侯延生,王春光,汪貞貞,楊維曉

(河南灣流生物科技有限公司,河南 洛陽 471003)

飼料添加劑可以使飼料更好地發(fā)揮功效,彌補飼料營養(yǎng)不平衡,改善畜禽的質(zhì)量,對畜禽的生長和疾病的預(yù)防都有著積極意義[1]。牛在飼養(yǎng)過程中會遇到發(fā)生胃腸炎等癥狀,引發(fā)牛胃腸炎的因素多種多樣,如飼料變質(zhì)、衛(wèi)生條件差、病菌入侵等[2]。有研究發(fā)現(xiàn),牛胃中脲酶水解尿素生成氨的速率過快,無法與揮發(fā)性脂肪酸的生成速度匹配,會導(dǎo)致氨在瘤胃中吸收入血,降低反芻動物對尿素氮的利用,可造成動物氨中毒[3]。牛胃中氨過多導(dǎo)致的氨中毒會損傷胃壁細(xì)胞,進而導(dǎo)致牛發(fā)生胃腸炎[4],如果有一種藥物分子既能夠抑制脲酶的活性,又能夠提高牛的免疫力[5],對牛類飼養(yǎng)具有很重要的意義。

喹啉類化合物是重要的萘系含氮雜環(huán)化合物,因其具有廣泛的生物活性,被廣泛應(yīng)用于藥物及其他活性物質(zhì)的研發(fā)中,是許多農(nóng)藥和醫(yī)藥的重要的骨架,如抗生素、抗瘧藥等[6-7]。由于喹啉環(huán)具有很強的生物活性,因此可以在其結(jié)構(gòu)中引入不同的官能團來改變其活性[8]。例如在醫(yī)藥方面厄洛替尼和?？颂婺徇€有吉非替尼就是具有喹啉結(jié)構(gòu)的經(jīng)典臨床藥物[9]。我們團隊聯(lián)合南開大學(xué),利用?？颂婺峤Y(jié)構(gòu)上具有端基炔的結(jié)構(gòu)特點,通過點擊反應(yīng)得到一系列結(jié)構(gòu)新穎的化合物,該類化合物針對IDO1具有良好的抑制效果。希望該類化合物能夠在開發(fā)飼料添加劑中也有所應(yīng)用,所以在喹啉結(jié)構(gòu)上設(shè)計了結(jié)構(gòu)新穎的化合物,希望對IDO1和脲酶都具有抑制作用。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

DF-102S恒溫加熱磁力攪拌器(河南予華儀器);YRE-2020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南予華儀器);Bruker AV400型核磁共振儀(布魯克公司)。

N-Boc-3,4-二羥基苯胺(98%,偶合化學(xué));2-氯乙基甲基醚(99%,國藥集團);三光氣(95%,阿拉丁試劑);三氯氧磷(98%,國藥集團);4-碘苯胺(99%,阿拉丁試劑);三氟甲磺酸銅(98%,國藥集團);對甲苯磺酰肼(98%,國藥集團);1-氨基吡啶碘(98%,國藥集團);2,4-二(三氟甲基)苯乙醛(98%,偶合化學(xué));其余試劑均為市售分析純。

1.2 合成方法

1.2.1 3,4-二(2-甲氧乙氧基)苯胺的合成

在反應(yīng)瓶中把N-Boc-3,4-二羥基苯胺23 g和碳酸鉀14 g加入到N,N-二甲基甲酰胺400 mL中,在氮氣保護下加熱至90 ℃攪拌30 min,然后再緩慢加入溶有2-氯乙基甲基醚25 g的N,N-二甲基甲酰胺溶液200 mL,在90 ℃條件下繼續(xù)反應(yīng)14 h,TLC監(jiān)控N-Boc-3,4-二羥基苯胺反應(yīng)完全,使用油泵真空蒸除N,N-二甲基甲酰胺約500 mL,然后把濃縮物加入二氯甲烷500 mL中,攪拌均勻后在0～10 ℃條件下加入2 mol/L的鹽酸500 mL,攪拌反應(yīng)5 h,分出有機相,水相再用二氯甲烷150 mL 萃取反應(yīng)液4次,合并有機相,有機相再用氫氧化鈉飽和溶液調(diào)節(jié)pH值為8,分出有機相,有機相經(jīng)干燥后濃縮得到3,4-二(2-甲氧乙氧基)苯胺20.72 g;LC-MS(ESI):m/z 242 [M+H]+。

