)照組相比，奶粉組對(duì)大鼠股骨的結(jié)構(gòu)模型指數(shù)影響沒有顯著性差異。

2.4 奶粉組對(duì)大鼠血清鈣磷含量和IgM含量的影響

骨骼是人體的重要器官，能為人體結(jié)構(gòu)提供移動(dòng)性和支撐性，也是鈣磷等礦物質(zhì)的主要儲(chǔ)庫[18]。本文采用生化分析方法檢測(cè)大鼠血清中的鈣磷含量，得到結(jié)果如圖6A、6B所示。兩款奶粉添加對(duì)對(duì)大鼠血清磷含量沒有影響，但是血清鈣含量在奶粉組出現(xiàn)下降，這是由于試驗(yàn)所使用的大鼠生長維持飼料是高鈣配方，鈣含量比兩款兒童奶粉更高，所以對(duì)照組因攝食量較奶粉干預(yù)組高，鈣含量更高。由于奶粉補(bǔ)充后提高大鼠的飽腹感，大鼠采食量降低，所以奶粉組的血清鈣含量降低。值得注意的是，盡管金蓋組大鼠的攝食量顯著低于藍(lán)蓋組（圖1C），但其血清鈣離子濃度卻高于藍(lán)蓋組，而兩者的配方中鈣含量是一致的（表1）。推測(cè)是由于金蓋組中添加2%的GOS，而之前也有研究提示額外補(bǔ)充GOS能促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收[19]。

圖6 奶粉組對(duì)大鼠血清磷鈣含量和IgM含量的影響

IgM是B細(xì)胞抗原受體的主要成分，是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，所以通常作為體液免疫的指標(biāo)。分析結(jié)果可知（圖6C），藍(lán)蓋組和金蓋組大鼠的IgM值比對(duì)照組分別提高8.5%和5.9%，對(duì)大鼠的免疫調(diào)節(jié)都有一定效果，但藍(lán)蓋組的調(diào)節(jié)效果更強(qiáng)。該結(jié)果可能與藍(lán)蓋組中DHA有關(guān)，由表1可知，藍(lán)蓋組中DHA的含量比金蓋組高出90.5%。而DHA是調(diào)節(jié)體液免疫功能的主要基礎(chǔ)物質(zhì)[20]，所以藍(lán)蓋組對(duì)機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)功能對(duì)比其他兩組有著顯著的效果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以合生元（廣州）健康產(chǎn)品有限公司提供的合生元兒童成長奶粉（金蓋組）和合生元兒童成長奶粉（藍(lán)蓋組）為例子，評(píng)估食用配方奶粉和不額外食用配方奶粉、兩款奶粉中含有乳鐵蛋白和GOS分別對(duì)大鼠的體重、骨密度、骨強(qiáng)度、血清鈣及機(jī)體免疫的影響。最后得出兩款合生元兒童奶粉對(duì)大鼠骨骼生產(chǎn)、機(jī)體免疫能力都有正向作用，由此推斷兩款兒童奶對(duì)兒童骨骼、免疫發(fā)育可能起到促進(jìn)作用。