1.2.2 3,4-二(2-甲氧乙氧基)苯甲脒的合成

在反應(yīng)瓶中把3,4-二(2-甲氧乙氧基)苯胺24 g加入甲酰胺400 mL中,再加入甲酸銨20 g,在氮氣氛圍下,緩慢加熱至140 ℃,反應(yīng)16 h,TLC監(jiān)控3,4-二(2-甲氧乙氧基)苯胺反應(yīng)完全,冷卻至室溫,向反應(yīng)液中加入乙酸乙酯800 mL和水600 mL,攪拌1 h,然后分出有機相,再用乙酸乙酯200 mL萃取水相多次,合并有機相用飽和的氯化鈉溶液300 mL洗滌兩次,經(jīng)無水硫酸鎂干燥后在真空條件下濃縮后得到3,4-二(2-甲氧乙氧基)苯甲脒22.09 g;LC-MS(ESI):m/z 269[M+H]+。

1.2.3 6,7-二甲氧乙氧基喹唑啉-4-酮的合成

在帶有氮氣保護和溫控裝置的反應(yīng)瓶中,把3,4-二(2-甲氧乙氧基)苯甲脒27 g加入氯仿500 mL中,攪拌均勻后降溫至0 ℃,緩慢滴加溶有三光氣36 g的氯仿300 mL,保持溫度穩(wěn)定,滴加完后攪拌1 h,濃縮反應(yīng)液,在通過反復(fù)多次加入環(huán)己烷和乙腈的混合溶液200 mL(體積比為2∶1),真空蒸除進而除去反應(yīng)體系中殘余的水份和三光氣的副產(chǎn)物,最后向濃縮的反應(yīng)體系中加入四氫呋喃400 mL和乙醚200 mL的混合液,在氮氣保護下,加入碘化鋁4.2 g,0～10 ℃的條件下,攪拌均勻后保持氮氣環(huán)境,緩慢滴加溶有三氟化硼乙醚20 g的乙醚溶液100 mL,滴加完全后攪拌反應(yīng)1 h,再向反應(yīng)體系中加入氯化硼2.4 g,保持氮氣氛圍,反應(yīng)溫度控制在不超過10 ℃,滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 h,升至室溫,過濾反應(yīng)液,過濾后真空濃縮蒸除有機溶劑后加入苯和環(huán)己烷和丙酮的混合溶液400 mL(體積比為1∶1∶2),加熱至回流,然后趁熱過濾,后放至0 ℃結(jié)晶,抽濾后固體經(jīng)硅膠柱層析分離得到6,7-二甲氧乙氧基喹唑啉-4-酮19.58 g;LC-MS(ESI):m/z 295 [M+H]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):δ7.97(s,1H),7.47(s,1H),7.16(s,1H),4.27～4.19(m,4H),3.74～3.70(m,4H),3.37～3.35(m,6H)。

1.2.4 4-氯-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉的合成

在帶有攪拌的反應(yīng)瓶中把6,7-二甲氧乙氧基喹唑啉-4-酮30 g和三氯氧磷100 g加入到N,N-二甲基甲酰胺600 mL中,攪拌均勻后緩慢升溫至110 ℃,攪拌4.5 h反應(yīng)結(jié)束,在0～10 ℃條件下加入飽和碳酸氫鈉溶液800 mL,攪拌20 min,用二氯甲烷300 mL萃取多次,合并有機相,然后用飽和食鹽水200 mL洗滌一次,再用水100 mL洗滌多次,用無水硫酸鈉干燥后濃縮得到4-氯-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉26.43 g;LC-MS(ESI):m/z 313 [M+H]+。

1.2.5 4-胺基-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉的合成

在反應(yīng)瓶中把3,4-二(2-甲氧乙氧基)苯胺24 g加入二氯乙烷400 mL中,再加入N-氯代丁二酰亞胺15 g,加熱至回流反應(yīng)5 h后濃縮反應(yīng)液并加入N,N-二甲基甲酰胺500 mL中,再加入甲酰胺5 g和氫氧化鋇17 g和磷酸二氫鉀14 g,緩慢加熱至100 ℃,攪拌反應(yīng)5 h,然后降溫至50 ℃加入甲酰胺10 g和二(三苯基膦)二氯化鈀2.4 g和碘化鉀8.5 g和四氫呋喃200 mL,在氮氣氛圍下,緩慢加熱至90 ℃攪拌反應(yīng)7 h,真空蒸除四氫呋喃,然后把剩余的反應(yīng)體系倒入水800 mL中,攪拌過濾,向濾液中加入乙酸乙酯800 mL,攪拌30 min后分出有機相,有機相用飽和的氯化鈉溶液300 mL洗滌兩次,經(jīng)無水硫酸鎂干燥后在真空條件下濃縮后得到4-胺基-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉27.11 g;LC-MS(ESI):m/z 294[M+H]+。

1.2.6N-(4-乙酮苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧基)-4-喹啉胺的合成

在帶有攪拌的反應(yīng)瓶中,把4-氯-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉31 g加入N,N-二甲基甲酰胺1 000 mL中,再加入4-碘苯胺22 g,加熱至80 ℃,反應(yīng)5 h,然后降至室溫后加入醋酸鈀3.4 g和三苯基膦13 g和三乙胺10 g,在氮氣保護下,室溫條件下緩慢滴加溶有乙烯氧基三甲基硅烷17.5 g的二甲基亞砜溶液200 mL,保持室溫條件緩慢滴加,滴加完全后在氮氣保護下升溫至90 ℃反應(yīng)5 h,再次降至室溫,過濾反應(yīng)液,濾液中加入水1 000 mL攪拌,然后用二氯甲烷400 mL萃取多次,合并有機相,真空濃縮蒸除有機溶劑后經(jīng)硅膠柱層析分離得到N-(4-乙酮苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧基)-4-喹啉胺31.17 g;1H NMR(600 MHz,CDCl3):11.43(s,1H),8.89(s,1H),8.41(s,1H),8.09～8.07(m,2H),7.95(d,J=12.0Hz,2H),7.40(s,1H),4.41～4.36(m,4H),3.80～3.76(m,4H),3.39(s,3H),3.36(s,3H),2.65(s,3H)。

1.2.7N-(3-乙酮苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧基)-4-喹啉胺的合成

在反應(yīng)瓶中把4-胺基-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉30 g加入N,N-二甲基甲酰胺1 200 mL中,再加入1,3-二碘苯33 g,加熱至60 ℃,反應(yīng)1 h后加入醋酸鈀3.4 g和三苯基膦13 g 和三乙胺10 g,在氮氣保護下,室溫條件下,緩慢滴加溶有乙烯基丁基醚20 g的二甲基亞砜溶液250 mL,保持室溫條件緩慢滴加,在氮氣保護下升溫至120 ℃反應(yīng)2.5 h,再次降至室溫,過濾反應(yīng)液,濾液中加入水1 400 mL,然后用二氯甲烷500 mL萃取多次,合并有機相,真空濃縮蒸除有機溶劑后經(jīng)硅膠柱層析分離得到N-(3-乙酮苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧基)-4-喹啉胺38.67 g;LC-MS(ESI): m/z 412 [M+H]+;1H NMR (600 MHz,DMSO-d6):δ11.05 (s,1H),8.86 (s,1H),8.21 (s,1H),8.16 (s,1H),8.00～7.98 (m,1H),7.92 (d,J=12.0 Hz,1H),7.68～7.66 (m,1H),7.30 (s,1H),4.36～4.32 (m,4H),3.81～3.78 (m,4H),3.38 (s,3H),3.37 (s,3H),2.64 (s,3H)。

1.2.8 目標(biāo)化合物A的合成

在帶有攪拌和分水器的反應(yīng)瓶中,把N-(4-乙酮苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧基)-4-喹啉胺41 g和碘化鉀17 g加入苯1 000 mL中,攪拌10 min加入三氟甲磺酸銅18 g,攪拌10 min后緩慢滴加溶有三氯氧磷19 g的苯溶液200 mL,加熱至回流,通過分水器除去反應(yīng)體系中的水,反應(yīng)8.5 h,然后過濾反應(yīng)液,真空濃縮除去大部分溶劑,然后倒入二氯甲烷1 000 mL中,攪拌狀態(tài)下用碳酸鈉飽和溶液調(diào)節(jié)體系pH值為中性,分出有機相,有機相用水洗滌多次,然后濃縮后加入二甲基亞砜1 000 mL中,加入對甲苯磺酰肼19 g和1-氨基吡啶碘22.5 g和碘17 g,加熱至100 ℃攪拌反應(yīng)1h,然后把反應(yīng)液倒入水1 200 mL中,用二氯甲烷500 mL萃取多次,合并有機相,濃縮后經(jīng)硅膠柱層析分離提純得到化合物A 37.82 g; LC-MS(ESI): m/z 435[M+H]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ11.73 (s,1H),9.79～9.76 (m,1H),9.05 (s,1H),8.46 (s,1H),8.09～8.07 (m,1H),7.86 (s,1H),7.55 (s,1H),7.49 (t,J1=6.0Hz,J2=6.0 Hz,1H),4.35～4.32 (m,4H),3.79～3.76 (m,4H),3.38 (s,3H),3.36 (s,3H)。

1.2.9 目標(biāo)化合物B的合成

在帶有攪拌和分水器的反應(yīng)瓶中把4-胺基-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉30 g和碳酸鉀14 g加入苯1 200 mL中,再加入2,4-二(三氟甲基)苯乙醛26 g,加熱至100 ℃,反應(yīng)1 h后加入碘化鉀3.4 g和三氟甲磺酸銅18 g,在氮氣保護下,保持室溫條件緩慢滴加溶有三氯氧磷19 g的苯溶液200 mL,然后在氮氣保護下升溫至回流,通過分水器除去反應(yīng)體系中的水,反應(yīng)7.5 h降至室溫,過濾反應(yīng)液,濾液中加入水1 400 mL,然后用二氯甲烷500 mL萃取多次,合并有機相,真空濃縮蒸除有機溶劑后經(jīng)硅膠柱層析分離得到化合物B 32.18 g;LC-MS(ESI): m/z 530[M+H]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ9.27 (s,1H),7.99 (s,1H),7.67～7.64 (m,2H),7.56 (s,1H),7.48 (d,J= 6.0 Hz,1H),7.45 (s,1H),4.36～4.32 (m,4H),3.77～3.74 (m,4H),3.39 (s,3H),3.37 (s,3H)。

1.2.10 目標(biāo)化合物C的合成

在帶有攪拌和分水器的反應(yīng)瓶中,把4-氯-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉31 g加入乙醇1 000 mL中,在0 ℃條件下,緩慢滴加水合肼50 g,滴加完后保持溫度不超過10 ℃反應(yīng)1.5 h,置于0 ℃攪拌過濾,再加入乙醇1 000 mL中,再加入三乙胺10 g和2-氟-4-溴-苯甲醛20 g,在氮氣保護下,加熱至回流反應(yīng)5h,真空濃縮后加入苯1 000 mL中,再加入碘化鉀3.4 g和三氟甲磺酸銅18 g,在氮氣保護下,保持室溫條件緩慢滴加溶有三氯氧磷19 g的苯溶液200 mL,在氮氣保護下升溫至回流,通過分水器除去反應(yīng)體系中的水,反應(yīng)7.5 h降至室溫,過濾反應(yīng)液,濾液中加入水1 400 mL,然后用二氯甲烷500 mL萃取多次,合并有機相,真空濃縮蒸除有機溶劑后經(jīng)硅膠柱層析分離得到化合物C 41.07 g;LC-MS(ESI): m/z 491[M+H]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ9.25 (s,1H),7.64 (d,J=12.0 Hz,2H),7.57 (s,1H),7.43 (d,J= 6.0 Hz,1H),7.38～7.36 (m,1H),4.35～4.31 (m,4H),3.78～3.75 (m,4H),3.38 (s,3H),3.37 (s,3H)。

1.2.11 目標(biāo)化合物D的合成

在帶有攪拌的反應(yīng)瓶中,把N-(3-乙酮苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧基)-4-喹啉胺41 g加入到N-甲基吡咯烷酮1 000 mL中,室溫攪拌反應(yīng)1 h,然后加入對甲苯磺酰肼20 g和氫氧化鋇17 g和碘25 g,加熱至80 ℃,保持該溫度攪拌反應(yīng)2.5 h,然后加入2-氟-4-溴芐胺20 g和醋酸銅9 g,在氧氣氛圍下,繼續(xù)反應(yīng)2 h,把反應(yīng)體系中加入水2 000 mL,攪拌后過濾,濾液用二氯甲烷500 mL萃取多次,合并有機相后用無水硫酸鎂50 g干燥后濃縮,最后經(jīng)過硅膠柱層析分離得到化合物B 59.27 g;LC-MS(ESI): m/z 623 [M+H]+;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6):δ9.58 (s,1H),8.63 (s,1H),8.26 (s,2H),7.91 (s,1H),7.66～7.37 (m,6H),5.71 (s,2H),4.32～4.30 (m,4H),3.79～3.77 (m,4H),3.39 (s,3H),3.37 (s,3H)。

1.3 IDO1酶抑制活性研究

通過基于Hela細(xì)胞的IDO1酶抑制活性測試方法,對化合物A,B,C,D進行抑制IDO1活性測試,發(fā)現(xiàn)這4個化合物針對IDO1的抑制活性IC50分別為9.63,0.79,1.82和0.93 μmol/L。

1.4 脲酶抑制活性研究

對針對IDO1抑制活性好的化合物B和D進行脲酶活性測試,牛經(jīng)過飼喂1 h后,用特制瘤胃液采集器經(jīng)人工瘤胃瘺管采集瘤胃液400 mL,通過4層紗布過濾后備用。每個培養(yǎng)管按表1 中的量加入相應(yīng)的試劑后,滴加4滴液體石蠟,置(39.0±0.5) ℃恒溫水浴振蕩器上輕搖。分別在培養(yǎng)的8 h,從各組取出部分培養(yǎng)管,立即加入4滴飽和氯化汞溶液并搖勻,以終止反應(yīng)。用凱氏半微量-飽和氧化鎂蒸餾法測定各管氨態(tài)氮含量。

表1 實驗材料配置方法

經(jīng)過8 h的培育后,通過計算公式:抑制率(%)=(對照組氨含量-試驗組氨含量)÷對照組氨含量×100%,可以計算每個化合物三個試驗組的抑制率(表2所示),可以很直觀發(fā)現(xiàn),2個化合物都能夠隨著濃度的增加,對脲酶的抑制效果逐漸增加,都具有針對脲酶的抑制活性。

表2 4種化合物針對脲酶的抑制效果

2 結(jié)論

本文設(shè)計了幾種結(jié)構(gòu)新穎的喹啉類衍生物,通過活性實驗,部分化合物針對IDO1酶具有良好的抑制效果,可以提高機體的免疫能力,同時發(fā)現(xiàn)這些化合物對黃牛胃液中采集的脲酶具有一定的抑制效果,可以作為潛在的飼料添加劑。